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酶解法制备原生质体的原理是利用酶溶液对细胞壁成分的降解作用。蜗牛酶液从蜗牛(以植物为食)消化腺中提取；果胶酶、纤维素酶从微生物中提取。为了研究不同酶液的酶解效果，某实验小组取无菌烟草幼叶，切成相同大小的小片，等量放入6支试管中，试剂用量和实验结果列于下表。请回答有关问题。(注：“+”越多表示绿色越深，“-”表示颜色无显著变化)
(1)实验过程中，需要轻摇试管，其目的是________使原生质体从叶小片中游离出来，以便观察悬浮液绿色的深浅。(2)从绿色的深浅可推测：蜗牛酶液酶解效果最好，原因是蜗牛酶液含有_____等多种酶。该实验中____是空白对照组，其设置意义是___________。(3)用网筛过滤原生质体到离心管内，离心后收集沉淀物，并用_________洗涤。(4)原生质体是否符合要求还需进行检验，其检验的方法是________________。
题型：实验题难度：偏难来源：江苏高考真题
(1)为了使细胞壁与酶充分接触，提高酶解效果(2)果胶酶和纤维素酶&&&Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ& 排除无关变量的干扰(3)等渗溶液(4)低渗涨破法
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据魔方格专家权威分析，试题“酶解法制备原生质体的原理是利用酶溶液对细胞壁成分的降解作用。..”主要考查你对&&各种酶的作用，细胞的吸水和失水，科学研究方法&&等考点的理解。关于这些考点的“档案”如下：
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各种酶的作用细胞的吸水和失水科学研究方法
酶：酶（enzyme）催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。具有催化效率高、专一性强、作用条件温和等特点。常见酶：（1）淀粉酶：作用是催化淀粉水解为麦芽糖。按其产生部位分为唾液淀粉酶、胰淀粉酶、肠淀粉酶和植物淀粉酶。（淀粉遇碘变蓝） （2）麦芽糖酶：作用是催化麦芽糖水解成葡萄糖，主要分布在发芽的大麦中。（3）蔗糖酶：作用是催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，主要分布在甘蔗等生物体内。（4）脂肪酶：作用是催化脂肪水解为脂肪酸和甘油。在动物体内分为胰脂肪酶和肠脂肪酶等。在动物的胰液、血浆和植物的种子中均有分布。（5）蛋白酶：作用是催化蛋白质水解为短肽。在动物体内分为胰蛋白酶和胃蛋白酶等。在动物的胰液、胃液，植物组织和微生物中都有分布。（6）纤维素酶：作用是催化纤维素水解成葡萄糖。在真菌、细菌和高等植物中含有。 （7）溶菌酶：广泛存在于动植物、微生物及其分泌物中，能溶解细菌细胞壁中的多糖，可使细菌失活。还可激活白细胞的吞噬功能，增强机体抵抗力。（8）固氮酶：能使大气中的氮还原为氨，由两种含金属的蛋白质组成，一种为铁蛋白，另一种为钼铁蛋白。根瘤菌、蓝藻和土壤中各种固氮菌中都含有此酶。（9）限制酶―磷酸二酯键、解旋酶―碱基间氢键、ATP水解酶―高能磷酸键、蛋白酶―肽键。细胞的吸水与失水： 1、渗透作用：水分子或其他溶剂分子通过半透膜的扩散。2、发生渗透作用的条件：具半透膜，两侧溶液具有浓度差。3、植物细胞的吸水与失水 (1)植物细胞就相当于渗透装置。&&原生质层：细胞膜和液泡膜以及两层膜之间的细胞质，相当于半透膜。 (2)植物细胞通过渗透作用吸水和失水。植物细胞的质壁分离：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 4、动物细胞的吸水和失水 (1)细胞膜相当于半透膜，浓度差由外界溶液浓度与细胞质的浓度来体现。(2)水分子是顺相对含量的梯度进出动物细胞的。①外界溶液浓度小于细胞质浓度时，细胞吸水膨胀。②外界溶液浓度大于细胞质浓度时，细胞失水皱缩。③外界溶液浓度等于细胞质浓度时，水分子进出细胞处于动态平衡。 知识点拨： 1、细胞吸水或失水的多少取决于细胞膜两侧溶液中水的相对含量的差值。 