ELISA抗体检测中常见问题及解决方法--《畜禽业》2013年10期
ELISA抗体检测中常见问题及解决方法
【摘要】：正ELISA是监测免疫抗体的国际标准方法,具有敏感性高,特异性强,结果判断较客观,既可以做定性试验也以做定量分析。但同时存在操作繁琐,影响因素多的不足,笔者从事兽医实验室抗体监测工作多年,现就实验中遇到过的常见问题进行分析总结,以提高ELISA的实验质量。供同行们参考。1常见问题1.1试剂的问题1.1.1用试剂已过有效期,或不同试剂盒组分混用;在试剂盒保存过程中没有按规定保存,受高温影响;标准品中可能不含强阳性标本;厂家试剂质量的变化等。1.1.2试剂、样品用前未平衡至室温;蒸馏水质有问题;待检样品放置时间过长,样品受到污染等。1.1.3移液嘴重复使用,未洗净或消毒不完全等。以上几种情况会出现白板(显色步骤结束后,酶标反应板所有孔均无显色)、显色弱,灵敏度低、假阳性等现
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：S854.43【正文快照】：
ELISA是监测免疫抗体的国际标准方法,具有敏感性高,特异性强,结果判断较客观,既可以做定性试验也以做定量分析。但同时存在操作繁琐,影响因素多的不足,笔者从事兽医实验室抗体监测工作多年,现就实验中遇到过的常见问题进行分析总结,以提高ELISA的实验质量。供同行们参考。1常
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这个帖子发布于12年零147天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位，有几个ELISA方面的问题想请教：
1．我用基因在原核表达系统与杆状病毒表达系统中的表达产物为抗原进行间接ELISA，在同一血清稀释度下，前者的测定OD值随抗原稀释度的升高而递减，后者则是随抗原稀释度的升高而递增（即：抗原1：10，000稀释时与同一血清反应的OD值比1：100稀释时的还高，我觉得很奇怪，应该说OD值是与抗原的量有关的，为什么抗原越少，OD值反而越高呢？是否是与抗原在总蛋白中所占的比例有关，原核表达产物在总蛋白中占40%多，杆状病毒表达产物则只有细胞总蛋的10%左右。各位在实验中遇到过这种情况吗？是否抗原在总蛋白中所占比例太小时，加大稀释度后，非特异性反应会覆盖特异性反应，导致OD值反而上升，但是抗原稀释度升高时，非特异性抗原也是相应减少了呀。
2．在建立一个ELISA检测方法时，判断阴阳性的临界值标准应该怎么样确定最合理？我所看到的文献中临界值的确定篇篇各不一样，有用OD值来判定的，有用S/P值（待测样品值/标准阴性样品值）来判定的，还有将待测抗体同时与阴性、阳性抗原反应，用（待测样品阳性孔值-待测样品阴性孔值）/（标准样品阳性孔值-标准样品阴性孔值）来判断的，我觉得用OD值来判断可能误差较大，第三种方法又烦琐。第二种稍好一点，但也有用S/P值，或是（待测样品OD值-标准阴性样品OD值/标准阳性样品OD值-标准阴性样品OD值）的。有没有这方面的专家给个建议，哪种判定方法既简便又可靠。另外，可疑区的设定是必须的吗？
3．在建立一个新的ELISA方法时，与现有的诊断方法方法的符合率达到多少才算有应用价值呢？
4．有没有ELISA方面的专业书籍推荐一下。
恳请各位免疫学方面的高手赐教！多谢！
回复： ELISA实验
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怎么没有人回应，好失落呀！
回复： ELISA实验
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&&&&&&我没做过表达产物的ELISA，但可以做点猜测。你的表达产物是否做了纯化？或者说你是否用未插入目的基因的表达产物做对照，看是不是表达系统本身对反应有影响。
&&&至于ELISA阴性和阳性的判断标准，没有严格和统一的标准。这主要要看你与经典测定方法做比较后定标准。作为诊断疾病用的ELISA，还应该与经典检测方法一起对病理模型进行比较检测，如检测抗体波动等，然后才能做出判断标准。当然，试验过程中，可以暂时以借用经典方法的判断标准。
回复： ELISA实验
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&&&&谢谢nothing！表达产物我没有纯化过，表达系统本身对ELISA肯定是有影响的，但我在封闭体系中已经加过空载体的表达产物来消除这一影响了。
&&&关于判断标准，你的意思是说以经典的方法为参考，选择能够使自己的结果与其达到最大一致性的判断方法吗？
回复： ELISA实验
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用空载体表达产物做封闭不好，其实是把这些东西先于表达产物包被在板子上，不如不做。消除非特异性免疫反应的一个方法是用菌体的丙酮干燥物对待测血清进行吸附预处理，这种方法可以在“精编分子生物学实验技术指南”（红皮书）中见到描述。
回复： ELISA实验
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不是，我是将表达产物作为抗原包被，4度吸附过夜后再封闭。如果按照您所说的方法，在实际的检测中工作量可能会增加太多，因为我是以表达产物为抗原检测血清中的抗体。不可能每一份血清都去做吸附。
回复： ELISA实验
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&&&&&&关于判断标准，我的意思是：在试验过程中，先以经典方法的判断标准为参考，然后再根据其对病理模型抗体波动监测，以及对一定样本量待检血清的检测结果与病例实际所处隐性感染、潜伏期、急性期、康复期等不同情况的符合程度，来综合确定一个你所建立的该病的ELISA诊断方法的标准。
&&&譬如说，经典方法的标准是血清稀释度为1：64判断为阳性（抗原定量），1：256判断为急性感染，那你做ELISA的时候，可先借用这样的判断标准。一般而言，ELISA要比经典方法要灵敏一些，也就是说，根据第一段所说的方法进行后，你可能最后把1：128作为你的阳性标准，把1：256甚至1：512作为急性感染期的判断标准。
回复： ELISA实验
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多谢nothing指点！
回复：ELISA实验
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我想问下，假如用提纯病毒包板子，临界值怎么确定呢？
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【求助】请问ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定？
【求助】请问ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定？
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这个帖子发布于4年零34天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
请问： （1）ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定的？老师们都说先做预实验，做几个稀释倍数然后确定哪个最合适，请问确定合适的标准是什么，如何知道哪个稀释倍数就是最合适的呢？（2）还有一个问题就是空白对照孔取几个？作用是什么？因为是第一次做，很多地方都搞不明白，谢谢各位老师解答。
回复：【求助】请问ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定？
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稀释后OD值在0.1-2之间,在中间的是最合适的,或者是试剂盒标准曲线线性范围内,越靠近中间的越好
回复：【求助】请问ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定？
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谢谢您的回答。
回复：【求助】请问ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定？
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你用什么方法呀？我用竞争法，测试OD在1.0左右比较好
回复：【求助】请问ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定？
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我用的是双抗体夹心法 谢谢你的解答
回复：【求助】请问ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定？
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你稀释样本是为了什么呢？是确定试剂盒吗？空白是为了消除其他物质的吸光度干扰！
回复：【求助】请问ELISA实验时血浆样品稀释倍数如何确定？
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稀释样本还可以排除样品内其他杂质所造成的影响，当稀释值与原样都在合适的吸光度内，有时稀释后的值比为稀释的值还要大，是因为样品中杂质的干扰，所以很有必要找到一个能使样本中的杂质干扰达到最低的合适稀释倍数
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