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综合实践活动检测不同环境中的细菌和真菌活动方案史地生教研组 一、活动背景：细菌和真菌容易导致人类、动物和植物患上不同的疾病,而通常情况下细菌和真菌的个体很小,单个的细菌和真菌用肉眼是看不到的,只有当它们繁殖形成菌落后,才能看到.我们周围的环境中几乎都存在细菌和真菌,但是哪种环境中多一些?哪种环境中少一些?有些物质如沸水、硬币、纸币等上有没有细菌和真菌?人体表面有没有细菌和真菌?如何防止细菌和真菌进入人体引起疾病?二、活动目的：（1）让学生明确不同的环境中细菌和真菌的数量和种类是不同的.（2）养成良好的生活习惯：常洗手.（3）培养学生严谨、认真的科学态度.三、活动时间：四、主要活动内容：（一）知识准备：细菌、真菌菌落的特点细菌：细菌的菌落比较小,表面或光滑粘稠,或粗糙干燥.真菌：真菌的菌落一般比细菌菌落大几倍到几十倍,常呈绒毛状、絮状或蜘蛛网状,有时还能呈现出红、褐、绿、黑、黄等不同的颜色.（二）制作培养基：牛奶琼脂培养基称取15克琼脂,剪成小段,置于烧杯中,加入500毫升水,在电炉上加热煮沸至琼脂完全溶解,再加入500毫升牛奶,搅匀后,分装到4个250毫升的锥形瓶中,用棉塞塞好,冷却.将培养皿洗净晾干后,用牛皮纸包好,和培养基一起放到高压灭菌锅中,121℃灭菌30min,取出,冷却.（三）采集细菌和真菌（接种）：学生分小组制定实验计划,并做好分工.在标签纸上标出组别、实验日期、编号、采集地点,并将标签纸贴在培养皿的底面.将灭过菌的锥形瓶中的培养基加热至溶化后,分别倒到已灭过菌的培养皿中.注意：（1）没倒之前,不准随意打开培养皿；（2）倒的速度要快,倒完后锥形瓶立即塞上棉塞,培养皿立即盖上盖子；（3）倒的量不能太多,否则影响培养基的冷却；也不能太少,否则影响细菌和真菌的生长；以能均匀的铺在培养皿底面为准.待培养基冷却后,到预先选择好的地点或物体上采集细菌和真菌.一组：采集地点——土壤方法：用无菌棉棒蘸取土壤,在培养基上轻轻涂抹.二组：采集地点——口腔内部方法：用无菌棉棒擦取口腔内部,在培养基轻轻涂抹.三组：采集地点——手方法：用无菌棉棒擦取手心,在培养基上轻轻涂抹.四组：采集地点——钱币方法：将硬币放在细菌培养基上轻轻一按五组：采集地点——沸水方法：将无菌棉棒蘸取沸水,在培养基上轻轻涂抹.六组：采集地点——生物实验室方法：在生物实验室内打开培养皿盖子,让培养基暴露5分钟,盖上盖子.七组：采集地点——憩园草坪上方法：将培养皿放在草坪上,打开盖子5分钟,盖上盖子.………………（四）培养细菌和真菌：将接种好的培养基分成两组,一组放到恒温培养箱中培养,温度控制在25℃左右,一组放在生物实验室（生物实验室温度较底,没有阳光进入）讲台上,学生设置好观察计划、表格后,定时观察,并做好记录.92一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法
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92一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法
第１４卷第２期；２０１０年４月Ｌｉｆｅ；生命科学研究；ＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｖ０１．１４Ｎｏ．２；Ａｐｒ．２０１０；一种经济快速提取丝状真菌基因组ＤＮＡ的方法；陈锋菊，李百元，杨；冰，张叶纯；（湖南科技大学生命科学学院，中国湖南湘潭４１１２；摘要：以螺旋木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ；ｓｐｉｒａｌｅ；ＸＸ）、小克银汉霉（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ；
第１４卷第２期２０１０年４月Ｌｉｆｅ生命科学研究ＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＶ０１．１４Ｎｏ．２Ａｐｒ．２０１０一种经济快速提取丝状真菌基因组ＤＮＡ的方法陈锋菊，李百元，杨冰，张叶纯（湖南科技大学生命科学学院，中国湖南湘潭４１１２０１）摘要：以螺旋木霉（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｓｐｉｒａｌｅＸＸ）、小克银汉霉（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｐｈａｅｏｓｐｏｒａＭＫ）和卵形孢球托霉（Ｇｏｎｇｒｏｎｅｌｌａｂｕｔ／ｅｒ／ＸＴ）３种丝状真菌为材料。采用改进的ＣＴＡＢ法提取基因组ＤＮＡ．方法改进后无需液氮、聚乙烯砒略烷酮（ＰＶＰ）和ＮａＡｃ等试剂，过程简洁，且所需茵体量少，提取的ＤＮＡ纯度较好，适用于一次微量提取多个样品的基因组ＤＮＡ．此方法得到的基因组ＤＮＡ可用于ＰｃＲ扩增．关键词：丝状真菌；基因组ＤＮＡ；ＣＴＡＢ法；ＰＣＲ中图分类号：Ｑ９３６文献标识码：Ａ文章编号：１００７．