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SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中加入SDS的作用是(　　)
A．增大蛋白质的相对分子质量
B．改变蛋白质分子的形状
C．掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别
D．减小蛋白质分子的相对分子质量
本题考查SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及学生的理解能力。SDS是阴离子去污剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入SDS后，蛋白质分子被解聚成多肽链，解聚后的多肽链和SDS结合成蛋白质—SDS复合物。由于SDS所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这样就消除了不同蛋白质分子间的电荷差异和结构差异，从而达到仅根据蛋白质相对分子质量的不同而使蛋白质得以分离。此类题目需要学生明确电泳法分离物质时影响被分离的物质在凝胶中的迁移速度的因素是相对分子质量的大小和带电性质及电荷数目，相对分子质量和带电性质及电荷数目都不同的物质在电场力的作用下可能会出现迁移速度相同的情况，达不到分离的目的，而SDS就消除了带电的性质和电荷数目的影响，被分离的物质完全靠它们的相对分子质量的大小将其分离开。 &cooｃd
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备课中心教案课件试卷下载聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚合系统)(2)-实验方法
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聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚合系统)(2)
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（二）聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理1．性能聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。2．制备原理聚丙烯酰胺是用丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N,N,N＇,N＇-methylene bisacrylamide，简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。它们的结构式见下页。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：（1）化学聚合：化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（ammonium persulfate，简称AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N＇,N＇-四甲基乙二胺（N,N,N＇,N＇-tetramethyl ethylenediamine，简称TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile，简称DMPN）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。叔胺要处于自由碱基状态下才有效。所以在低pH时，常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，一些金属离子也能抑制聚合。冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。（2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂。不一定加TEMED即能聚合，但加入则可加速聚合。光聚合通常需要有痕量氧存在，核黄素经光解形成无色基。后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量的氧会阻止链长的增加，应该避免过量的氧存在。光聚合通常用日光灯或普通钨丝灯泡作光源，直接日光或室内强散射光也可以。用核黄素进行光聚合的优点是：①核黄素的用量很低（1毫克/100毫升）；②通过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔凝胶较适合。化学聚合的凝胶孔径较大，因而采用过硫酸铵-TEMED催化系统制备小孔凝胶（分离胶），而且制备的重复性好。3．凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度与被分离物的分子量大小的关系，大致范围如表15-1。聚丙烯酸胺：
常用的所谓标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4―10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中是很重要的，胶太软易于断裂，尤其在制作板型电泳的薄片状凝胶时，太软很难操作。太硬则脆，也易折断。凝胶的透明度、粘着度是否合适也影响分离效果。凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis两者之比例。凝胶密度或凝胶浓度，可以用二个字母T和C来定义。T代表丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺二个单体的总百分浓度。C代表总浓度T中交联剂Bis的百分浓度。Hjertern，S.推导出如下这个式子，用以计算凝胶的用量。这里 为丙烯酰胺的量（g） b为亚甲基双丙烯酰胺的量(g) m为缓冲液体积（ml） /b的值是有临界线的，如果 /b＜10，制成的凝胶脆而易碎，坚硬而不透明。如果 /b＞100，即使5%的丙烯酰胺也是糊状的，容易破碎。 /b的值接近30时，（其中丙烯酰胺的量必须＞3%），可以制成既有弹性又完全透明的凝胶。 Davis,B.J.在1964年，研究了丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的浓度范围，分别为1.5―60%和0―0.626%之间的凝胶形成情况。他发现丙烯酰胺浓度＜2%，亚甲基双丙烯酰胺浓度＜0.5%，不发生聚合凝固作用。为了获得一种有弹性的凝胶，在增加丙烯酰胺浓度的同时，应适当减低亚甲基双丙烯酰胺的浓度。对于这个要求，Richards,E.C.等人提出了如下一个经验公式： C=6.5D0.3T 浓度在5―20%范围内，可以应用这个式子容易地计算凝胶的组成用量。式中C可有1%的变化。 对于人血清蛋白质的分离，Brackenridge,C.J.等人，推导出了下面这个经验式，用以计算最适的凝胶浓度，以便获得最好的分辨率。 B=0.201D0.0112T 这里，B代表亚甲基双丙烯酰胺的百分浓度，T为二个单体总的百分浓度。 用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶，太软，不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加20%蔗糖，也可增加机械强度而又不影响孔径大小。 （三）几种染料的性能及染色原理 1．氨基黑10B（amino black 10B）C22H13O12N6S3Na3 MW=715，λmax=620D630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染SDS-蛋白质时效果不好。另外，氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等，色调不一（有蓝、黑、棕等），作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质-染料量（吸收值）的标准曲线。
