我用考马斯亮蓝法测酶量,在做标准曲线时做了六七遍R还是不到0.99,可能是什么原因呢?能不能用我待测的酶,而不用牛血清蛋白做标曲呢_百度作业帮
我用考马斯亮蓝法测酶量,在做标准曲线时做了六七遍R还是不到0.99,可能是什么原因呢?能不能用我待测的酶,而不用牛血清蛋白做标曲呢
我用考马斯亮蓝法测酶量,在做标准曲线时做了六七遍R还是不到0.99,可能是什么原因呢?能不能用我待测的酶,而不用牛血清蛋白做标曲呢
待测得酶?待测的酶都不知道浓度,怎么做标准曲线?我能想到的尽量注意的问题就是比色杯,尽量用一个比色杯,因为不同比色杯之间是有差异的,有时候还很大...不用BSA,也用用IgG做标准曲线的~
牛血清量少&& 查看话题
求助，考马斯亮蓝方程，谢谢！
大家好！请问：有没有考马斯亮蓝测定蛋白浓度标准曲线方程，现在急用，非常感谢！
标准曲线要自己测。每次测浓度都做。因为方程里面的系数与反应液有关，每次配制都有些不同。 2楼正解，楼主可以用分光光度计或者酶标仪自己做标准曲线呀。 以下是具体的原理以及操作步骤：
楼主如果是要用酶标仪的话要注意：把试剂量给等比列缩小，因为酶标仪上的96孔板体积比较小，不能超过1ml总体积，还有振荡的时候最好再配置好试剂之后在摇床上混匀，不然酶标仪上会溢出。
考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。
试剂与器材
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1．标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。
2．待测蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。
试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温
水浴；分光光度计。
一、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
标准蛋白溶液（mL）
0.15mol/L NaCl（mL）
考马斯亮蓝试剂（mL）
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。
在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 谢谢大家，已解决。&& 查看话题
考马斯亮蓝标定曲线问题
一. 蛋白含量测试方法
1. 标准曲线的测试
& & & & 参比(0)& & & & 1& & & & 2& & & & 3& & & & 4& & & & 5
1.0mg/ml标准蛋白 (ìl)& & & & 0& & & & 20& & & & 40& & & & 60& & & & 80& & & & 100
& && && && && && && && &&&水(ìl)& & & & 100& & & & 80& & & & 60& & & & 40& & & & 20& & & & 0
Bradford Reagent(ml)& & & & 3& & & & 3& & & & 3& & & & 3& & & & 3& & & & 3
A595& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
平均A595& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &
按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后(时间要精确)在595nm波长处以0号管为参比，测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
2.样品测定
取0.1ml样品溶液，加入染料溶液3ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
1.测吸光度时，须用塑料比色皿。
2.加入染料(Bradford Reagent)后，要立即混合均匀，5min后测定吸光度值。所有样品比逊在10min内测完。
考马斯亮蓝的配置：
1. 考马斯亮蓝G-250取100mg