2、植物分生区细胞和干种子细胞因无大液泡不能发生渗透作用，只能依靠吸胀作用吸水。 3、植物细胞的吸水和失水：①渗透作用：是指溶液中的溶剂分子通过半透膜扩散的现象。渗透吸水是指由于溶质势的下降而引起的细胞吸水。含有液泡的细胞吸水，如根系吸水、气孔开闭时的保卫细胞吸水主要为渗透吸水。②吸涨吸水：指依赖于低衬质势而引起的吸水。对于无液泡的分生组织和干燥种子来说，衬质势是细胞水势的主要成分。亲水胶体吸引水分子的力量称为吸胀力，亲水胶体吸水膨胀的现象叫吸胀作用。细胞吸胀力的大小，取决于衬质势的高低。干燥种子衬质势常低于-10MPa，有的甚至达到-100MPa，所以吸胀吸水就很容易发生。当种子吸水后，衬质势很快上升。如将种子放在纯水中，当种子吸水达到最大程度时，衬质势为0。由于吸胀过程与细胞的代谢活动没有直接关系，所以又把吸胀吸水称为非代谢性吸水。③降压吸水是指由于压力势降低而引发的细胞吸水。如蒸腾旺盛时，木质部导管和叶肉细胞的细胞壁都因失水而收缩，使压力势降低，从而引起这些细胞水势下降而吸水。链接“植物细胞间的水分移动”4、植物根系对水分的吸收： ①植物根系吸水的部位：根系吸水的部位主要在根的尖端，从根尖开始向上约10mm的范围内，包括根冠、根毛区、伸长区和分生区，其中以根毛区的吸水能力最强。②植物根部吸水的途径：植物根部吸水主要通过根毛、皮层、内皮层，再经中柱薄壁细胞进入导管。水分在根内横向运输有质外体和共质体两条途径。5、根系吸水的机理根据植物根部的吸水动力的不同可分为两类：主动吸水和被动吸水。①主动吸水：由植物根系生理活动而引起的吸水过程称为主动吸水，它与地上部分的活动无关。根的主动吸水主要反映在根压上。所谓根压，是指由于植物根系生理活动而促使根部吸收水分并使液流从根部上升的压力。大多数植物的根压为0.10～0.2MPa，有些木本植物可达0.6～0.7MPa。伤流和吐水是证明根压存在的两种现象。②被动吸水：植物根系以蒸腾拉力为动力的吸水过程称为被动吸水。所谓蒸腾拉力(teanspirationlpull)是指因叶片蒸腾作用而产生的使导管中水分上升的力量。但叶片蒸腾时，气孔下腔周围细胞的水以水蒸气形式扩散到水势低的大气中，从而导致叶片细胞水势下降，这样就产生了一系列相邻细胞间的水分运输，使叶导管失水，压力势下降，造成根冠间导管的压力梯度，使根导管中的水分向上运输，其结果造成根部细胞水分亏缺，水势降低，向土壤吸水。细胞吸水和失水的原理的应用： 1、对农作物的合理灌溉，既满足了作物对水分的需要，同时也降低了土壤溶液的浓度，有利于水分的吸收。2、盐碱地中的植物不易存活或一次施肥过多造成“烧苗”现象，都是因为土壤溶液浓度过高，甚至超过了根细胞液浓度，导致根细胞不易吸水甚至失水造成的。3、糖渍、盐渍食品不易变质的原因，是在食品外面和内部形成很高浓度的溶液，使微生物不能在其中生存和繁殖，所以能较长时间的保存。 科学研究方法：1、假说——演绎法①提出假设②演绎就是推理③实验验证假设和推理④得出结论2、同位素示踪法：同位素示踪法是利用放射性核素或稀有稳定核素作为示踪剂对研究对象进行标记的微量分析方法3、科学的研究方法包括：归纳法、类比推理法、实验法和演绎法。①归纳法：是从个别性知识，引出一般性知识的推理，是由已知真的前提，引出可能真的结论。它把特性或关系归结到基于对特殊的代表（token）的有限观察的类型；或公式表达基于对反复再现的现象的模式（pattern）的有限观察的规律。②类比推理法：类比推理这是科学研究中常用的方法之一。类比推理是根据两个或两类对象有部分属性相同，从而推出它们的其他属性也相同的推理。简称类推、类比。它是以关于两个事物某些属性相同的判断为前提，推出两个事物的其他属性相同的结论的推理。③实验法：通过试验的论证得出所需数据，进行分析后得出结论。分为：化学物质的检测方法；实验结果的显示方法；实验条件的控制方法；实验中控制温度的方法④演绎法：从普遍性结论或一般性事理推导出个别性结论的论证方法。演绎法得出的结论正确与否，有待于实践检验。它只能从逻辑上保证其结论的有效性，而不能从内容上确保其结论的真理性。也可以从逻辑思维，逆向思维和想象思维延伸到其结论该以反证明。4、实验必须遵守的原则：①设置对照原则：空白对照；条件对照；相互对照；自身对照。