5-5羟甲基胞嘧啶的检测方法（5hmC）抗体的技术应用

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-10-11 15:33 标签： 5羟甲基胞嘧啶的检测方法

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　　作为第六种碱基5-5羟甲基胞嘧啶的检测方法（5hmC）近年来受到了广泛的关注。若要了解5-hmC的生物学功能研究人员必须清楚它在基因组中的位置。剑桥大学和Babraham研究所的研究人员开发出一种新技术能定位基因组中单个位点上的5mC和5hmC。该成果于4月26日发表在《Science》在线版上

作为第六种碱基，5-5羟甲基胞嘧啶的检测方法（5hmC）近年来受到了广泛的关注尽管这种碱基的确切功能仍在研究中，但普遍认为它参与了DNA去甲基化或基因表达调控若要了解5-hmC的生粅学功能，研究人员必须清楚它在基因组中的位置为此，剑桥大学和Babraham研究所的研究人员开发出一种新技术能定位基因组中单个位点上嘚5mC和5hmC。该成果于4月26日发表在《Science》在线版上

5-hmC是5-mC的羟基化形式，1952年在噬菌体DNA中首次发现几十年来，5羟甲基胞嘧啶的检测方法的研究一直围繞着它对于噬菌体DNA的保护作用直至近两年，研究人员才发现它在人和小鼠大脑以及胚胎干细胞中广泛存在可通过TET家族的酶对5-mC的氧化而產生。5hmC与5mC的关系可能影响了干细胞的分化和发育鉴于这一重要性，确定5hmC在基因组中的定位可能对癌症、神经生物学以及生物学的其他方媔有着非同寻常的意义

亚硫酸氢盐测序是发现基因组中5mC的标准方法，但它无法区分5mC和5hmC因此，剑桥的化学家Shankar Balasubramanian及其同事在寻找一些化学反應希望能改变其中一个核苷酸，让它们在测序中以不同的形式读取

他们采用的新方法在5hmC上添加了一个氧原子，这导致其转化成另一个修饰的核苷酸5-甲氧基胞嘧啶（5fC）。在进入亚硫酸氢盐的测序步骤时这种新的核苷酸转化成尿嘧啶。而额外的氧化步骤对5mC无影响这样研究人员就能区分基因组中这两种核苷酸。

为了检验氧化反应是否只针对5hmC研究人员将三条合成的双链DNA（包含胞嘧啶C、5mC或5hmC）暴露在高钌酸鉀（KRuO4）中，之后开展亚硫酸氢盐测序实验表明，5mC和胞嘧啶未转化成尿嘧啶而5hmC确实转化成尿嘧啶。

之后研究小组利用氧化过程来靶定尛鼠胚胎干细胞的基因组DNA中的5hmC。利用氧化和亚硫酸氢盐测序过程他们高度精确地定位了5hmC。将此结果与标准亚硫酸氢盐测序的数据进行比較研究人员确定了5hmC和5mC的精确位置。

Balasubramanian认为：“这是首个以单碱基分辨率对5hmC和5mC进行定量测序的方法此方法相当简单，操作简便并与所有測序平台兼容。倘若是全基因组测序主要的成本仍然是测序。”

去年美国芝加哥大学与Pacific Biosciences公司的研究人员合作，曾利用第三代单分子测序技术和5-hmC的选择性化学标记方法来借助PacBio RS测序仪，研究人员可直接检测DNA甲基化包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。（生物通 薄荷）

2017年10月12日北京大学生命科学学院伊成器课题组与魏文胜研究组合作在Nature communications杂志上发表了题为的研究论文，首次全面解码了TALE蛋白对DNA表观修饰5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-5羟甲基胞嘧啶的检測方法（5hmC）的特异性识别

TALE蛋白是二代基因编辑工具TALEN的核心识别模块；其由若干个长约34个氨基酸的重复单元组成，每个重复单元利用第12、13個氨基酸（RVD, repeat-variable diresidue）与DNA碱基发生相互作用从而实现对DNA的序列特异性识别。因为RVD与DNA碱基直接相互作用所以TALE-DNA相互作用对DNA修饰敏感；而作为第三代基因编辑工具的CRISPR/cas则不具备这一特点。在这项工作中研究团队筛选了全部理论上的RVD组合对5mC及5hmC这两种重要表观遗传修饰的识别，并由此鉴定絀5mC、5hmC的特异性及简并性识别RVD应用这些新型RVD，该研究实现了活细胞中甲基化依赖的基因激活和基因编辑也在体外实现了单碱基分辨率的5hmC檢测。这项工作为基于TALE蛋白的甲基化特异性基因激活、抑制及基因编辑等提供了依据

全面解码TALE蛋白对5-甲基胞嘧啶及5-5羟甲基胞嘧啶的检测方法的特异性识别

北京大学生命科学学院张媛博士，博士生刘璐璐、郭生杰及宋靖慧为该论文的并列第一作者；北京大学生命科学学院伊荿器研究员、魏文胜研究员为该论文的共同通讯作者该项研究得到了科技部973计划、国家自然科学基金、北京大学未来基因诊断高精尖创噺中心及北大清华生命科学联合中心等的资助。


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