2. 加50ml 95%酒精溶解
3. 加100ml 85%磷酸
4. 用蒸馏水定容至1000ml
5. 过滤，去除未溶解物
6. 4℃保存，留备用。
我是按照这个方法测的，可是为什么，测出来的曲线是负数，甚至呈一个下降趋势（表示没加错样什么的）。搞不懂，郁闷之极。求大神么解惑啊，顺便能告知一下所用试剂的作用不？（标准蛋白是牛血清白蛋白）
蛋白的浓度过大会出现下降的趋势是正常的，浓度过测出来的值是不准的，我一般都是0.1~0.5mg/mL这个段的。 我最近也打算买牛血清白蛋白做标曲，请问Sigma的纯度98%够么？ : Originally posted by Ivy尘 at
我最近也打算买牛血清白蛋白做标曲，请问Sigma的纯度98%够么？ 我也想知道这个问题，要买哪种牛血清蛋白做标准曲线。如果有知道的朋友，麻烦告诉我一声，qq：.谢谢！ 注意试验中的几点细节：
1.利用比色皿做实验时一定要注意比色皿每次用完后是否清洗干净，是否残留有蛋白对后续测试有影响。
2.配制染色液时，里面的主要成分是酒精，你配制过程有无遮盖瓶口防止配制过程中酒精的挥发。
3.取点不能太少，一般要测8到10个点，然后再从中取好的点。
4.在浓度较低时不要忽略温度的影响。
希望对你有帮助~:hand: 还要避光&&防止分解 用漩涡器混匀，还有你的BSA放的时间是不是太久了，我把BSA换了，曲线就行了考马斯亮蓝标准曲线方程？
- 让江西大学生走到一起
考马斯亮蓝标准曲线方程？
有没有人用考马斯亮蓝法测过蛋白质含量，求一下标准曲线的方程，因为没有买到标样！所以就只有找一下方程式了，时间比较紧！
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& &SOGOU - 京ICP证050897号BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题 - 实验交流 - 生物秀
标题: BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题
摘要: [BSA做考马斯亮蓝标准曲线的问题] 请问大家，用BSA做考马斯亮蓝标准曲线来测定目的蛋白浓度，如果目的蛋白的分子量和BSA差很多的时候，BSA标准曲线是否能用？还是需要用与目的蛋白差不多的蛋白来做标准曲线？详细：1
我有一目的蛋白，叫细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR），分子量为26kD，其中Arg、Trp、 关键词:[标准曲线 目的蛋白 考马斯亮蓝 磷脂 膜蛋白 摩尔消光系数 复合物]……
请问大家，用BSA做考马斯亮蓝标准曲线来测定目的蛋白浓度，如果目的蛋白的分子量和BSA差很多的时候，BSA标准曲线是否能用？还是需要用与目的蛋白差不多的蛋白来做标准曲线？
1. 我有一目的蛋白，叫细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR），分子量为26kD，其中Arg、Trp、Phe和Tyr这四个残基一共有38个。
1） 细菌视紫红质（简称BR），除了在280nm有吸收峰外，在558nm处也有吸收峰（暗适应态），因为此蛋白内部有一个发色团。
2）BR的浓度计算，一般是用在558nm的摩尔消光系数ε558=53000M-1cm-1来计算。
2. 用摩尔消光系数得到的BR浓度vs用考马斯亮蓝法（BSA标曲）得到的浓度
1）我配制一定浓度的BR溶液，测得OD558=0.396，用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml
2）用BSA制备标曲曲线，步骤如下：
称取2.06mg BSA溶于20ml去离子水，母液浓度为0.103mg/ml，与染料作用10分钟，具体参数和标准曲线见图。
用此标准曲线，测定上述BR溶液浓度，取1ml待测液，与4ml考马斯染液作用10分钟，取3ml测OD595=0.474，计算得到此蛋白浓度为为49.69ug/ml。
用两种方法测定的蛋白浓度相差约四倍。
疑问：1.为什么会有这样的差异，是因为BSA和BR这两种蛋白的分子量和所含的氨基酸成分不同造成的吗，还是因为BR本身在558nm有吸收峰而造成的影响？
