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【求助】考马斯亮蓝G-250制作标准曲线
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这个帖子发布于7年零210天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请教：用考马斯亮蓝G-250制作标准曲线，牛血清白蛋白浓度0.02mol/l，用移液管分别取1，2，3，4，5ml，自配考马斯亮蓝溶液，加样后室温放置3-5min，样品每个点做3个平行，杯子每次用完用酒精洗干净，石英和玻璃的比色皿我都用过，做了很多遍，结果差不多：数据在0.1-0.6之间，相关系数最高只能达两个9，且多组平行样RSD&2（实验要求相关系数达三个9，RSD&2）。请教一下各位是否有什么地方该注意的我没注意到，万分感激！！
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五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格：管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
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lk9908 您好 感谢您的回复 在操作中您所回复的一些注意点我都已经注意到 可是我做了很多遍始终都没达标
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我的也一直是2个9.没有达到3个9.你试试比色皿不用酒精洗，直接润洗。而且放置10min。
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edda601 我的也一直是2个9.没有达到3个9.你试试比色皿不用酒精洗，直接润洗。而且放置10min。谢谢 我试过的 也是两个9
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lk9908 五、考马斯亮兰法（Bradford法）（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用 g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支（三）操作方法1. 标准方法（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5.0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。（2）加完试剂2~5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。考马斯亮兰法实验表格：管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 (1.0mg/ml)未知蛋白质 0.02 0.04 0.06 (约1.0mg/ml)蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.08 0.06 0.04 考马斯亮蓝G－250试剂 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 每管中的蛋白质量（mg）光吸收值（A595） （3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。2. 微量法当样品中蛋白质浓度较稀时（10－100mg/ml）,可将取样量（包括补加的水）加大到0.5ml或1.0ml, 空白对照则分别为0.5ml或1.0ml H2O, 考马斯亮蓝G－250试剂仍加5.0ml, 同时作相应的标准曲线，测定595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。lk9908 您好 感谢您的回复 在操作中您所回复的一些注意点我都已经注意到 可是我做了很多遍始终都没达标
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这个实验的原理很简单，但是能影响结果的因素太多。个人觉得如果你方法上没问题，不妨校正下仪器，在测数据前最好做个BASELINE消除本底误差~~
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实验三 蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝 G250 染色法
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实验三 蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝 G250 染色法
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摘要 : 1、选择应用考马斯亮蓝方法测蛋白质量，做BSA标准曲线步骤时已经测得梯度蛋白量的吸光值。想求助：在excel中怎样做标准曲线。2、如何测BSA的标准曲线?配置BSA标准溶液时，需要精确浓度到小数点后四位吗?
1、选择应用考马斯亮蓝方法测量，做BSA标准曲线步骤时已经测得梯度蛋白量的吸光值。想求助：在excel中怎样做标准曲线。
Q1、很简单的，将放在一列，相应的吸光度放在一列，将两列选中后，选择插入图形，选散点图，然后在插入的图形上的点右击选择添加趋势线，并勾选显示公式和R值，即可得到方程式。
Q2、用梯度量和吸光值先做出散点图，然后点击选中直线，在直线处点击鼠标左键，出现&添加趋势线&，点击进入，在&类型&菜单中选择&线性&，在&选项&菜单中选择&显示公式&&显示R2值&，点击&确定&，图中即出现线性方程和R2，此方程即为标准曲线方程。
2、如何测的标准曲线?标准溶液时，需要精确浓度到小数点后四位吗?
一般3个9以上就可以了，我们一般认为99.98%就足够。
可以的，要注意几点，一个是配置高浓度原液，而后在其基础上稀释；二是充分震荡，每个步骤都要充分震荡；三要选择比较好的蛋白测定，能用进口的就不要用国产的!
3、为什么BSA可以用来做标准曲线而不是选其他蛋白?
Q1、68KD。BSA用的多主要是便宜，其他一些纯蛋白是非常贵的，差价几万倍都是可能的。
4、BSA是否每次做标准曲线都要重配?
Q1、不用，你可以一批配100ml，然后分装成小管冻存起来，以后每次用的时候取一只，这样可以避免多次配置所产生的差异，使用也方便
Q2、书上写一般情况下都是要做标曲的,但是不做的话差别也不是太大,但是要精确的话还是得做标曲.
5、我用考马斯亮蓝染色的方法作BSA标准曲线，怎么也做不出来!4mg/ml,5mg/ml,6mg/ml,7mg/ml,8mg/ml,10mg/ml的 bsa在595nm下的吸光值没有明显的区别，还出现浓度越大，吸光值越小的现象，真是令我哭笑不得，请高手指点，谢谢!
Q1、1,看看你的考马斯亮蓝是否配的有问题，注意配好后必须用慢速滤纸过滤，保证滤液中没有蓝色沉淀(会影响OD595)。
2，你的BSA浓度太高了，测定是OD595会很大。在测定光吸收时，测量值的准确度数范围是：0.1-0.3。读数大于0.5时就不准了。
3，BSA要现用现配，不可久放。
以下测量方法仅供参考：
取21支试管做三组平行(每组7支)：
向7支试管中依次加入：
(1)各5ml；
(2)分别加入0.15mol的NaCl 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 0.05, 0.04ml；
(3)分别加入1.0mg/ml的新配的BSA 0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06ml；
混匀后，在595nm处测光吸收，读数大部分在0.1-0.3之间。
注意最好在加入BSA 5-20min内测完，此时间内颜色最稳定。
然后三组求平均，用蛋白含量对OD595作图，线性拟合后，一般得到直线的R&0.99,严格要求应使R&0.999.
在测量蛋白浓度时，可先将其稀释为0.5-2mg/ml 左右，加入0.02-0.08ml；即可得到一个较好的读数(一般在0.1-0.3之间)。
Q2、你的标准曲线范围有问题,BSA浓度从0.1~1mg范围内选择,那样的浓度都是超出量程的,测了也没用.还有,机器的量程是多少你没说,吸光值在0.1~1范围内还是比较准确的,这还是进口设备,国产的量程有效范围更窄.自己重新设计实验吧
作者：keeii 点击：次
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