PCR电泳条带总是出现“微笑”形状(电泳条带,条带) - DNA技术 - 生物秀
标题: PCR电泳条带总是出现“微笑”形状(电泳条带,条带)
摘要: [PCR电泳条带总是出现“微笑”形状(电泳条带,条带)] Marker用的是Takara的DL10，000，上面几条带总是会跑成笑脸，0 5*TAE buffer，电压试过不同的，60V-100V，0 7%或者1%的胶也都试过，但是总会出现这种情况，求高手指点 关键词:[电泳条带 条带]……
Marker用的是Takara的DL10，000，上面几条带总是会跑成笑脸，0.5*TAE buffer，电压试过不同的，60V-100V，0.7%或者1%的胶也都试过，但是总会出现这种情况，求高手指点
回复Which is the PCR band? I am not sure what the bands you are expecting. your gel is fine.回复用的是什么核酸染料啊？回复染料是gelred，可能图片颜色比较淡，最左边marker最上面是10000bp，7000bp，总是会跑成弧形回复gelred染料做预制胶时，当然还有SYBR Green 1等，这种情况基本上是避免不了的。gelred可以与Marker以及样品混合后几乎不需要放置就可以立刻加入没加任何燃料的凝胶。既节省gelred，更重要条带非常漂亮的。
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【求助】土壤微生物总DNA的提取及细菌16S rDNA的PCR扩增出问题了，寻求大家的帮助！
【求助】土壤微生物总DNA的提取及细菌16S rDNA的PCR扩增出问题了，寻求大家的帮助！
来源：丁香园论坛
点击次数：566
我用MO Bio的soil DNA Isolation Kit提取土壤总DNA，提取的DNA直接跑胶，看不见任何条带，采用细菌16S rDNA通用引物（27F和1492R)进行PCR扩增，也没有结果，有一次我将试剂盒提取的DNA50倍稀释后，进行细菌16S rDNA的PCR扩增，扩增出了目的条带，我所用的酶为Takara的LA Taq，用普通的Taq酶扩增不出来，但隔了一周后再去重复，什么条件都一样，却再也扩不出来了，我重新提取了新的DNA进行PCR,依然没有结果，不知道是什么原因，请大家帮忙分析一下，希望有做过土壤微生物多样性的高手提供点提取土壤DNA以及扩增细菌16S rDNA的实验方法，我将不胜感激！我现在非常着急！希望能尽快得到大家的帮助！
提到的DNA里面存在污染，你的稀释倍数不够，我是用手提的DNA，稀释100倍进行16s的 PCR。
谢谢！那我稀释倍数加大点再试试。
本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴 师兄微信号：shixiongcoming
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跑电泳的一点小疑问
跑电泳时点样先加buffer还是DNA样本？
师兄说最好是把凝胶放在缓冲液里面点样，有什么好处？
下面是小生酶切DNA后跑电泳的图，先buffer后DNA，从右往左点样的，为什么buffer的带子右边的会比左边的跑的更前呢？还有大神们能看看哪个孔跑的片段更接近300~900bp,还是看不出来？额~
19 小时 24 分钟_副本.jpg
嗯，多谢解答，嘿嘿~我还想问下，泡成这样看不清，是不是DNA总量也不够，切开了也看不清？
这个图是提取某步甲总DNA之后割胶回收在酶切的。
之前没有割胶回收直接酶切可以看到中间有很亮的条带，但是又去提取的DNA有拖带现象，所以先做了割胶，之后再酶切反而是这个样子。。。所以应该和样本没关系吧，额~
还有请教下，用的酶是TAKARA的SAU3AI， ①说明书上提到的20ul反应体系是1ul酶配1ug的DNA； ②上面的1U活性单位定义是37度50ul体系里将1ug λDNA完全分解的量。 ③到手的管子上标的酶浓度是10U/ul，那么是不是要将酶稀释10倍了再加？
还有我看论坛里都说这个酶的最适浓度是0.01U/ug，这个说明书上的定义岂不是有矛盾，额~
:D，这个不是PCR产物，是直接提取总DNA割胶回收后酶切的，因为电泳检测看到有拖带~但是没有割胶回收直接把总DNA酶切的话就能在想要的片段大小那里看到明亮条带。。。所以很纠结，难道是DNA量不够，打算把回收的DNA P一下再来酶切看看
你这个DNA切开了也不可能出现特异的条带阿! 我觉得DNA切出来就是这个样子的，各种大小的片段都有啊，你要是切的久一点，整个带会向下偏移，但是我还没见到过直接就酶切DNA然后看到条带的。
之前DNA提出来直接酶切会在250~750bp之间出现明亮的片段，可以看到。
但是把DNA割胶回收之后再酶切就这个样子了，因为DNA提出来之后跑电泳会有拖带现象，觉得割胶了再跑回好看很多，额。我在想是不是DNA的量不够造成的~