７８４７（２０１０）０２－０１２２－０３ＡｎＥｃｏｎｏｍｉｃａｌａｎｄＲａｐｉｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｆｏｒＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍＦｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉＣＨＥＮＦｅｎｇ－ｊｕ，ＬＩＤＮＡｏｆｔｈｅＢａｉ―ｙｕａｎ，ＹＡＮＧＢｉｎｇ，ＺＨＡＮＧＹｅ－ｃｈｕｎ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬ咖Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌ－ｌｕｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉａｎｇｔａｎ４１１２０１，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＧｅｎｏｍｉｃｐｈａｅｏｓｐｏｒａＭＫａｎｄｔｈｒｅｅｂｕｔｌｅｒｉｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＸＴｗｅｒｅｆｕｎｇｉＺ托ｂｄｅ册ａｗｉｔｈａｓｐｉｒａｌｅＸＸ，ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａＡｍｍｏｎｉｕｍＧｏｎｇｒｏｎｅｌｌａｅｘｔｒａｃｔｅｄｍｏｄｉｆｉｅｄＣｅｔｙｈｒｉｍｅｔｈｙｌＢｒｏｍｉｄｅ（ＣＴＡＢ）ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｉｍｐｒｏｕｅｄｍｅｔｈｏｄｄｏｅｓｎｏｔｒｅｑｕｉｒｅｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＶＰａｎｄＮａＡｃｅｔｃ．Ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｗａｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ。ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｈｉｇｈｅｒｐｕｒｉｔｙｏｆｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡＷｔｔ￥ｏｂｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｌｅｓｓａｍｏｕｎｔｏｆｍｙｃｅｌｉｕｍｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｗｈｉｃｈｗａｓｓｕｉｔａｂｌｅｔｏｔｒｅａｔｍａｎｙｓａｍｐｌｅｓａｔａｓｏｎｅｔｉｍｅ。ａｎｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｕｒｂａｓｉｃｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｕｃｈＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓＰＣＲ．ｆｕｎｇｉ；ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ；ＣＴＡＢｍｅｔｈｏｄ；ＰＣＲ（￡施ＳｃｉｅｎｅｅＲｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，１４（２）：１２２―１２４）通常真菌的传统分类鉴定依据主要采用形态学和生理学方面的特征，但这些方法很易受到培养条件的影响，如有名的生防真菌一木霉在土豆葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）和玉米葡萄糖琼脂培养基（ＣＭＤ）上培养时，其培养特征差异非常显著。而真菌的现代分类鉴定则是结合形态学、生理学以及ＤＮＡ分子水平等多方面进行综合鉴定．ＤＮＡ提取是分子水平鉴定的第一步．有关丝状真菌基因组ＤＮＡ提取的方法有很多ｃ１剖，但过程大多较繁琐，周期长或需加入某些特殊试剂．基收稿日期：２００９一ｌＯ．３０；修回１５１期：２０１０－０１．２１基金项目：湖南省教育厅基金资助项目（Ｂ３０９３９）于经济、快速、高效原则，本研究探索了一种在一般实验室里切实可行的丝状真菌ＤＮＡ的提取方法．１材料与方法１．１菌株螺旋木霉（Ｔｒ／ｃｈｏｄｅｒｍａ印ｉｒａ＆ＸＸ）、小克银汉霉（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａｐｈａｅｏｓｐｏｒａＭＫ）和卵形孢球托霉（ＧｏｎｇｒｏｎｅｌｌａｂｕｔｌｅｒｉＸＴ）３种丝状真菌均从土壤中筛选得到，现保存于本实验室．作者简介：陈锋菊（１９７３－），女，湖南桑植人，湖南科技大学讲师，硕士．主要从事生物化学与分子生物学研究，Ｅ－ｍａｉｈｃｈｅｎｆｅｎｇｊｕ５２６＠１６３．ｃｏｍ．万方数据第２期陈锋菊等：一种经济快速提取丝状真菌基因组ＤＮＡ的方法１．