②单一变量原则；③平行重复原则5、实验的特性：对照，统一性质。提出问题；设计方案；讨论结果；分析问题。分为科学实验；验证性实验；对照实验等。知识拓展：1、生物学的历史研究进展和相关实验的叙述。（1）孟德尔的假说——演绎法叙述①提出假设（如孟德尔根据亲本杂交实验，得到F1，Aa这对基因是独立的，在产生配子时相互分离。这里假设的是一对等位基因的情况）；②演绎就是推理（如果这个假说是正确的，这样F1会产生两种数量相等的配子，这样测交后代应该会产生两种数量相等的类型）；③最后实验验证假设和推理（测交实验验证，结果确实产生了两种数量相等的类型）；④最后得出结论（就是分离定律）（2）遗传物质验证的三个实验：肺炎双球菌的转化实验；噬菌体侵染细菌的实验；烟草花叶病毒的重组实验（3）酶发现过程中的实验：①1777年，苏格兰医生史蒂文斯从胃里分离一种液体（胃液），并证明了食物的分解过程可以在体外进行。②1834年，德国博物学家施旺把氯化汞加到胃液里，沉淀出一种白色粉末。除去粉末中的汞化合物，把剩下的粉末溶解，得到了一种浓度非常高的消化液，他把这粉末叫作“胃蛋白酶”（希腊语中的消化之意）。同时，两位法国化学家帕扬和佩索菲发现，麦芽提取物中有一种物质，能使淀粉变成糖，变化的速度超过了酸的作用，他们称这种物质为“淀粉酶制剂”（希腊语的“分离”）。科学家们把酵母细胞一类的活动体酵素和像胃蛋白酶一类的非活体酵素作了明确的区分。③1878年，德国生理学家库恩提出把后者叫作“酶”。④1897年，德国化学家毕希纳用砂粒研磨酵细胞，把所有的细胞全部研碎，并成功地提取出一种液体。他发现，这种液体依然能够像酵母细胞一样完成发酵任务。这个实验证明了活体酵素与非活体酵素的功能是一样的。因此，“酶”这个词现在适用于所有的酵素，而且是使生化反应的催化剂。由于这项发现，毕希纳获得了1907年诺贝尔化学奖（4）生长素的发现实验：植物的向光生长和胚芽鞘实验2、同位素示踪方法的应用，使人们可以从分子水平动态地观察生物体内或细胞内生理、生化过程，认识生命活动的物质基础。例如，用C、O等同位素研究光合作用，可以详细地阐明叶绿素如何利用二氧化碳和水，什么是从这些简单分子形成糖类等大分子的中间物，以及影响每步生物合成反应的条件等。3、放射性同位素示踪技术，是分子生物学研究中的重要手段之一，对蛋白质生物合成的研究，从DNA复制、RNA转录到蛋白质翻译均起了很大的作用。最近邻序列分析法应用同位素示踪技术结合酶切理论和统计学理论，研究证实了DNA分子中碱基排列规律，在体外作合成DNA的实验：分四批进行，每批用一种不同的32P标记脱氧核苷三磷酸，32P标记在戊糖5'C的位置上，在完全条件下合成后，用特定的酶打开5'C－P键，使原碱基上通过戊糖5'C相连的32P移到最邻近的另一单核苷酸的3'C上。用最近邻序列分析法首次提出了DNA复制与RNA转录的分子生物学基础，从而建立了分子杂交技术，例如以噬体T2-DNA为模板制成[32P]RNA，取一定量T2-DNA和其它一些DNA加入此[32P]RNA中，经加热使DNA双链打开，并温育，用密度梯度离心或微孔膜分离出DNA-[32P]RNA复合体测其放射性，实验结果只有菌体T2的DNA能与该[32P]RNA形成放射性复合体。从而证明了RNA与DNA模板的碱基呈特殊配对的互补关系，用分子杂交技术还证实了从RNA到DNA的逆转录现象。4、放射性同位素示踪技术对分子生物学的贡献还表现在：a、对蛋白质合成过程中三个连续阶段，即肽链的起始、延伸和终止的研究；b、核酸的分离和纯化；c、核酸末端核苷酸分析，序列测定；d、核酸结构与功能的关系；e、RNA中的遗传信息如何通过核苷酸的排列顺序向蛋质中氨基酸传递的研究等等。为了更好地应用放射性同位素示踪技术，除了有赖于示踪剂的高质量和核探测器的高灵敏度外，关键还在于有科学根据的设想和创造性的实验设计以及各种新技术的综合应用。
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纤维素酶纯化方法与原生质体的制备
安徽农业科学．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｈｕｉＡｇｒｉ．Ｓｃｉ．２００５，３３（６）：１１４７—１１４８责任编辑孙红忠责任校对孙红忠纤维素酶纯化方法与原生质体的制备
