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氮循环中的微生物
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你可能喜欢转基因大豆对土壤氮循环相关微生物多样性的影响--《内蒙古师范大学》2013年硕士论文
转基因大豆对土壤氮循环相关微生物多样性的影响
【摘要】：本研究采用大田试验，通过Biolog和PCR-DGGE技术，比较分析了种植转基因大豆PAT与其非转基因亲本PAT1、转基因大豆ALS与其非转基因亲本ALS1及当地主栽大豆中黄13对根际土壤主要理化指标、土壤酶活性(脲酶和过氧化氢酶)和土壤微生物群落功能多样性，以及土壤氮循环相关的微生物群落(固氮菌、氨氧化细菌和反硝化细菌)遗传多样性的影响。以期揭示转基因大豆的种植对土壤氮循环相关微生物多样性的影响。主要研究结果如下：
1.对土壤理化及酶活性的研究发现：转基因大豆PAT和转基因大豆ALS土壤速效磷含量和全磷含量与相应亲本相比均显著降低(p0.05)。转基因大豆PAT和转基因大豆ALS的种植与其相对应的亲本PAT1和ALS1相比全氮、硝态氮、铵态氮含量以及脲酶活性均差异不显著(p0.05)，但转基因大豆PAT和转基因大豆ALS之间全氮、硝态氮含量和脲酶活性出现显著差异(p0.05)。土壤有机质含量、pH值和过氧化氢酶活性在各处理间差异均不显著(p0.05)。
2. Biolog试验结果表明，在整个温育过程中，转基因大豆PAT和转基因大豆ALS土壤微生物活性均高于其亲本，当地品种中黄13根际土壤微生物活性介于转基因大豆和非转基因亲本大豆之间。转基因大豆PAT和转基因大豆ALS土壤微生物群落物种均一度(J)和优势度指数(D)较对应亲本均无显著差异(p0.05)。主成分分析结果表明，转基因大豆PAT、亲本PAT1、非转基因亲本大豆ALS1以及中黄13土壤微生物群落碳源利用类型相似，仅转基因大豆ALS土壤微生物碳源利用类型表现出差异。对不同碳源的分析结果表明土壤微生物利用的主要碳源为糖类、氨基酸类、羧酸类和聚合物。
3.根际土壤固氮微生物nifH基因DGGE试验结果表明，转基因大豆PAT和转基因大豆ALS分别与相应非转基因亲本大豆PAT1和ALS1相比根际土壤固氮微生物群落组成相似度均在60%左右。转基因大豆PAT和转基因大豆ALS土壤固氮微生物nifH基因多样性指数(H)和均匀度指数(EH)与相应亲本相比差异均不显著(p0.05)。测序结果表明，两种转基因大豆与其相应非转基因亲本大豆根际土壤中固氮微生物主要隶属于蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)。
4.根际土壤氨氧化细菌DGGE试验结果表明，两种转基因大豆土壤氨氧化细菌种群分别与其相应亲本聚为一类，相似度均高于80%。但转基因大豆PAT和转基因大豆ALS之间相似度也高达75%。转基因大豆PAT和转基因大豆ALS土壤氨氧化细菌多样性指数(H)和均匀度指数(EH)与相应亲本相比差异均不显著(p0.05)。测序结果表明，转基因品种与相应亲本及当地主栽大豆中黄13土壤氨氧化细菌群落结构组成除不可培养菌种外，主要由β-变形菌纲(Betaproteobacteria)的亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)和亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)组成。其中亚硝化螺旋菌属(Nitrosospira)所占比例最高。
5.根际土壤反硝化微生物DGGE试验分析结果表明，两种转基因品种分别与其相应亲本聚为一类，相似度均高于80%。转基因大豆PAT和转基因大豆ALS土壤反硝化细菌多样性指数(H)和均匀度指数(EH)与相应亲本相比差异均不显著(p0.05)。从系统发育分析结果可知，转基因品种与相应亲本及当地主栽大豆中黄13的土壤反硝化细菌主要属于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和黄杆菌纲(Flavobacteria)。其中有6条属于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)，占条带总数的50%。
本研究对不同转基因大豆种植对土壤氮循环相关微生物的影响进行初步研究，结果表明不同转基因品种与其相应的亲本相比对土壤氮循环相关微生物无显著影响。
【关键词】：
【学位授予单位】：内蒙古师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：S154.4【目录】：