你做的酶切很糊，感觉不是量的问题，很可能是酶切本身就有问题。不知道你上样量是多少，你最好也跑一下没有做酶切的质粒对照。
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【求助】求助鼠尾基因组pcr
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这个帖子发布于8年零333天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
用takara全基因组提取试剂盒提取鼠尾基因dna,电泳检测脱尾，降解严重，做 pcr,没有结果，有没有做过类似试验，请大家帮忙分析一下，先谢谢大家了！
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同志们, 我做了几百个鼠尾genomic NDA PCR genotyping, 用以下方法又快又好.我觉得最好的方法是:1.Tail 2mm, add 100ul 50mM NaOH, 97 centidegree 2 hours.2. add 10ul 1M Tris pH7.5-8, mix. use 1ul in 25ul pcr reaction.简单而言, 就是用碱分解蛋白, 用tris中和, 然后取1 ul做PCR.当然, 这个pcr反应本身引物和反应条件要楼主自己琢磨.
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1. Preparation of genomic DNA from mouse tail tips for PCR
(28 26 test samples plus 2 controls, 1 Ts65Dn + 1 diploid)Labeled 1.5 ml Eppendorf tubes. Place ~ 2 mm tail tip into each of the labeled tubes. Try to use same size tail tip for all mice. Aliquot 300 ul of 50 mM NaOH to each labeled tube. Heat at 98° for 30 mins Vortex Return to heat for 30 mins or until sufficiently lysed. Neutralize with 30 ul of 1 M Tris (pH8). Vortex Centrifuge for 6 mins at 14,000 RPM (IEC Micromax) Transfer supernatant to new tube. (Probably not necessary if you don't want to store the samples).1M Tris60.6g Tris Base [Sigma T1503-5kg] 500ml ddI H20 Autoclave50mM Sodium Hydroxide2g sodium hydroxide [Fisher S318-500] 1 Liter ddI H20 Autoclave2. Standard Curve Note: Use Large Orifice Tips Throughout for DNA (see supplies list)Use first DNA sample for standard curve determined from the four dilutions below.Label four 1.5 ml Eppendorf tubes.Tube 1 1:50
DNA / 490ul 10mM Tris Tube 2 1:100 200ul of 1:50
/ 200ul 10mM Tris Tube 3 1:200 200ul of 1:100 / 200ul 10mM Tris Tube 4 1:400 200ul of 1:200 / 200ul 10mM Tris3. Label 27 Eppendorf 1.5 ml tubes
(samples 2-28)1:100 dilution: 10ul DNA + 990ul 10mM Tris10mM Tris1ml 1M Tris [1M Tris HCL pH8 (Invitrogen # ) 1000ml] 100ml d H20 [Gibco d H20 # ]Prepare Master Mix (on ice)Prepare enough mix for 3 reactions of each DNA sample, a standard curve, two control samples, plus 3 reactions for no template control (NTC) .
