质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。目前，质粒已广泛的用作基因工程中目的基因地运载工具—载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA，是一种分子生物学最基本的方法。
质粒的特点：
1 细胞染色体外能自主复制的小型环状DNA分子2
是基因工程中最常用的运输载体3 最常用的质粒是大肠杆菌的质粒4
存在于许多细菌及酵母菌等生物中5 质粒的存在对宿主细胞无影响6
质粒的复制只能在宿主细胞内完成
质粒DNA分离纯化方法有多种，但其原理和步骤都大同小异。本实验着重介绍碱裂解法制备微量DNA。
在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有机层维持稳定。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，获得质粒DNA。
在实验过程中，由于细菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色体DNA容易被切断成为各种大小不同的碎片而与质粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有质粒DNA外，还可能有少部分染色体DNA和RNA，必要时可进一步纯化。
试剂和器材
1. LB 液体培养基
胰蛋白胨10g/L, 酵母浸膏5g/L，NaCl 10g/L,
用NaOH调节至pH7.5，高压灭菌。
2. TEG缓冲液（pH8.0 25mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L EDTA,
50mmol/L葡萄糖，4mg/mL 溶菌酶）
称取0.3g Tris加入0.1mol/L HCl溶液14.6mL，先配制成pH8.0
Tris-HCl缓冲液100mL，再加入0.37g
EDTA·Na2·2H2O和0.99g葡萄糖，临用前加入400mg溶菌酶。
3. 碱裂解液（0.2mmol/L NaOH, 1% SDS）
称取0.8g NaOH和1g SDS定容至100mL
4. 乙酸钾溶液(pH8.0, [K+]=3mol/L, [Ac-]=5mol/L)
取60mL mol/L KAc加入11.5mL冰乙酸和28.5mL蒸馏水
5. 1mol/L pH8.0 Tris－HCl缓冲液
Tris 121.14g/L, 用盐酸调至pH8.0
6. 酚／氯仿（1：1）溶液配制
（1）将商品苯酚置65℃水浴上缓缓加热融化，取200mL融化酚加入等体积的1mol/L
Tris-HCl pH8.0缓冲液和0.2g
(0.1%)8－羟基喹啉，于分液漏斗内剧烈振荡，避光静置使其分项。
（2）弃去上层水相，再用0.1mol/L
Tris－HCl缓冲液pH8.0与有机相等体积混匀，充分振荡，静置分相，留取有机相。
（3）配制氯仿／异戊醇混合液：将24份氯仿与1份异戊醇混合均匀。
（4）等体积的酚和氯仿／异戊醇溶液混合。放置后，上层若出现水相，可吸出弃去。有机相置棕色瓶内低温保存。
7. TE缓冲液(10mmol/L, pH8.0 Tris-HCl, 1mmol/L EDTA)
Tris，加适量蒸馏水溶解，用1mol/L盐酸调至pH8.0并定容至100mL，加入0.037gEDTA·Na2·2H2O。临用前加入核糖核酸酶，为了使RNase制剂中混杂的DNase失活，临用前80℃处理10min。
8. 无水乙醇及70％乙醇。
携带pBR322质粒的大肠杆菌。
试管，Eppendorf管，移液器，恒温振荡器，高速台式离心机，冰块，接种环，旋涡混合器。
一、碱裂解法
1. 培养细菌扩增质粒
将携带pBR322质粒的大肠杆菌接种于含2 ~ 5mL
氯霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养24h左右。
2. 收集菌体和裂解细菌
（1）取1.5mL培养液置Eppendorf管内，离心，10000r/min，5min，弃去上清，保留菌体沉淀。如菌量不足可再加入培养液，重复离心，收集菌体。
（2）将菌体沉淀悬浮于预冷的150μl
TEG缓冲液内，剧烈振荡、混匀，室温放置10min。
（3）加入200μl新鲜配制的碱裂解液，加盖，颠倒数次轻轻混匀，冰上放置5min。
3. 分离纯化质粒DNA
（1）加入150μl冷却的乙酸钾溶液。加盖后，温和颠倒数次混匀，冰浴放置15min。
（2）4℃下离心，12000r/min,
5min，乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并使过量的SDS－Na＋转化为溶解度很低的SDS－K＋一起沉淀下来。离心后，上清液若仍混浊，应混匀后再冷至0℃，重复离心。上清液转移至另一干净的Eppendorf管内。
（3）加入等体积的酚／氯仿饱和溶液，反复振荡，离心，12000r/min,
2min,小心吸取上层水相溶液，转移到另一个Eppendorf管中。
（4）上述溶液中加入两倍体积的预冷无水乙醇，混合摇匀，于冰上放置10min。4℃下离心，12000r/min
弃去上清液，并将Eppendorf管倒置在干滤纸上，空干管壁粘附的溶液。
（5）加入1mL
70％冷乙醇，洗涤沉淀物，离心，弃去上清液，尽可能除净管壁上的液珠，放置干燥或真空干燥，即得质粒DNA制品。
（6）将DNA沉淀溶于20μlTE缓冲液（临用前加入20μg/mLRNaseA），置－20℃保存，备用
（1）细菌培养过程要求无菌操作。细菌培养液、配试剂用的蒸馏水、试管和Eppendorf离心管等有关用具和某些试剂经高压灭菌处理。
（2）制备质粒的过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡，以避免机械剪切力对DNA的断裂作用。
（3）加入乙酸钾溶液后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止质粒DNA可能被包埋在沉淀物内，不易释放出来。
（4）用酚／氯仿混合液除去蛋白效果比单独使用更好，为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，直至两相间无絮状蛋白沉淀。
（5）提取的各部操作尽量在低温条件下进行（冰浴上）
1.碱法提取质粒的过程中，EDTA、溶菌酶、NaOH、SDS、乙酸钾、酚／氯仿等试剂的作用是什么？
2.质粒提取过程中，应注意哪些操作？为什么？