左红梅，任大明。（沈阳农业大学生物技术学院生物工程重点实验室，辽宁沈阳１１０１６１）
摘要以绿色木霉为材料，经稻草粉固体发酵、浸提得纤维素酶粗酶液，然后经硫酸铵分级沉淀，超滤，ＳｅｐｈａｄｅｘＧ．７５柱层析３种方法纯化，利用得到的纤维素酶，分别制备幼嫩番茄叶片的原生质体。结果发现高度纯化的纤维素酶几乎得不到原生质体，而经超滤后的纤维素酶制备原生质体效果最佳。
关键词纤维素酶；原生质体；番茄叶片
中图分类号ｓ５３９＋．３文献标识码Ａ文章编号０５１７—６６１１（２００５）０６一ｉ１４７—０２
ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＰｕ—ｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌｕｌａｓｅａｎｄＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
ＺＵＯＨｏｎｇ－ｍｅｉｅｔａｌ（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｈｅｎｙａｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＬｉａｏｎｉｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ，
Ｌｉａｏｎｉｎｇ１１０１６１）
ＡｂｓｔｒａｃｔＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅｗａｓｕｓｅｄａｓｔｈｅｍａｔｅｒｉａｌｉｎｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｃｅｌｌｕｌａｓｅｗａｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｓｏｌｉｄｓｔａｔｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｓｔｒａｗｐｏｗｄｅｒａｎｄｃｒｕｄｅｃｅｌｌｕｌａｓｅｗａｓｇｏｔｔｅｎｂｙｉｍｍｅｒｔｉｏｎ，ｔｈｅｎｂｙｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ一（ＮＨ４）２Ｓ０４ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ，ｕｈｒａｆｉｌｔｅｒａｎｄＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｒｅｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｗｅｒｅｄｏｎｅｓｅｐａｒａｔｅｌｙｆｏｒｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆｔｈｅｙｏｕｎｇｔｏｍａｔｏｌｅａｖｅｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｔｈａｔｔｈｅｈｉｇｈｐｕｒｉｆｉｅｄｃｅｌｌｕｌａｓｅｇｏｔｌｅｓｓｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓａｎｄｃｅｌｌｕｌａｓｅｂｙｔｈｅｕｌｔｒａｆｉｈｅｒｈａｄｔｈｅｂｅｓｔｅｆｆｅｃｔ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＣｅｌｌｕｌｏｓｅ；Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ；Ｙｏｕｎｇｔｏｍａｔｏｌｅａｆ
以绿色木霉为材料，经固体发酵得纤维素酶，经过３种浸提，制得纤维素酶液，加固体硫酸铵至３０％饱和度，４℃处理，得到纯度不同的纤维素酶，用于分离番茄幼嫩叶片的放置３０ｍｉｎ后，离心１０ｍｉｎ，取上清液，再加入固体硫酸铵原生质体，旨在探讨植物细胞脱壁酶的制备方法和应用效果。至８０％饱和度，４℃放置过夜，离心２０ｍｉｎ，沉淀用蒸馏水１材料与方法溶解后，装入透析袋中充分透析，得纤维素酶粗酶液。然后，１．１材料测定纤维素酶及辅助酶和有害酶的活力。处理②：将处理①