２试剂ＤＮＡＴａｑ酶、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２００和ＡＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢ购自天根生化（北京）科技有限公司，引物由上海生工合成．其它试剂均为国产分析纯．１．３菌体培养与收集将已分离纯化的３种丝状真菌分别接种于装有４０ｍＬＣＭＤ液体培养基（玉米粉２０ｇ，葡萄糖２０ｇ，蒸馏水１０００ｍＬ）的１００ｍＬ的三角瓶中，置于２６―２８℃下摇瓶培养１～２ｄ后，１００００ｒ／ｒａｉｎ离心５ｍｉｎ收集菌体，用多层灭菌滤纸将菌体充分吸干．１．４基因组ＤＮＡ的提取１）取出事先冷冻的研钵，放置在冰块上，取适量吸干的新鲜菌丝体，加适量的２×ＣＴＡＢ提取液（含０．７％ＮａＣＩ，１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣＩｐＨ８．０，２０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，２０ｇ／ＬＣＴＡＢ），２－５斗Ｌ肛巯基乙醇和适量的灭菌普通细砂，在研钵中迅速将菌体充分研磨；２）研磨后迅速将菌液移入１５ｍＬ的Ｅｐｐｅｎｄ－ｏｆｆ管中，于６５℃下水浴３０ｍｉｎ，水浴过程中颠倒２～３次；３）菌液摇匀后加等体积的氯仿：异戊醇混合液（２４：ｌ，Ｖ／Ｖ）充分混匀，４℃下１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；４）将上清夜移至另一新的Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ管中，加２．５倍体积的冰冻无水乙醇，轻轻摇匀，等沉淀出现后，４ｏＣ下８０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ；５）弃上清夜，沉淀用７０％的酒精洗涤两次，在电烤炉的上方２０ｃｍ左右（以不烫手为准）烘干，加５０～１００ｔｒＬ的１Ｅ缓冲液（含１０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ，ｌｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）充分溶解（如果溶解较慢可置于３７℃水浴器中促溶）；６）加入５斗Ｌ浓度为１０ｇ／Ｌ的ＲＮＡ酶，于６５℃消化４０ｍｉｎ；７）重复步骤３～５，所提ＤＮＡ溶液于一２０℃下保存备用．１．５ＤＮＡ质量的紫外检测按照文献【７】的方法进行ＤＮＡ浓度和纯度的检测．１．６ＩＴＳ和１８ＳｒＤＮＡ序列的ＰＣＲ扩增ＩＴＳ序列的ＰＣＲ扩增采用通用引物Ｌ９］：ＩＴＳｌ（５’．ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３’）和ＩＴｓ４（５’．ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ．３’）．反应总体系５０斗Ｌ，包括１０×ＰＣＲ缓冲液５ｔｒＬ，Ｍ矛＋（２５万方数据ｍｍｏｌ／Ｌ）３¨Ｌ，ｄＮＴＰ混合物（１０ｒｅｔｏｏｌ／Ｌ）１斗Ｌ，ＩＴＳｌ和ＩＴＳ４（浓度均为２５Ｉ上ｍｏｌ／Ｌ）各１¨Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．４ｐＬ（５Ｕ／¨Ｌ），模板２ｐＬ，无菌水加至５０¨Ｌ．ＰＣＲ反应程序为９４℃５ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃４０ｓ，３０个循环后再７２℃延伸８ｒａｉｎ．ＰＣＲ产物电泳染色后，用凝胶成像系统拍照．１８ＳｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增采用通用引物对【ｍ］：ＮＳＩ（５’．ＧＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣｌＴ】陋ＴＣＴＣ一３７）和ＮＳ８（５’－ＴＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＡＣＣＴＡＣＧＧＡ．３’）．反应总体系５０ｐＬ，包括１０×ＰＣＲ缓冲液５ＩｘＬ，Ｍ矛＋（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）３ｐＬＬ，ｄＮＴＰ混合物（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）１斗Ｌ，ＮＳＩ和ＮＳ８（浓度均为２５Ｉ山ｍｏｌ／Ｌ）各ｌ斗Ｌ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．４斗Ｌ（５Ｕ，斗Ｌ），模板２斗Ｌ，无菌水加至５０此．ＰＣＲ反应程序为９４℃３ｍｉｎ，９４℃５０ｓ，５２℃ｌｍｉｎ，７２ｏＣ５０ｓ，３０个循环后再７２℃延伸８ｍｉｎ．ＰＣＲ产物电泳染色后，用凝胶成像系统拍照．２结果２．１基因组ＤＮＡ的完整性取上述方法提取的基因组ＤＮＡ５ＩｘＬ进行１．