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在克隆之前的载体链接时，不知道能否将回收的两个不同的目的DNA片段链接在同一管中的载体上，再同时转化到同一管中的感受态，之后再同时培养，挑单菌落，培养!
这样能得到预期的结果吗？在分别用不同的引物扩增，鉴定。同一菌液中有两种不同转化的质粒，测序能测到吗？
提问者： [] [] []
回答者：匿名用户
不知道你这样做的目的是什么，为了节省试剂还是什么，不过最好不要这样做，因为你后面挑菌做菌落PCR时不确定哪个菌是你的哪个插入片段的拷贝，这样你的引物不好加，即使你都加，这样应该会有影响的吧。就像我们跑普通PCR一样，没见有人把所有的引物加到一个模板里面跑吧
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找到"克隆链接问题有些不懂！不知道能不能把两个目的DNA片段连接在一个管中的载体内。"相关问题约0篇，用时1.969782秒
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1、插拔一次网卡一次
　如果是独立网卡，本地连接的丢失多是因为网卡接触不良造成，原因如主机受到震动或长时间不清理造成灰尘过多，而造成的硬件接触不良。
　解决方法：关机，拔掉主机后面的电源插头（很重要），打开主机，去掉网卡上补丁的螺丝，将网卡小心拔掉。使用工具将主板灰尘清理干净（最好用吹风机），特别将网卡的插槽吹干净，将网卡的版面用干抹布擦干净（必须是干的），然后用橡皮将金属接触片擦一遍。将网卡向原位置插好，插电，开机测试。如果正常发现本地连接图标，则将机箱封好。
　如果还是没有本地连接，再试一次，如果还不行，很可能是网卡的问题，从新找一个或买一个网卡来测试。
2、查看设备管理器中查看本地连接设备状态
　右键&我的电脑(计算机(电脑))&&&属性&&&硬件&&&设备管理器&&看设备列表中&网络适配器&一项中至少有一项，如下图，如果这里空空如也，那说明系统没有检测到网卡，右键最上面的小电脑(计算机(电脑))的图标&扫描检测硬件改动&，检测一下，如果还是没有那么是硬件的接触问题或者网卡问题。
我的电脑(计算机(电脑))--设备管理里查看网络连接
　以上为笔者电脑(计算机(电脑))网卡信息，从中可以看到有2个网卡，因为笔者电脑(计算机(电脑))是笔记本电脑(计算机(电脑))，多出一个无线网络连接设备。如果设备中没有网络适配器则说明网卡没接好或者出故障了，如果出现也个黄色感叹号，则为驱动没安装好，或者驱动不正确。
右键网络适配器中对应的网卡选择&属性&可以看到下图，这里可以看到网卡的运行状况，包括状态、驱动、中断、电源控制等如下图：
网络适配器工作情况
　解决办法，如果找不到网络网络适配器说明电脑(计算机(电脑))没检测到网卡，您需要检查是不是网卡没插好或出故障了，如果是网卡设备名称上出现黄色感叹号，则说明驱动不兼容，请使用驱动精灵等软件去重新安装驱动即可。
　如果以上问题都解决还没解决问题，那么可以使用以下极少出现的情况办法去处理。
三：服务进程关闭造成的本地连接丢失造成本地连接不见了
　某一些朋友不小心禁用了某些服务也可能造成本地连接丢失。
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可放到开始菜单使用。。源代码就一句话【Run(&RunDll32.exeshell32.dll,Control_RunDLLncpa.cpl&)】，没技术含量，纯粹就是为了方便。
大小：369 KB 日期：<font color="#12-05-19 []
　解决办法：右键&我的电脑(计算机(电脑))&&&管理&&&服务和应用程序&&&服务&，找到&Network Connections&双击，会出现下图：
　请注意这里的&启动类型&和&服务状态&，启动类型的手动和自动没有强制性，如果你觉得不放心可以将其改为&自动&，重要的是&服务状态&，一定要&已启动&。如果这里无法设定，请首先将&启动类型&中的&禁用&修改为&自动&或者&手动&，其他的就让修改了。
　我们看&依存关系&按钮，会看到&Remote Procedure Call (RPC)&。所以，要看看&Remote Procedure Call (RPC)&服务的状态，确保它也要&自动&和&已启动&。提示：还有一个&Remote Procedure Call (RPC) Locator&服务不用设定。
　我们已经到服务设定，所以，一不做二不休，将另外一个很重要的服务也设定正常。Plug and Play 这个就是所谓的&即插即用&检测服务，当然，按照我们上面所说的设定正常运行。
　服务进程的设定完毕之后，右键&网上邻居&&&属性&，看到网络连接的窗口，刷新几次，看有没有效果，实在不行，重新启动一次。如果是系统服务问题造成的本地连接丢失，这样的设定就可以解决了。
最后需要注意的一小点，检查是否删除已有的连接。
　&开始&&&运行&&输入 gpedit.msc 点击&确定&，依次展开&用户配置&&&Windows 设置&&&Internet Explorer 维护&&&连接&，在对应&连接&文件夹右边的子窗口中，双击&连接设置&选项。看下面两图。
　注意上图中的&一定不要打上。
　另外笔者发现一些笔记本电脑(计算机(电脑))代有网卡节能功能，只要电脑(计算机(电脑))待机之后再开就发现本地连接不见了，但依然可以上网，这种情况其实大家不需要去理会，一般重新启动就可以显示出来，真的想一直显示出来不受待机影响，可到设备管理里找到显卡工作状态，在电源管理里的允许该设备节约电能的&去掉即可，如下图，这里就不详细介绍了。
