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蛋白质相互作用组学分析技术
蛋白质相互作用组学分析技术
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为探究生物进程的分子机制，需要确定介导这个过程的蛋白质-蛋白质间的相互作用。研究蛋白质间相互作用的主要技术总结如下：一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。五、抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。六、免疫共沉淀技术免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。七、pull-down技术蛋白质相互作用的类型有牢固型相互作用和暂时型相互作用两种。牢固型相互作用以多亚基蛋白复合体常见，最好通过免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down技术或Far-western法研究。Pull-down技术用固相化的、已标记的饵蛋白或标签蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白。通过Pull-down技术可以确定已知的蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，从体外传路或翻译体系中检测出蛋白相互作用关系。
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BRET――细胞内实时分析蛋白质－蛋白质相互作用的工具
来源：科端生物 点击数：
Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET): 细胞内实时分析蛋白质－蛋白质相互作用的工具
BRET 原理:
BRET是利用了辐射自由能的转移，这种转移只有在两种相容的光学探针达到一定的分子临近距离的时候才发生。详细的是，为了探测两个给定的蛋白质的蛋白质－蛋白质之间的相互作用，把这两个蛋白分别与发射蓝光的Renilla荧光素酶和吸收蓝光的黄荧光蛋白重组融合。如果这两种重组蛋白相互作用，荧光素酶发出的能量能够转移到荧光蛋白上，能够很容易地在发光光谱中检测到黄色光波峰。这种发光光谱用自发光仪可以很容易地检测。
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（评论内容只代表网友观点，与生物谷立场无关！）三种钴乙醇酸配合物与牛血清白蛋白相互作用的荧光分析
Interaction Between Three Cobalt(Ⅱ) Glycollates and Bovine Serum Albumin Studied by Fluorescence Spectrum
作者单位E-mail&,,&&&,&&&,,&&&,,&&
摘要:&利用溶液法合成了3种钴乙醇酸配合物，并对配合物cis-[Co2（Hgly）4（2，2’-bpy）2]（Hgly=glycolic acid，2，2’-bpy=2，2’-bipyridine）（3）进行了X-射线单晶衍射表征，结果表明：该配合物为三斜晶系，空间群为P21/c，a=1.003 7（3）nm，b=2.022 6（5）nm，c=1.660 1（4）nm，β=119.942（13）°，V=2.920 3（13）nm3.利用荧光光谱法分别研究了室温下这3种配合物与BSA相互作用的结果，并测定了不同温度下配合物2和3与牛血清白蛋白相互作用的荧光强度的变化，确定了配合物2和3对牛血清白蛋白的荧光淬灭方式均为静态淬灭；同时分析了这两种配合物与牛血清白蛋白相互作用时的结合常数、结合位点数以及热力学函数与温度变化之间的关系，进一步讨论了这两种配合物分别与BSA相互作用时的作用力类型。综合以上结果表明：当分别含有邻菲咯啉和2，2’-联吡啶配体的配合物与BSA相混合时，它们都能与BSA相互作用，且主要的作用力都是氢键和范德华力，但它们对蛋白质中色氨酸的构象或其周围环境的影响却是不同的。
关键词:&&&&&&&
基金项目:&国家自然科学基金资助项目（No.），福建省教育厅基金（No.JA12216）.
Abstract:&Three neutral complexes of cobalt(Ⅱ) glycollates had been synthesized in the solution, in which cis-[Co2(Hgly)4(2,2'-bpy)2] (3) (Hgly=glycolic acid, 2, 2'-bpy=2,2'-bipyridine) was characterized by X-ray structural analysis. It crystallized in the triclinic system, space group P21/c, a=1.003 7(3) nm, b=2.022 6(5) nm, c=1.660 1(4) nm, β=119.942(13)°,V=2.920 3 (13) nm3. The interaction between bovine serum albumin (BSA) and complexes 1~3 had been investigated with fluorescence spectra at room temperature respectively. The fluorescence quenching was shown as static quenching for 2 and 3 based on fluorescence spectra at the different temperatures. The binding constants, binding sites and thermodynamic functions were calculated. The interaction sites and binding force of BSA with complexes 2 and 3 were proposed. These results showed that when the complexes containing phenanthroline and 2,2'-bipyridine interacted with BSA respectively, the ligands of 1,10-phenanthroline and the 2,2'-bipyridine both perturbed the microenvironment close to tryptophan residues of BSA, but the effects were different.
Keywords:&&&&&&&
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林海彬,周朝晖,王庆华,汪庆祥.三种钴乙醇酸配合物与牛血清白蛋白相互作用的荧光分析[J].无机化学学报,):.
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