５％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果显示该方法提取的基因组完整性较好，主条带明显，初步表明本改良方法提取ＤＮＡ是可行的（图１）．图ｌ提取真菌的基因组ＤＮＡ电泳图谱Ｍ、ｌ、２、３和Ｃ分别代表ＡＤＮＡ／ＨｉｎｄｌｌＩＭａｒｋｅｒ、螺旋木霉ＸＸ、小克银汉霉ＭＫ、卵形孢球托霉ＸＴ和空白对照．Ｆｉｇ．１ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆｔｈｒｅｅｓｔｒａｉｎｓｏｆＦｕｎｇｕｓＭ。１．２．３ａｎｄＣｄｅｎｏｔｅＡＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ，Ｔ．ＳｐｉｒａｌｅＸＸ，Ｃ．ｐｈａｅｏｓｏｏｒａＭＫ。Ｇ．ｂｕｔｌｅｆｉＸＴａｎｄｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｒｅｓｐｅｃ―ｔｉｖｅｌｙ．２．２ＤＮＡ的紫外检测结果利用紫外分光光度计测定本方法提取的ＤＮＡ的浓度可达到４６０－６７０ｍｇ／Ｌ，比传统方法１２４生命科学研究２０ｌＯ年（仅为３２５―３９０ｍｇ／Ｌ）要高得多，但比张颖慧等盯】报道的要稍低；改进后获得的ＤＮＡ，ＵＶ检测结果显示，其ＤＤ瑚／ＯＤ挪比值范围在１．８―２．０之间．说明用本方法提取所得基因组ＤＮＡ的得率较高，纯度较好．２．３ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增结果利用真菌ＩＴＳ和１８ＳｒＤＮＡ序列的通用引物对本改良方法提取的３种真菌的基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测，结果见图２．由图可知，３种丝状真菌的ＩＴＳ序列大小约０．６ｋｂ左右（图２左），１８ＳｒＤＮＡ序列大小约１．７ｋｂ左右（图２右），条带单一、清晰整齐，ＰＣＲ结果良好．说明该方法提取的基因组ＤＮＡ适合用于ＰＣＲ检测，可用于一般的分子生物学研究．图２基因组ＤＮＡＰＣＲ电泳圈左：ＩＴＳ；右：１８ＳＲｄｎａ；Ｍ、ｌ、２、３和Ｃ分别表示ＤＮＡＭａｒｋｅｒ２００、ＸＴ、ＭＫ、ＸＸ和空白对照．Ｆｉｇ．２ＰＣＲａｍｐｌｍｃａｔｉｏｎｏｆＩＴＳ（１ｅｆｔ）ａｎｄ１８ＳｒＤＮＡ（ｒｉｇｈｔ）ｓｅｑｕｅｎｃｅｓＭ，ｌ，２，３ａｎｄＣｄｅｎｏｔｅＤＮＡＭａｒｋｅｒ２００，ＸＴ。ＭＫ，ＸＸａｎｄｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．３讨论基因组ＤＮＡ的提取技术是真菌分子鉴定及其相关分子生物学研究中一项最基本的操作技术，所提取的基因组ＤＮＡ质量的好坏会直接影响后续的实验操作，如ＰＣＲ、酶切和杂交等．目前，已报道的真菌ＤＮＡ的提取技术主要采用ＳＤＳ、ＣＴＡＢ或其改良法‘ｌｌ，１２］．其区别主要在于破壁方法以及破壁后分离核酸、蛋白质方面的不同，但均包括真菌细胞肇的裂解，真菌细胞膜的破坏，达到ＤＮＡ的释放以及真菌的纯化步骤．传统的破壁包括机械破壁、超声波破壁、玻璃珠万方数据破壁等．核酸分离包括经典的酚、氯仿抽提。以及商品化的纯化柱、纯化膜分离法等．经典的酚、氯仿抽提法涉及到毒性较大的苯酚，而商品化的试剂盒虽然操作简单、高效，ＤＮＡ质量较高，但价格昂贵，不太适用于经费较低的一般实验室．本研究中ＤＮＡ提取法的优点主要是经济、简单，不需特殊的仪器和药品．表现在：不需液氮；研磨砂采用筛选的普通砂粒；提取过程中无需苯酚、ＰＶＰ和ＮａＡｃ等．需要注意的事项有：１）研钵需进行低温预处理，研磨时研钵必须置于冰块上，时间最好严格控制在２ｍｉｎ内，以尽可能地降低ＤＮＡ的降解；２）研磨加入的ＣＴＡＢ的量随菌丝量的变化而变化．一般表征是研磨后的匀浆液不宜太粘稠，以防止加入氯仿／异戊醇抽提时难以分散；３）有时，缓冲液中不加ＰＶＰ，可能会导致最终ＤＮＡ产物比较难溶于ＴＥ缓冲液，但这并不影响后续过程，只需吸取溶解的ＤＮＡ溶液放入新的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，不会影响ＤＮＡ质量，但会影响产量；４）若加入无水乙醇后沉淀不明显，可将此Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管于一２０℃下放置２０ｍｉｎ促进沉淀；５）采用电烤炉烘干时，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管口不宜离火太近，一般在２０ｃｍ左右即可，其最终表征是以闻到乙醇气味为准；６）选用的砂粒需过筛使颗粒大小均匀适中，以便研磨均匀．事实上，运用该方法，本研究室还相继从木霉、毛壳菌、青霉菌和红曲霉中克隆到了蛋白质延伸因子ＥＦｌ和几丁质酶基因，进一步表明该方法是切实可行的．致谢：本研究中的小克银汉霉和卵形孢球托霉的鉴定由中科院微生物所的郑儒永院士完成．在此表示衷心地感谢！参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：【ｌ】ＪＡＭＥＳＡ，ＨＩＧＧＩＮＳＭＣ，ＪＥＮＫＩＮＳＤＲ，ｅｔ吐ＲａｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｆｒｏｍＢｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｐａｒｖｕｍｆｏｒｒｉｓｅｉｎＰＣＲ［Ｊ］．ＡｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏ－ｂｉｏｌｏｇｙ，２００ｌ。６７（１１）：５３２１―５３２４．ｆ２１ＧＲＩＦＦＩＮＤＷ，ＫＥＬＬｏＧＧＣＡ，ＰＥＡＫＫＫ，ｅｔａ１．ＡｒａｐｉｄａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｓｈｙｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇＤＮＡｆｒｏｍｆｕｎｇｉ［Ｊ］．ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００２，３４（３）：２１０―２１３．【３１ＴＥＮＤＵＬＫＡＲＳＲ，ＧＵＰＴＡＡ，ＣＨＡｌｌＫ）（）ＢＢ．ＡｓｉｍｐｌｅｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇａｌＤＮＡ［ＪＩ．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，２００３．２５：１９４１．１９４４．Ｉｔ］ＦＡＧＧＩＥ，ＰＩＮＩＧ，ＣＡＭＰＩＳＩＥ．ＵｓｅｏｆｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓｔＯｅｘｔｒａｃｔｆｕｎｇａｌＤＮＡ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｅｓ，２００５，４８（１）：３－７．（下转第１４９页）第２期胡灵玉等：子宫平滑肌细胞Ｓ膨２２一ａ基因的ｐＥＧＦＰ―Ｃ３载体构建及：ｓｉＲＮＡ筛选１４９作用，平滑肌肌动蛋白ＳＭＡ，ＳＭ２２哦是平滑肌细胞的标志蛋白，是调节分娩进程起决定作用的蛋白，而ＳＭ２２电在子宫平滑肌的具体作用机制不明．而人体子宫平滑肌细胞需原代培养，不能无限分裂，子宫平滑肌组织取材受伦理学限制，细胞来源不易；另一方面，原代细胞无论小干扰、过表达转染都困难，采用ＦＴ２９３细胞进行质粒合成和筛查ｓｉＲＮＡ是进一步的实验基础．实验证明我们合成的ｐＥＧＦＰ－Ｃ３．ＳＭ２２．Ｏｌ载体和筛查的ｓｉＲＮＡ有效片段：５＇－３’ＳＭ２２―２５２：ＣＣＡＵＧＧＵＣＵＵＣＡＡＧＣＡＧＡＵＴＴＡＵＣＵＧＣＵＵＧＡＡＧＡＣＣＡＵＧＧＡＧ：５＇－３’ＳＭ２２―４４４：ＣＣＡＡＣＵＧＧＵＵＵＡＵＧＡＡＧＡＡＴｒＩＩＩＪＣＩＩＩＪＣＡＩＩＡＡＡＣＣＡＧＩＪＩ７ＧＧＧＡ．ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ为研究ＳＭ２２．０ｃ在子宫平滑肌中的作用打下坚实基础．参考文献（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）：【ｌ】张卫社，粱清华，谢庆生，等．应用ｃＤＮＡ微阵列筛选子宫平滑肌细胞收缩相关药物靶点ｆＪ】．中南大学学报（医学版）（ＺＨＡＮＧＷｅｉ－ｓｈｅ．ＬＩＡＮＧＱｉｎｇ－ｈｕａ，ＸＩＥＱｉｎｇ―ｓｈｅｎｇ，ｅｔ以Ｓｃａｎｎｉｎｇｏｆｄｒｕｇｆｒｏｍｔｈｅｕｔｅｒｉｎｅｔａｒｇｅｔｓａｎｄｔｈｅｄｅｔｅｃｔｅｄｏｆｔｒａｎｓｇｅｌｉｎｐｒｏｔｅｉｎ［Ｊ］．ＡｃｔｓＬａｇｅｒＢｉｏｌｏｇｙＳｉｎｉｃａ）。２００９，１８（３）：３３４．３３６．ＳＵＺＵｌＩＴ，ＮＡＧＡＩＲ，ＹＡＺＡｌＩＹ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｉｍｓｏｆｔｒａｎｓ．『３１ｅｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｉｌｓ【Ｊ１．ＯｒｃＲｅｓ，１９９８，８２（１２）：１２３８一１２４２．【４１ＭＯＲＧＡＮｒｅｇｕｌａｔｉｏｎＫｂｙＧ，ｔｈｉｎＧＡＮＧＯＰＡＤＨＹＡＹｆｉｌａｍｅｎｔ―ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＳＳ．Ｃｒｏｓｓ―ｂｒｉｄｇｅｐｒｏｔｅｉｎｓ［Ｊ］．ＪＡｐｐｌｍｕｓｃ｜ｅ－ＰｈｙｓｉｏＩ．２００１．９１：９５３．９６２．ｒｅｌａｔｅｄｂｙｔｏｕｔｅｒｕｓｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ【５】ＺＨＯＵｓｐｅｃｉｆｉｃＪＬ，ＨＵＧｇｅｎｅｓａｒｅＱ。ＨＥＲＲＩＮＧＢＰ．Ｓｍｏｏｔｈｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ【Ｊ】．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄＳｏｉ））。２００７，３２（４）：５７９―５８３．【２】胡灵乇．周昌菊，谷永红，等．人妊娠子宫平滑肌细胞的原代培养方法研究及ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ蛋白的检测Ⅲ．激光生物学报（ＨＵＬｉｎｇ－ｙｕ，ＺＨＯＵＣｈａｎｇ－ｊｕ，ＧＵＹｏｎｇ―ｈｏｎｇ，ｅｔ０１．ＴｈｅｐｒｉｍａｒｙｕｔｅｒｉｎｅｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｓｃＤＮＡｄｉｆｆｒｅｎｔｉａｌｌｙｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｂｙＥｌｋ．１【Ｊ１．Ｍｏｌ【６】ＣｅｌｌＢｉｏｌ，２００５，２５：９８７４－９８８５．乐杰，谢幸，丰有吉，等．妇产科学（第六版）ｆＭ】．北京：人民卫生出版社（ＬＥＪｉｅ．ＸＩＥＸｉｎ，ＦＥＮＧＹｏｕ－ｊｉ，ｅｔａ１．ＯｂｓｔｅｔｒｉｃｓａｎｄＧｙｎｅｃｏｌｏｇｙ（ＳｉｘｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）【Ｍ】．Ｂｅｉｊｉｎｇ：‘Ｐｅｏｐｌｅ’ＳＭｅｄｉｃａｌＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＨｏｕｓｅ）．２００４．ｏｆｈｕｍａｎｕｔｅｒｉｎｅｐｒｅｇｎａｎｃｙｓｍｏｏｔｈ（上接第１２４页ｊ【５】【９】ＷＨＩＴＥＴＪ．ＢＲＵＮＳＴ，ＬＥＥＳ，ｅｔａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｈｙｉｏ－ｇｅｎｅｔｉｃ刘少华．陆金萍：朱瑞良，等．’一种快速简便的植物病原真菌基因组ＤＮＡ提取方法【Ｊ】．植物病理学报（ＵｕＳｈａｏ－ｈｕａ，ＬＵＪｉｎ―ｐｉｎｇ。ＺＨＵＲｕｉ―ｌｉａｎｇ，ｅｔａ１．ＡｒａｐｉｄａｎｄｓｉｍｐｌｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｙａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｄｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇＤｏｆｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡｇｅｎｅｓ［Ｃ】／ＩＩＮＮＥＳＭＡ，ＧＥＬＦＡＮＤｔｏＨ，ＳＮＩＮＳＫＹＪＪ，“Ⅱｆ．ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅＭｅｔｈｏｄｓａｎｄｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ『１０１Ｇｕｉ。ｍｉｎ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ．１９９０．３１５―３２２．ＡＮＤＥＲＳＯＮＬＣ。ＣＡＭＰＢＥＬＬＣＤ，ＰＲＯＳＳＥＲＪＩ．ＰｏｔｅｎｔｉａｌＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ），２００５，３５（４）：３６２―３６５．【６】张桂敏。唐文杰，班静．等．硅胶破碎法抽提真菌染色体ＤＮＡ［Ｊ］．湖北大学学报（自然科学版）（ＺＨＡＮＧＴＡＮＧｆＩｌｎｇａｌ１８ＳｒＤＮＡａｎｄｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎｐｒｉｍｅｎｆｏｒｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｂｉａｓｏｆｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙｉｎｓｐａｃｅｒｆｕｎｇａｌＷｅｎ－ｊｉｅ．ＢＡＮｏｆＪｉｎｇ．ｅｔａ１．ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｏｆＨｕｂｅｉｓｏｉｌｌＪ］．ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，５ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｕｎ＃ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌＳｃｉｅｎｃｅ）．２００６，２８（１）：６９－７１．（１）：３６－４７．【１ｌＪ吴发红，黄东益，黄小龙，等．几种真菌ＤＮＡ提取方法的比较【Ｊ】．中国农学通报（ＷＵＦａ―ｈｏｎｇ，ＨＵＡＮＧＤｏｎｇ―ｙｉ，ＨＵＡＮＧＸｉａｏ－ｌｏｎｇ，ｅｔａ１．ＣｏｍｐａｒｉｎｇｆｒｏｍｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃｓｔｕｄｙｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ【７】张颖慧，魏东盛，邢来君，等．一种改进的丝状真菌ＤＮＡ提取方法【Ｊ】．微生物学通报（ＺＨＡＮＧＹｉｎｇ－ｈｕｉ，ＷＥＩＤｏｎｇ－ｓｈｅｎｇ，ＸＩＮＧｉＪａｊ－ｊｕ．，ｅｔａ１．ＡｍｏｄｉｆｉｅｄｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｎｇＤＮＡｆｒｏｍ４６６－．４６９．ｓｅｖｅｒａｌｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒＤＮＡｆｕｎｇｕｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。２００８，３５（３）：ｆｕｎｇｉ咖．ＣｈｉｎｅｓｅＳｃｉｅｎｃｅＢｕｌｌｅｔｉｎ）．２００９．２５（８）：６２―６４．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．．ｆ１２｝周礼２【．一种制备富含多糖丝状真菌基因组ＤＮＡ的方法ｆＪｌ．湖北农业科学（ＺＨＯＵＬｉ―ｈｏｎｇ．Ａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｇｅｎｏｍｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ【８】孙立夫，张艳华，裴克全．一种高效提取真菌总ＤＮＡ的方法ｌＪ】．菌物学报（ＳＵＮＡｒａｐｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＬｉ－ｆｕ，ＺＨＡＮＧＹａｎ－ｈｕａ，ＰＥＩＫｅ－ｑｕａｎ．ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｆｒｏｍｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｉｗｉｔｈａｂｕｎｄａｎｔｐｏｌｙｓａｃ?ｏｆＤＮＡｆｒｏｍｆｕｎｇｉＬ玎．Ｍｙｃｏｓｙｓ－ｃｈａｒｏｓｅ［Ｊ］．ＨｕｂｅｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ．２００８，４７（４）：３７９?３８１．ｔｅｍａ）．２００９。２８（２）：２９９．３０２．万方数据一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：陈锋菊， 李百元， 杨冰， 张叶纯， CHEN Feng-ju， LI Bai-yuan， YANG Bing，ZHANG Ye-chun湖南科技大学生命科学学院,中国湖南,湘潭,411201生命科学研究LIFE SCIENCE RESEARCH)0次 参考文献(12条) 1.WHITE T J;BRUNS T;LEE S Analysis of phyiogenetic relationships by amplification and directsequencing of ribosomal RNA genes 19902.孙立夫;张艳华;裴克全 一种高效提取真菌总DNA的方法[期刊论文]-菌物学报 .张颖慧;魏东盛;邢来君 一种改进的丝状真菌DNA提取方法[期刊论文]-微生物学通报 .张桂敏;唐文杰;班静 硅胶破碎法抽提真菌染色体DNA[期刊论文]-湖北大学学报(自然科学版) .刘少华;陆金萍;朱瑞良 一种快速简便的植物病原真菌基因组DNA提取方法[期刊论文]-植物病理学报 .FAGGI E;PINI G;CAMPISI E Use of magnetic beads to extract fungaI DNA 2005(01)7.TENDULKAR S R;GUPTA A;CHATrOO B B A simple protocol for isolation of fungal DNA .GRIFFIN D W;KELLOGG C A;PEAK K K A rapid and efficient assay for extracting DNA from fungi2002(03)9.周礼红 一种制备富含多糖丝状真菌基因组DNA的方法[期刊论文]-湖北农业科学 .吴发红;黄东益;黄小龙 几种真菌DNA提取方法的比较[期刊论文]-中国农学通报 2009(08)11.ANDERSON L C;CAMPBELL C D;PROSSER J I Potential bias of fungal 18S rDNA and internal transcribedspacer polymeraso chain reaction primers for estimating fungal biodiversity in soil .JAMES A;HIGGINS M C;JENKINS D R Rapid extraction of DNA from Escherichia coli and cryptosporidiumparvum for use in PCR 2001(11) 相似文献(10条)1.学位论文 牛莉娜 两株丝状真菌N3、N9的分类鉴定 2006本实验室从一酸奶样品中分离到两株丝状真菌N3、N9。通过形态学观察、RAPD分析及5.8SrDNA及ITS区序列测定并结合出菇试验，初步确定了N3、N9菌株的分类地位以及它们与其近缘种的生物系统学关系。1分别观察了N3、N9菌株在PDA培养基上的菌落特征和菌丝体形态特征。结果表明：N3、N9菌株在PDA培养基上25℃培养7d后菌落生长旺盛，呈丝状辐射生长，表面呈绒絮状，圆形，平坦。菌丝浓密，粗壮，多气生菌丝，菌丝体上具有明显的锁状联合结构，故初步判定N3、N9菌株为担子菌。