是否允许计算机(电脑)关闭这个设备以节约电源
　上图中框中有提示&允许计算机(电脑)关闭这个设备以节约电源&，如果你勾选此选项，就会经常出现待机后无法上网的情况，若不想受到经常不上网的困少，去掉勾选即可。
　介绍到这里，差不多关于本地连接不见了的问题一般就这么多，如果按照以上方法均不能找到或解决本地连接不见了，那么建议你重新安装系统看看，问题依旧，那么很可能是硬件出了问题，也有可能是相关接口的故障，那么就需要拿到专业维修店去检测了。本文由电脑(计算机(电脑))百事网原创，转载请保留本信息，谢谢！
&编辑：admin&来源：本站整理&解决时间: 22:29
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近期，我做DNA平末端连接，用PCR扩增650bp目的片段（采用的是pfu酶），与SmaI酶切的3.8kb的载体连接。由于得到的两种产物都是平末端，故我们用T4 DNA ligase连接，但是比较麻烦，连了数次，就是连不上。
　我试过很多方法，先将目的片段和酶切的载体同时电泳，以确定其相对浓度，设计反应体系，目的片段和酶切的载体的用量比分别为：3：1，1：1，1：3。条件也设计了多种，4度、16度、25度（室温）等。
但还是连不上，蓝白筛选筛选不到！！
很是郁闷啊！
请高手指教！！
回答者：匿名用户
DNA平末端连接的效率本来就比较低
注意下面的几个方面
1.平末端连接时,以载体与片段末端的摩尔比为1：3 作为参考值
2.连接时,T4DNA 连接酶的浓度应比粘末端连接时高8～10 倍
3.增加连接的时间，有文献说反应条件在4 ℃,12 h 最好
4.加入凝聚剂，30%PEG 8000
1~1.5&l（10微升体系）
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pfu扩增产物肯定不能直接连接的,要对其进行A-tail处理,否则不可能进行T/A克隆的
作者：lyrs 时间： &共0人支持此评论
加大pcr片段和载体的量，用NEB的连接酶，转化用电转。其他教科书式的优化基本上没有意义
作者：mantou64 时间： &共0人支持此评论
再加点ATP更好
作者：gg2557 时间： &共0人支持此评论
其他回答 (2)
克隆平末端的目的片段时，为最大量地获得&正确&的连接产物，载体和目的DNA在连接反应中的比例必须适当。载体与目的DNA的摩尔比过高，会造成大量的环化空质粒，既可能是单一质粒的环化，也可能是多个质粒聚集而形成的环化。摩尔比如果过低，则会产生过量的在大小、方向和组成上各不相同的线状和环状的均质或异质性多聚体。为此，每一重组体中外源DNA的连接方向和插入数量都必须用限制酶酶切图谱分析或其他方法加以鉴定。本实验以载体与目的片段的摩尔比为1:10进行连接，同时应用三种不同的限制性内切酶进行多重鉴定，取得了满意的实验结果。
&&& 连接体系中高浓度的平端，也是获得平端连接的必要条件。在载体和目的片段的摩尔比适当的条件下，尽量加大各自的摩尔浓度，以缩小载体片段末端与目的片段末端在空间上的距离，从而加大二者的碰撞几率，减小载体片段的自身环化连接。本实验主要从以下几点来加大连接体系中载体片段和目的片段的平端浓度：1）提取质粒DNA时尽量做到高浓度、高质量；2）酶切时，在不影响酶切效果的情况下，加大酶切体系中质粒DNA的浓度；3）凝胶电泳分离目的DNA时，加入大量酶切产物，胶回收时尽量少带胶，切下的胶中目的片段的浓度尽量高，从而使回收的溶液中DNA片段的浓度尽量高；4）连接体系尽可能小（一般 5~10&l），体系中除T4噬菌体DNA连接酶和相应的缓冲液外，全部由两种胶回收溶液按特定比例填充。
&&& 低浓度（0.5mmol/L）的ATP和极高浓度的连接酶也是平端连接的必要条件。在反应混合物中，ATP作为10&连接缓冲液的组分，给载体和外源 DNA片段提供了更为广阔的空间。本实验中厂家提供的连接缓冲液含有ATP，因而没有另外加入ATP。此外，平端连接是低效反应，连接反应的时间相对较长，所以应加入极高浓度的连接酶。
&&& 去除载体5&端的磷酸基可防止质粒DNA的自身环化，这一点在不少书籍中提到。但对于去磷酸化处理是否有利，各家的观点不尽相同，有很多研究者对去磷酸化的作用持有疑问。毫无疑问，去除5& 端的磷酸基可抑制质粒DNA的自身环化，因而降低带有&空&质粒的细菌克隆所产生的背景。因而，也会经常发生同时使带有重组质粒的克隆减少的情况。此外，去磷酸后，必须对碱性磷酸酶进行充分灭活，以保证下一步的连接反应顺利进行，但灭活过程中进行抽提时，大大降低了质粒DNA的浓度，不容易操作。本实验初期尝试应用碱性磷酸酶去除载体5&端的磷酸基，效果并不理想。鉴于这些原因，本实验不推荐使用这一方法。
&&& 在连接反应混合物加入一些可促进大分子群聚作用并可导致DNA分子凝聚成聚集体的物质，如聚乙二醇或氯化六合高钴，可以使如何取得适当浓度的平端DNA问题迎刃而解。但考虑到这些物质的加入也增强了连接产物的硬度，大大降低了连接产物转化大肠杆菌的效率，所以本实验并没有应用这类物质。
回答者： 一级 一星助者
回答字数在10000字以内
找到"DNA平末端用T4 DNA ligase连接多次连接不上的问题"相关问题约0篇，用时0.967589秒
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