细胞冻存_百度百科
将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存
细胞冻存基本资料
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。 细胞冻存时向培养基中加入保护剂--终浓度5%．15%的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，加之在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。 采用&慢冻快融&的方法能较好地保证细胞存活。标准冷冻速度开始为-1 到 -2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内(-196℃)。
细胞冻存背景知识
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
细胞冻存操作步骤
细胞冻存材料
（一）仪器
1. 净化工作台
3. 恒温水浴箱
4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃）
7. 液氮冰箱
（二）玻璃器皿
1. 吸管（弯头、直头）
3. 玻璃瓶（250ml、100ml）
（三）塑料器皿
4. 移液管（10ml）
5. 15ml离心管
6. 冻存管（1～2ml）
（四）其他物品
1. 微量加样枪
2. 红血球计数板
4. 医用橡皮膏
（五）试剂
1. D-Hanks液
2. 小牛血清
4. 双抗（青霉素、链霉素）
5. 胰蛋白酶（0.08%）
7. 7.4%NaHCO3
8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油
细胞冻存操作步骤
（一）细胞冻存
1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；
2. 取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗。
3. 去除PBS，加入适量胰蛋白酶（覆盖培养皿表面）把单层生长的细胞消化下来；
4. 离心1000rpm，5min；
5. 去除胰蛋白酶，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；
6. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；
7. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；
8. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。
（二） 细胞复苏
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心， 1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
细胞冻存注意事项
1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；
2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；
3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
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最近发现，我的一些MEF所在的冻存管，从液氮中拿出后管中是有液氮的，可以看见液氮在沸腾。
前段时间有人在液氮罐里面爆炸了好多管子，其中里面还有病人样品。
两个问题，1，液氮为何会进入管子？保证是不漏水的。复苏时候为证。进口corning的。2，会带入污染物到细胞里吗？
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冻存管即使封闭很严，在管内外巨大的温度差异下，由于管壁变型等原因，液氮仍会进入管内。液氮进入管内，有可能带入污染物，因此有些单位使用气相冻存罐保存临床标本和冻存的脐血等。
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<td class="t_f" id="postmessage_.常温的冻存管进入液氮后，冻存管内部会热胀冷缩，在冷缩的过程中，液氮进入冻存管。拿出来后，进入的液氮遇热膨胀，导致冻存管崩裂。
2.理论上，液氮进入冻存管，不会有污染物的，因为液氮的内部不会有污染物可以存活。
3.楼上的可以参考。个人建议，仅供参考
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烧不死的鸟就是凤凰
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每次冻存完的细胞是直接从负80度放到液氮里，这个过程是没有问题的，有时候是你在从液氮罐拿细胞的时候，由于热涨冷缩冻存管出现了爆炸，如果冻存管裂了，细胞就不能再要了，如果液氮进入了冻存管内，你可以复苏之后看看细胞是否出现了污染，一般来说，从液氮中取细胞的时候要注意自我保护，另一方面也需要快速的冻融提高细胞的活力。
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回复 0 N% h$ v9 t" H5 j. \7 u
2 H1 B8 @7 f' E
首先污染是肯定的。8 E% k( {/ T7 g8 @. O9 G, y( w9 ^
其次之所以会进入是因为冻存管质量问题，或者管口封闭不严。$ R7 n3 c6 U# ^1 _
水货冻存管肯定会出现问题。 本人从事细胞培养近20年， 从没有液氮进入，导致污染，爆裂情况。# K" R# ~( {' M8 |
所以远离劣质产品即可。
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建议用气态液氮罐冻存&&就是让冻存管不直接接触液氮 而是接触液氮上面的气相 当然 温度相对要高一点 但影响不大 不会造成交叉污染和爆管的哦
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气相液氮罐的温度不知道是多少， 可以保证细胞处于静息状态吗？
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复苏时从液氮取出后，可以放在-80冰箱2-3min，待液氮挥发后，在进行复苏。避免爆炸
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冻存管不是“密封”产品，没有完全封死，而是“密闭”，存在一定的间隙，所以在液氮这种极端温度下，材料的性能可能会发生我们想象不到的变化，从而发生渗漏，进而可能造成衣原体或其他如细菌之类的污染。
解决办法一是采用“密封”产品，比如装完之后熔封，二是存放在液氮气相。
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个人感觉 是因为投入液氮的时候急速降温导致冻存管内压力过低导致的。有液氮进入，必然存在污染的风险，而且的确会遇到解冻时冻存管爆炸的情况（我遇到过）。# u) E$ n8 ?# ?
可以将冻存管装的比较满（90%），并加强密封，应该可以解决。
想法将麦管灭菌（如果有无菌的更好），可以改用麦管装样，然后两端封口。用麦管配套的支架放到液氮里。
短的毛细管或麦管装样，封口后放到冻存管里，这样的话冻存管别太密封，可以钻个小孔什么的 方便液氮进出。每次从冻存管里取一小支就可以。
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【求助】放组织的冻存管能不能反复使用
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各位前辈大神，由于实验经费相当吃紧，所以想反复使用冻存管，能扣一点是一点···。我的冻存管里是放的大鼠的大脑组织。是不是可以直接蒸馏水洗洗就可以反复用了啊？之前看了一些帖子，各种消毒浸泡，但是那是针对放细胞的冻存管，我的是放组织，是不是就蒸馏水洗洗就好啊？
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同有此疑惑啊，照理来说高压消毒灭菌后还是可以用的啊
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如果非要回收的话双蒸水洗干净高压后烤干即可；若做rna相关的实验，洗后要depc浸泡处理再高压烤干。
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建议不要反复使用
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谢谢各位 我用后再来反馈
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cheff0412 edited on
实在抠的话，最好是弄干净用，带来外来污染或混样可不好了
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