1．简述溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所包含成分及生化作用原理
溶液Ⅰ含葡萄糖和EDTA，葡萄糖能增加溶液的黏度，防止DNA受机械作用而降解。EDTA可螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（Dnase作用时需要一定的金属离子作辅基），另外，EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
溶液Ⅱ含NaOH和SDS，核酸在pH大于5小于9的溶液中是稳定的，但当pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2N，加入抽提液液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒的变性。SDS是阴离子型表面活性剂，它主要功能有溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；SDS能与蛋白质结合成为R1-O-SO3-…R2+-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用Rnase去除RNA时）受到干扰。
溶液Ⅲ是NaAc-Hac的缓冲液（pH4.8）。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液pH调回中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3MnaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
2．小量制备质粒DNA时发现质粒DNA不能被限制酶所切割，分析可能原因及解决办法。
由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意不够，没有去除干净导致。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质，如果总是依然存在，可用离心柱纯化DNA。
3．溶菌酶是破碎细菌的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理？
添加DTT、β-巯基乙醇，或8.0mol/L的尿素等增加敏感性。
4．从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法及原理。
方法是先用酚：氯仿抽提，然后再用氯仿抽提。
原理：使用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。继而用氯仿抽提可除去核酸制品中残量酚。（此外，酚虽能有效地使蛋白质变性，却不能完全抑制RNA酶的活性，它还能溶解带有长poly（A）段的RNA分子。使用酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）混合液可以使这两个问题迎刃而解，）
5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1-0.25M?
在pH为8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷排斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
6．LiCl在质粒DNA提取中的作用是什么？
沉淀大量蛋白质和高分子RNA。
7．简述PCR-SSCP基本过程。
1)PCR扩增靶DNA；
2)将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；
3)将适量单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；
4)最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果，若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断DNA片段中有碱基突变。
8．简述RNA-SSCP的基本原理。
RNA有着更多精细的二级和三级构象，这些构象对单个碱基的突变很敏感，从而提高了检出率，其突变检出率可达90%以上。另外，RNA不易结合成双链，因此可以较大量的进行电泳，有利于用溴化乙锭染色。
9．SSCP图谱一般是二条单链DNA带，有时可能只呈现一条SSDNA带或三条以上的原因是什么？
主要是由于两条单链DNA之间存在相似的立体构象，有时三条以上的SSCP图谱是由于野型DNA片段和突变型DNA片段共同存在的结果。
10．分子量相同的超螺旋环状、带切口环状和线状DNA在凝胶中迁移率大小顺序是什么？
超螺旋环状DNA迁移最快，其次为线状DNA，最慢为带切口环状DNA。
11．影响DNA迁移率的因素有哪些？
影响DNA迁移率的因素有：DNA分子的大小，琼脂糖浓度，DNA的构象，所加电压，温度，嵌入染料的存在和电泳缓冲液的组成。
单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由
其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或
少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰
胺凝胶中受排阻大小不同.因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常
敏锐地将构象上有差异的分子分离开.作者称该方法为单链构象多态性
(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)分析.在
PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性.其基本过程是:①PCR扩增靶DNA;②将特异的PCR扩增
产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;③将适量的单
链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显
色分析结果.若发现单链DNA带迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构
象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变.