中文摘要4-6ABSTRACT6-121 引言12-19 1.1 研究意义12-13 1.2 国内外研究概况13-15
1.2.1 转基因作物对土壤理化及酶活性的研究13-14
1.2.2 转基因作物对土壤微生物多样性的研究14-15
1.2.3 转基因作物根际土壤微生物对氮素循环影响的研究15 1.3 转基因作物发展现状15-16 1.4 土壤微生物多样性的分子生物学研究方法16-17 1.5 研究内容17-18 1.6 技术路线18-192 研究区概况与研究方法19-25 2.1 研究区概况19 2.2 试验材料19 2.3 试验设计19 2.4 土壤样品采集19-20 2.5 实验方法20-25
2.5.1 土壤理化性质测定20
2.5.2 土壤酶活性的测定20
2.5.3 微生物群落功能多样性的测定20
2.5.4 土壤微生物氮循环相关微生物的影响20-23
2.5.4.1 土壤样品 DNA 的提取20
2.5.4.2 PCR 扩增20-22
2.5.4.3 变性梯度凝胶电泳22
2.5.4.4 序列测定及序列特征比对22-23
2.5.5 数据分析23-25
2.5.5.1 土壤理化性质和酶活性数据分析23
2.5.5.2 土壤细菌功能多样性数据分析23-24
2.5.5.3 氮循环相关微生物的遗传多样性数据分析24-253 结果与分析25-43 3.1 转基因大豆对土壤理化性质的影响25-28
3.1.1 转基因大豆对土壤全磷含量的影响25
3.1.2 转基因大豆对土壤速效磷含量的影响25-26
3.1.3 转基因大豆对土壤全氮含量的影响26
3.1.4 转基因大豆对土壤硝态氮含量的影响26-27
3.1.5 转基因大豆对土壤铵态氮含量的影响27
3.1.6 转基因大豆对土壤有机质含量的影响27-28
3.1.7 转基因大豆对土壤 PH 含量的影响28 3.2 转基因大豆对土壤酶活性的影响28-29
3.2.1 转基因大豆对土壤脲酶活性的影响28-29
3.2.2 转基因大豆对土壤过氧化氢酶活性的影响29 3.3 转基因大豆对土壤微生物功能多样性的影响29-33
3.3.1 不同转基因大豆根际土壤微生物群落平均吸光值(AWCD)变化29-30
3.3.2 土壤微生物群落代谢功能多样性分析30-31
3.3.3 主成分分析31-33
3.3.3.1 主成分分析31-32
3.3.3.2 不同碳源在主成分上的载荷值32-33 3.4 转基因大豆对土壤固氮微生物遗传多样性的影响33-43
3.4.1 转基因大豆对根际土壤固氮菌多样性的影响33-37
3.4.1.1 DGGE 图谱分析33-35
3.4.1.2 土壤固氮微生物 nifH 基因分析与系统发育构建35-37
3.4.2 转基因大豆对根际土壤氨氧化细菌多样性的影响37-40
3.4.2.1 DGGE 图谱分析37-38
3.4.2.2 土壤氨氧化细菌分析与系统发育构建38-40
3.4.3 转基因大豆对根际土壤反硝化细菌多样性的影响40-43
3.4.3.1 DGGE 图谱分析40-41
3.4.3.2 土壤反硝化细菌 nirK 基因分析与系统发育构建41-434 讨论43-51 4.1 不同的转基因大豆的种植对土壤理化性质的影响43-44 4.2 不同的转基因大豆的种植对土壤酶活性的影响44 4.3 不同转基因大豆的种植对土壤微生物功能多样性的影响44-47 4.4 不同转基因大豆的种植对土壤固氮微生物遗传多样性的影响47-51
4.4.1 不同转基因品大豆种植对固氮微生物 nifH 基因传多样性的影响47-48
4.4.2 不同转基因大豆的种植对土壤氨氧化细菌遗传多样性的影响48-49
4.4.3 不同转基因大豆的种植对土壤反硝化细菌遗传多样性的影响49-51参考文献51-60致谢60-61作者简介61-62附录1 主要实验仪器一览表62-63附图63
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氮是蛋白质的基本组成元素之一(有关蛋白质的知识见第9章)。所有体均含有蛋白质，所以氮的循环涉及到圈的全部领域。氮是地球上极为丰富的一种元素，在大气中约占78％。氮在空气中含量虽高，却不能为多数生物体所直接利用，必须通过固氮作用。固氮作用的两条主要途径，一是通过闪电或化学合成等高能固氮，形成的硝酸盐和氨，随降水落到地面；二是生物固氮，如豆科植物根部的根瘤油菌可使氨气转变为硝酸盐等。植物从土壤中吸收铵离子(铵肥)和硝酸盐，并经复杂的生物转化形成各种，然后由合成蛋白质。动物以植物为食而获得氮并转化为动物蛋白质。动植物死亡后的遗骸中的蛋白质被微生物分解成铵离子、硝酸根离子和氨，双回到土壤和水体中，被植物再次吸收利用。
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