转入大肠杆菌质粒还可以提取转入农杆菌转化?...

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【求助】、农杆菌质粒提取
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这个帖子发布于10年零314天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
质粒酶切鉴定过,我现在已经转到农杆菌(LBA4404)中了,想提取质粒再鉴定一下是不是转到农杆菌中了!但是听师兄说直接从农杆菌中提取的质粒很少,酶切可能鉴定不到。但也听过有人直接从农杆菌中提取质粒酶切鉴定。我想问一下从农杆菌提取质粒和从大肠杆菌中是不是一样,农杆菌要培养多长时间再提取,用试剂盒提取按照说明书就能提出来吗?
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《分子克隆》有的整个过程都是在“听说”,自己做了会发现只是一个很简单的过程,与大肠杆菌质粒提取一样简单
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农杆菌28度3天,提大肠杆菌的kit就行
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我不知道陋室品茗和rockmao是否真的做过农杆菌质粒的抽提试验,就我本人的经验来说,从农杆菌中可以抽出质粒,但绝对做不了酶切试验,原因是:1,量太少,主要是菌裂解困难,以及农杆菌双元载体携带的是低拷贝复制子。2,杂质太多,酶切后呈现smear带,无法判断是否有目标基因。因此,必须把农杆菌中抽出的质粒产物重新电转化到 E.coli中,再抽出质粒作酶切验证。楼主也可以用PCR方法验证农杆菌中抽出的质粒产物是否含有你的目标片断。
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seesky edited on
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做pcr鉴定就可以了!不放心的话,提出来质粒转到大肠中去再提,然后作酶切!
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我的经验是,在1.5ml离心管中收集4.5ml菌液(1.5mlX3次),然后照正常的大肠杆菌质粒提取程序进行,最终溶DNA于20ul,取10ul做酶切,就可以看到酶切条带,记得加RNAseA,否则RNA一大片影响观察.
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我一般用提取大肠杆菌质粒方法获得质粒,再用PCR方法验证
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直接 PCR农杆菌菌液即可。农杆菌都是三抗筛的,除非本身有杂菌一般情况得到的菌落就是阳性菌落
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做个菌落PCR好了,挑菌落到DDW中,98度10MIN,就可以拿个3-5UL左右当模板了,比直接把菌落加到体系94度裂解的效果要好,量很多
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我用Promega的质粒提取试剂盒提的,效果不错,但集菌的量要大,否则质粒浓度很小,做酶切困难。
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smear带是什么意思?DDW是什么东西?我是个新生,告诉我吗,谢谢!
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我也认为直接 PCR农杆菌菌液即可
这样既简单,又能说明问题
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我也认为直接 PCR农杆菌菌液即可
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要用试剂盒,常用的SDS很难
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saixin586 wrote:smear带是什么意思?DDW是什么东西?我是个新生,告诉我吗,谢谢! Answer:smear是弥散的意思,即条带为一片,分不清主带。DDW是ddH2O,双蒸馏水。
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aixin586 wrote:smear带是什么意思?DDW是什么东西?我是个新生,告诉我吗,谢谢! Answer:smear是弥散的意思,即条带为一片,分不清主带。DDW是ddH2O,双蒸馏水。
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我用常规提质粒的方法,提到的量做酶切鉴定是够的,但是会有些杂带
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我用sbs的试剂盒提,结果弥散一片
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农杆菌里面质粒的拷贝数很低黄白色后收集菌体可以提出来,效果不好建议菌落PCR,上PCR前100度10min,效果很好可以做酶切或者测序鉴定
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