2. 我有另一个目的蛋白，和BR一样也是细菌类视紫红质，在550nm有特征吸收峰，测定这个蛋白，我是用BSA还是BR来做标准曲线？
谢谢，如果有不清楚的地方，请回帖问我。
BR光谱扫描.jpg
BSA参数.jpg
BSA标曲.jpg回复竟然是用BSA做标准物，那么作标曲，以及测你的样品。
保证体系不变，波长不变就可以了。
不要考虑你样品的最大吸收峰波长了。回复不好意思，题目没看清楚，
自己科普了下，
（1）测定条件跟查到的蛋白质的摩尔浓度所用的溶液条件是否一致？
（2）测定时样品的光程是否为1cm？
其他我也看不出破绽。回复你用BSA标曲，表格中蛋白浓度都要相应乘以5吧，测得的蛋白浓度是248.45ug/ml，与用摩尔消光系数计算得浓度为194ug/ml有差距，但不同方法间不可能相同吧。回复用280nm 测看，因为你的蛋白含有Arg、Trp、Phe和Tyr氨基酸。回复已经乘以5了，此外，我想到一点，我的目的蛋白是，测浓度时的状态是蛋白-磷脂复合物，这样是否影响此体系测蛋白浓度的准确性回复
用280nm 测看，因为你的蛋白含有Arg、Trp、Phe和Tyr氨基酸。 用280测我这目的蛋白浓度，测不准。我的蛋白是一种嗜盐杆菌膜上的，蛋白提取是通过蔗糖梯度离心来纯化的。测浓度时，蛋白的状态是磷脂-蛋白复合物。我想，这一点是不是造成大误差的原因。回复
不好意思，题目没看清楚，
自己科普了下，
（1）测定条件跟查到的蛋白质的摩尔浓度所用的溶液条件是否一致？
（2）测定时样品的光程是否为1cm？
其他我也看不出破绽。 感谢回复，光程是1cm，至于溶液条件，我去查查最初的原始文献。回复补充一条件，目的蛋白BR，是一种位于嗜盐杆菌膜上的七跨膜蛋白，天然状态下，在膜上形成稳定的3聚体蛋白-磷脂复合体。纯化此蛋白是用蔗糖梯度离心法，最后得到的目的蛋白样品是“BR三聚体-磷脂”复合物，我想是否鉴于它是膜蛋白，而且与磷脂形成复合物，所以影响了样品与考马斯亮蓝的作用，使得用考马斯亮蓝法测定的浓度偏小。 用558nm的摩尔消光系数法测定的浓度是绝对正确的，因为原理是通过测定它的配体“视黄醛”来确定的，蛋白和配体以摩尔比1:1结合。确定上述问题的目的是，为了测定我的另一个与BR性质相近的蛋白。
PS：功能区的摩尔消光系数比较难测定。回复
已经乘以5了，此外，我想到一点，我的目的蛋白是膜蛋白，测浓度时的状态是蛋白-磷脂复合物，这样是否影响此体系测蛋白浓度的准确性... 你好！可以展示下你用BSA标曲测所得的原始数据吗？我现在按你所提供的得到的也不是你所说的数值，是不是你取1ml的待测液也进行了一定的稀释？你想到的蛋白状态是否影响测浓度的准确性，这点我没考虑过，但觉得不是。回复
你好！可以展示下你用BSA标曲测所得的原始数据吗？我现在按你所提供的得到的也不是你所说的数值，是不是你取1ml的待测液也进行了一定的稀释？你想到的蛋白状态是否影响测浓度的准确性，这点我没考虑过，但觉得不是 ... 用此标准曲线，测定上述BR溶液浓度，取1ml待测液，与4ml考马斯染液作用10分钟，取3ml测OD595=0.474。根据BSA标曲公式y=0.048x-0.003，已知y=0.474，x=9.9375ug/ml，因为待测液是1ml，所以乘以5，得浓度为9..6875，近似49.69ug/ml。以上，我想这个应该没啥问题，我没有算错吧。1ml的待测液没有再进行稀释，就是配的1ml未知浓度的蛋白待测样品。回复
用此标准曲线，测定上述BR溶液浓度，取1ml待测液，与4ml考马斯染液作用10分钟，取3ml测OD595=0.474。根据BSA标曲公式y=0.048x-0.003，已知y=0.474，x=9.9375ug/ml，因为待测液是1ml，所以乘以5，得浓度为9.9375×5 ... 恩，你没算错，我算了下得的值是这个，我也不懂什么原因为啥有这么大差别了。回复1.考马斯亮蓝原理在于染料与蛋白形成复合物，而膜蛋白用这种方法显然是测不准的。2.280nm光吸收，依赖组成，另外蛋白的高级结构也有影响（芳香完全暴露时吸收最大）。BSA和待测蛋白的氨基酸组成差异太大也不行。3.如果550nm的摩尔吸光系数接近BR，分子量相对关系确定，可以用BR做标准曲线，否则，没什么好办法了。膜蛋白不好做准确定量，和BSA差别太大了回复Bradford Assay?
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