2比较了CTAB、SDS-CTAB和氯化苄这3种DNA提取方法提取8株担子菌DNA的效果。结果表明：CTAB法和SDS-CTAB法只适合于部分菌株的DNA提取，对另外一些菌株则提取不出谱带清晰的DNA而氯化苄法适合于所有供试菌株的DNA提取，所有菌株的DNA凝胶电泳图谱带清晰，效果很好。同时研究比较了液氮研磨和提取液的pH值对氯化苄法提取DNA效果的影响。3运用RAPD技术对N3、N9菌株和6株担子菌标准菌株进行了比较。首先从40个10bp引物中筛选出18个有效引物，用于所有供试材料基因组DNA样品的扩增。这18个引物对8株供试菌株均能扩增出清晰的谱带。对RAPD结果进行聚类分析，构建了供试菌株基因型的亲缘关系图。从聚类图上可以看出，菌株N3、N9与糙皮侧耳(Pleurotusostreatus)白平菇、糙皮侧耳澳黑平菇、姬菇(P.limpidus)河北33、毛头鬼伞(Coprinuscomatus)聚为一类，而香菇(Lentinusedodes)、金针菇(Flammulinavelutipes)聚为另一类。其中菌株N3、N9与白平菇的亲缘关系最近，与澳黑平菇、河北33的亲缘关系稍近一些，故可初步确定N3、N9菌株应属于侧耳属。4再次运用RAPD技术对N3、N9菌株和侧耳属7株菌株进行了聚类分析。以扩增条带清晰、多态性丰富和重现性好为原则，从40个10bp引物中筛选出了21个有效引物，用于所有供试材料基因组DNA样品的扩增。聚类结果表明：菌株N3、N9与白平菇相似程度最高，三者最先合并，之后与澳黑平菇、河北33、姬菇黑平1号归为一类，而鲍鱼菇(P.abalonus)、金顶侧耳(P.citrinopileatus)、阿魏侧耳(P.ferulae)归为另一类。故可在第一次聚类的基础上进一步确定N3、N9应属于侧耳属，且与白平菇的亲缘关系较近。5对N3、N9菌株的5.8SrDNA及ITS序列进行PCR扩增和序列测定，并将这两株菌株与Genbank中登录的糙皮侧耳、哥伦比亚侧耳(P.columbinus)、灰白侧耳(P.spodoleucus)等共18株菌株的5.8SrDNA及ITS序列进行聚类分析。系统聚类树结果表明：菌株N3、N9在聚类树上被聚在以糙皮侧耳为代表的分支中，其中N3与灰白侧耳的ITS1-5.8S-ITS2基因序列同源性最高，其Bootstrap支持率为100％，二者很可能是同一个种；N9与佛罗里达侧耳(P.floridanus)的ITS1-5.8S-ITS2基因序列同源性最高，其Bootstrap支持率为99％，也显示出十分密切的遗传亲缘关系，提示N9可能属于佛罗里达侧耳。6对N3、N9菌株进行了出菇试验。出菇试验表明：N3、N9菌株均具有结实能力，其桑椹期的形状和子实体的形态结构与侧耳属的子实体相同。2.学位论文 于寒颖 Dactylellina cionopaga捕食线虫相关基因的研究 2008包含各类专业文献、生活休闲娱乐、高等教育、中学教育、外语学习资料、幼儿教育、小学教育、92一种经济快速提取丝状真菌基因组DNA的方法等内容。　
　丝状真菌基因组DNA提取_生物学_自然科学_专业资料。Overview Genomic DNA prep from filamentous fungi like Neurospora. Note: this is incomplete, some verOverview... 　(5) 、12 000rpm 离心 10min 回收基因组 DNA 沉淀,吹干后加入适量的灭菌 d...一种用于PCR扩增的丝状真... 4页 免费 细菌、真菌DNA提取方法的... 2页 免... 　归纳基因组 DNA提取的各个环节.同时对DNA提取过程中...水乙醇快速提取DNA 一般经典酒精标本DNA提取方法都会...操作时间长 Ⅱ.盐析法:操作经济,成本低但操作的... 　各种DNA提取方法 提取方法 各种 一,基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因...(pH5.2) 十一,真菌DNA提取总结的两种方法: 第一种方法: 试验步骤: 1、取... 　土壤宏基因组DNA提取方法(大量提取)_生物学_自然科学_专业资料。土壤细菌和真菌的总DNA提取方法土壤DNA 提取方法(大量提取) : 1. 取 50g 土壤样本, 加 200ml ... 　基因组DNA的提取及实验方法_其它考试_资格考试/认证_教育专区。一:基因组 DNA ...动作迅速并始终 保持 4℃下混匀;转移至 1.5ml 离心管中,4℃ 15000rpm 低温... 　基因组DNA提取方法_生物学_自然科学_专业资料。1 快速微量提取法 A.取 1.5ml 菌体培养物于一灭菌 Ep 管中, 12000rpm 离心 1min, 丢去 上清夜,收集菌体。... 　微生物DNA提取方法_生物学_自然科学_专业资料。细菌基因组 DNA 的提取方法综述 1 快速微量提取法 A.取 1.5ml 菌体培养物于一灭菌 Ep 管中,12000rpm 离心 1... 　实验三 1 微波炉法提取丝状真菌DNA_理学_高等教育_教育专区。经典的生物学提取少量真菌DNA方法实验三 微波炉法提取丝状真菌 DNA 一、 实验材料及试剂、培养基 1、...