2．考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R250）。C45H44O7H3S2Na，MW=824， λmax=560D590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。3．考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854；λmax=590D610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
4．1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid，简称ANS），本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，取出凝胶入在平皿中，用此染料溶液浸1―3分钟，用长波紫外灯照射时，产生黄色荧光。可显示蛋白质100微克，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在3mol?L-1盐酸中几秒至2分钟，使表面蛋白质稍变性，然后再用ANS染色，这样可显示蛋白质20微克。 这样的染色优点是可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定；也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不影响抗体的产生。 聚丙烯酰胺盘状电泳具有使样品区带浓缩变窄的作用，所以分辨力高，在很多情况下超过超速离心和常用的层析及一般电泳技术；设备简单，样品量小（1―100微克）；时间短，操作方便，可分离物质的分子大小范围广泛，由多肽到核糖核蛋白体及病毒都可以分离，亦可改变为超微量测定（10-9―10-12克），并可结合SDS来测定蛋白质亚基分子量；或测定核酸等的分子量。这种方法现在几乎代替了超速离心沉降法。它还可以结合等电点聚焦电泳以提高分辨率。 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳用途较广，对生物高分子化合物能进行分离、定性、定量分析，又能用于制备毫克水平的材料。三、器材及试剂： 1．器材： ①血清以及其他蛋白质样品。 ②圆盘电泳槽、稳压直流电源（500V）。 ③玻璃管0.5×7D10cm（×1）及制胶架。 ④日光灯。 ⑤三角烧瓶。 ⑥注射器10ml（×1）、长针头。 ⑦滴管。 ⑧培养皿￠10cm（×5）。 ⑨吸管1ml（×1）、2ml（×1）、5ml（×1）、0.5ml（×1）。 ⑩凝胶成像系统或光密度计。 2．试剂： ①丙烯酰胺（Acr）：分析纯。如不纯，可按下法重结晶：90g丙烯酰胺，溶于500ml50℃氯仿，热滤，滤液用盐冰浴降温，即有结晶析出。砂芯漏斗过滤，收集结晶。按同法再重结晶一次。结晶于室温中赶尽氯仿（约得50g左右，M.P84.3℃），贮棕色瓶中，干燥低温保存（4℃）。 ②N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）：分析纯。如不纯按下法处理：12g亚甲基双丙烯酰胺，溶于℃丙酮。热滤，滤液慢慢冷至-20℃，结晶析出，砂芯漏斗吸滤，结晶用冷丙酮洗数次，真空干燥。贮棕色瓶，干燥低温（4℃）保存。 （注意：Acr和Bis都是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，应在通风橱内操作。操作者需戴医用乳胶手套） ③N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺（简称TEMED）：密封保存。可用N-二甲基氨基丙腈或三乙醇胺代替，但效果较差。 ④三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）。 ⑤核黄素：避光保存。光聚合催化剂。 ⑥7%醋酸溶液（V/V）。 ⑦0.5%氨基黑10B（C22H13O12N6S3Na3）溶液：用7%醋酸溶液配制。 ⑧0.01%溴酚蓝溶液。 ⑨蔗糖。 ⑩PH8.4硼酸缓冲液（0.2mol?L-1硼酸盐）。 四、操作步骤： 1．贮备液的配制：按表15-2配制A、B、C、D、E、F各贮备液： 表15-2 贮备液配制
上述各贮备液都需冷藏（4℃）。尤其是C、D两贮液，由于Acr及Bis易水解生成丙烯酸和NH3，冷藏也只能保存1―2月。如PH超过5.2，即失效。 2．凝胶的制备： （1）将内径0.5cm的玻管切成7―10cm长，切口磨光，洗液浸泡后，水洗净烘干。 （2）分离胶的制备及预电泳：于一小三角烧瓶内，按A∶C∶H2O∶E=1∶2∶4.6∶0.4（V/V）加入各贮液，摇匀，抽气（水泵或油泵）10分钟，将此胶液装入玻管2/3高度（玻管直立，下端插入制胶架凹横内凹槽内事先加入F液1―2滴）。表面覆盖少量蒸馏水，以隔绝空气并使胶面平整。用日光灯照射20分钟，刚加水覆盖时，可看出界面，后界面逐渐消失，聚合完成后，界面又重新出现，再静置30分钟使聚合完成。胶液凝聚后，用小滤纸条，小心吸去表面水分。 分离胶的预电泳（此步操作根据实验的需要决定取舍）：凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品（如酶）会造成钝化或引起其它人为效应。因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，这步称为“预电泳”。若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳步骤更为必要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。 预电泳步骤：小心地拔出玻璃管，用滤纸吸干（不要直接接触胶面）后，用分离胶缓冲液（即不含TEMED的A液）洗涤一下。把玻璃管插入电泳装置中，塞紧橡皮塞上下电极槽中加入分离胶缓冲液，玻璃管下端不得有气泡，预电泳用3毫安/管，30分钟―2小时。 预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。如不用预电泳也可采用加1―5%巯基乙醇或二巯基苏糖醇到缓冲液和样品中来抵消过硫酸铵的氧化作用。预电泳后，凝胶管含少量缓冲液，并用液体石腊封住，在4℃可贮藏几天。取用时，用注射器吸去液体石腊。 （3）浓缩胶（又称成层胶）的制备：于一小三角烧瓶内按B∶D∶E∶H2O=1∶2∶0.5∶4.5（V/V）比例加入各贮液，混合后，抽气，加到玻管中分离胶的上面，高度约1cm，表面覆盖一层水，然后距日光灯10cm处进行光照，正常情况下，照射几分钟后，则凝胶液由淡黄色变成乳白色，表明聚合开始，继续照射30分钟，使聚合完全。凝聚后吸去表面水分。浓缩胶层应临用前制备。 3．样品的准备 聚丙烯酰胺盘状电泳可用以分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清（参看图15-3）、唾液（参看图15-4）、细胞膜蛋白、动植物及微生物的各种蛋白提取液、昆虫的体液、各种酶制品及核糖核酸等。初学者可采用血清样品练习操作。
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