该方法简便、快速、灵敏，不需要特
殊的仪器，适合临床实验的需要.但它也有不足之处.例如，只能作为一种突变检测方
法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序;电泳条件要求较严格;另外，由
于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可
能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小
时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检.
尽管如此，该方法和其他方法相比仍有较高的检测率.首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱
基突变.Takao，经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发
现，他认为现在知道的所有单碱基改变绝大多数可用该方法检测出来.另外，SSCP方
法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步
提纯.用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段.
大肠杆菌感受态细胞制备及转化中的影响因素
1、感受态细胞的概念
重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2
也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。
2、 转化的概念及原理
在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，
使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2
的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2
）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。
化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。
感受态细胞制备及转化中的影响因素
⑴、细胞的生长状态和密度
最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已
经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。
此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。
⑵、质粒DNA的质量和浓度
用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。
对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。
整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。
⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。
一、 受体菌的培养
　　从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml
LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml
LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
　　二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
　　1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
　　2、 弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2
溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
　　3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2
溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
　　4、 感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
　　三、 转化
　　1、从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
　　3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
　　4、向管中加入1ml
LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr
　　5、将上述菌液摇匀后取100μl
涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
　　同时做两个对照:
　　对照组1:
以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
　　对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl
菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
　　四、 计算转化率
　　统计每个培养皿中的菌落数。
　　转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
　　转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积
　　转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)
　　感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积
　　感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数
　　[注意]
本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
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物质的提取
质粒DNA的提取
实验原理：质粒是存在于染色体外、能独立复制的双链闭合的环状DNA分子，以超螺旋的形式存在。在高pH值得NaOH和SDS溶液中，细菌细胞壁破裂，蛋白质和DNA发生变性。当加入中和溶液后，变性的染色体DNA与蛋白质缠绕形成大型复合体，被SDS包盖，当K 取代Na 时，这些复合体会沉淀下来；而质粒DNA双链能够迅速复性，呈溶解状态，留在上清液中。在上清液中加入乙醇，通过离心就可使质粒DNA沉淀下来。
1.取1.5ml菌液，室温下，12 000rpm，离心30秒。
2.弃上清，留沉淀，加入150μl冰预冷的溶液I（已加入RNase A），剧烈震荡，重悬沉淀。
3.加入150μl新配置的溶液II，快速颠倒混匀5次（注意：切勿震荡！），置于冰上。
4.加入200μl冰预冷的溶液III，反复颠倒数次混匀，冰浴5分钟。室温下，12 000rpm，离心5分钟。
5.取上清，转移到另一EP试管中，加等体积酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），颠倒混匀有机相和水相，室温下，12 000rpm，离心5分钟。
6.将上清转移到另一EP试管中，加等体积氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀，室温下，12 000rpm，离心2分钟。
7.将上清转移到另一EP试管中，加两倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒数次混匀，冰浴10~15分钟后，室温下，12 000rpm，离心15分钟。
8.弃上清，留沉淀，加1ml75%乙醇洗涤，12 000rpm，离心2分钟。
9.弃上清，室温下，12 000rpm，离心30s，吸除乙醇，室温干燥，使酒精充分挥发。
10.加20μl TE，溶解沉淀。
1.离心机需配平离心。
2.加入溶液III后，溶液中出现絮状物，可以多离心1分钟使溶液与絮状物分离更彻底。
3.加入的酚使蛋白质迅速变性，氯仿与异戊醇增强极性，纯化酚，同时进行有机抽提。
4.再次加入的氯仿与异
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