绿色木霉：沈阳农业大学生物技术学院生物工程教研粗酶液，经中空纤维膜组件（截留分子量为２万）超滤，除去室保存菌种。超滤装置：中空纤维膜组件，天津膜天膜工程了一定量的小分子的杂蛋白及色素，使纤维素酶进一步纯技术有限公司产品。化。同时测定纤维素酶及辅助酶和有害酶的活力。处理③：１．２方法将处理②超滤液，加入预先用浓度Ｏ．０５ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ值５．Ｏ柠１．２．１各种酶活力的测定。纤维素酶活力（ＦＰＡ）：参照檬酸缓冲液平衡好的ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱上，用同一缓冲液洗Ｍａｎｄｅｌｓ［ｎ，蒋传葵ＤＮＳ法闭。ＣＭＣ酶活力：取适当稀释浓度脱，从出峰开始收集，每管１０ｍｌ，测各个管中洗脱液的３种的酶液０．５ｍｌ，加含０．５１％ＣＭＣ、ｐＨ值５．０的柠檬酸缓冲液酶活（ｃ，酶活力，ｃ。酶活力，Ｂ－葡萄糖苷酶活力）。
１．５ＩＩｌｌ，５０℃保温３０ｍｉｎ，以下的测定步骤同ＦＰＡ测定法。ｃ，１．２．３番茄原生质体的制备。将上述３种处理的纤维素酶酶活力：取适当稀释浓度的酶液０．５ＩＩｌｌ，加入１．５Ｉｌｌｌ，ｐＨ值稀释成不同浓度，但具有相同的滤纸酶活力。然后，取一定５．０的缓冲液，加脱脂棉５０ｍｇ，４５ｏＣ保温２４ｈ，以下的测定量（０．５ｇ）幼嫩番茄叶片，用浓度７５％的酒精消毒，再用无菌步骤同ＦＰＡ测定法。Ｂ．葡萄糖苷酶［３１：用０．５％水杨苷作底水冲洗。加入含０．７ｍｏｌ／Ｌ甘露醇的上述３种处理的纤维素物（配制在ＤＨ值４．５，浓度０．０５ｍｏ札柠檬酸缓冲液），５０℃酶液１．６ｍｌ，用无菌过滤器进行过滤，得到无菌酶液，于２８
ｍｉｎ，采用ＤＮＳ法测定还原糖的生成量，酶活单位℃保温３ｈ，取出叶片，得原生质体。用移液枪取约４０仙ｌ原同滤纸酶。半纤维素酶活力［４】：取适当稀释浓度的酶液０．５生质体悬液于血球计数板上，用相差显微镜观察原生质体
温１５ｍｉｎ，９５％乙醇终止反应，采用地衣酚铜法测定戊糖生２结果与分析
ｈ生成１ｐ。ｍｏｌ木糖所需酶量定义为２．１纤维素酶经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析的分离纯化由图
１个活力单位。－果胶酶活力舟：ＤＮＳ法测半乳糖醛酸的生成１可见，经柱层析后纤维素酶３种主要酶活力较集中，纤维
ｈ由底物产生ｌＩｘｍｏｌ半乳糖醛酸所需的酶量定义为１素酶各组分基本没有被分开，由于纤维素酶属复合酶类，相
ｈ分解酪蛋白互之间有一定的作用。收集纤维素酶３种活力较集中处的
Ｉ．Ｌｍｏ］酪氨酸的酶量定义为１个酶活单位。核糖核酸洗脱液（３０～６０ｍ１），然后浓缩，测定纤维素酶及辅助酶和有
ｍｌ酶液，加入１ｍｌ浓度０．５％核糖核酸，３７℃害酶的活力。
ｍｉｎ，加入１ｍｌ浓度１２．５％钼酸铵溶液沉淀（４℃），２．２３种处理纤维素酶、辅助酶和有害酶活力测定结果表
１表明，只经硫酸铵沉淀后的酶液，辅助酶及有害酶含量均
较高，纤维素酶活力较低，酶的纯化效果一般。经过超滤
后，酶被纯化，纤维素酶活力升高，蛋白酶含量明显下降，
其余酶类有不同程度下降，但果胶活力变化不大，说明果胶
作者简介左红梅（１９７３一），女，辽宁沈阳人，硕士研究生，从事酶化学
与酶工程研究。＊通讯作者，博士，副教授。酶被截留。经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５柱层析后，辅助酶和有害酶的万　方数据１活力均有下降，纤维素酶活力升高，纤维素酶被进一步纯化。保温３０ｍ１，加含０．５％半纤维素的醋酸缓冲液（ｐＨ值４．４），４０℃保成量。在上述条件下，１量。１个酶活单位。蛋白酶活力：Ｆｏｌｉｎ一酚显色法［６１，１产生１酶活力：取１保温１０离心后取上清液，稀释１倍，在２６０ｎｍ比色，酶活力以在上述条件下的光密度数值表示。１．２．２纤维素酶液的处理。处理①：稻草粉经固体发酵后，收稿日期２００５－０４—１
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