For a whole 96-well plate, 102 reactions in total is needed ( allow 6 extra reactions for pipetting errors). The reaction mix contains a probe and forward and reverse primers for either the amyloid beta precursor protein gene (App) or the myxovirus resistance 1 gene (Mx1) and the apolipoprotein B control gene (Apob). Here is an example of using App and Apob for a multiplex reaction:
1RXN 102 RXN's 2X Master Mix 12.5ul 1275ul IMR 1863 40UM 0.25ul 25.5ul IMR 1864 40uM 0.25ul 25.5ul IMR 1544 40uM 0.25ul 25.5ul IMR 1545 40uM 0.25ul 25.5ul TMoIMR023 5uM 0.75ul 76.5ul TMoIMR032 5uM 0.75ul 76.5ul H2O 0
Total 15ul 1530ul DNA (1:200 dilution) 10ul
Load 96 well optical plate (see below) adding DNA last15 ul
reaction mix per well 10 ul DNA (1:100 dilution)Layout of the optical plate as we load it is shown below. The blank squares below are the two additional repeats for each sample.Place the optical adhesive cover over the plate taking care not to touch the cover.
Smooth with seal applicator and cover with compression pad. Centrifuge briefly (IEC HN-S 11 centrifuge) before putting on machine.
Cycles 50°C 2 mins 95°C 10 mins 95°C 15 secs* 60°C 1 min* *40 cycles ProbesTMoIMR023 Vic - CCA ATG GTC GGG CAC TGC TCA A - TamraApob control, This probe is used with primers IMR1544 and IMR 1545. TMoIMR032 6FAM-CAA AGG CGC CAT CAT CGG ACT CA- TamraApp probe for Ts65Dn mice. This probe is used with primers IMR1863 and IMR1864. Probe designed by Don Liu.TmoIMR041 6FAM-Tgg CTT TCC TGG TCG CTG TGC A-Tamra.Mx1 probe for Ts65Dn mice. This probe is used with primers IMR2077 and IMR2078. Probe designed by Don Liu.
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丁香园准中级站友
多家点蛋白酶K蛋白去的不干净
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多谢，我用试剂盒提的，没有用到蛋白酶ｋ呀　
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这是试剂盒的说明书，我用的是液氮研磨匀浆，大家帮帮忙吧，我都束手无策了，着急啊！
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鼠尾你都能用液氮研好？！佩服佩服，呵呵呵！像这种试剂盒由于基因组要过吸附柱，因此很容易在离心的过程中将大分子的基因组拉断，尤其是在你的样品与吸附柱的容量相比趋于饱和的情况下，首先先降低处理的样品量，其实大量提取不用盒子效果可能更好，充分研磨。溶液A中像是最可能添加蛋白酶的试剂，想想你的鼠尾组织皮肤的角蛋白含量吧，不用蛋白酶消化是不可能的，所以一定要消化到澄清才能进行下一步，没看到你的基因组图，不知道降解程度，先改进一下试试好了。
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事实上,我就剪约1cm的鼠尾，提基因组，pcr鉴定基因型，提的量不够pcr用的，那我是否可以延长65度保温的时间哪？65度保温的话，蛋白酶K不失活吗 ？
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我另外还有一个问题，模板的量对一般pcr的影响有多大，我看到有人说模板量太多，P不出来，比如提取鼠基因组，模板的量上有什么要求？如果基因组OD260/280=1.7，蛋白多了点，对PCR 有多大的影响？
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同志们, 我做了几百个鼠尾genomic NDA PCR genotyping, 用以下方法又快又好.我觉得最好的方法是:1.Tail 2mm, add 100ul 50mM NaOH, 97 centidegree 2 hours.2. add 10ul 1M Tris pH7.5-8, mix. use 1ul in 25ul pcr reaction.简单而言, 就是用碱分解蛋白, 用tris中和, 然后取1 ul做PCR.当然, 这个pcr反应本身引物和反应条件要楼主自己琢磨.
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请问htscorpio ,只需要2mm的鼠尾吗？ 1ul就足够做pcr的吗？我剪1cm 的鼠尾，用试剂盒纯化，还要用7-8ul哪 ！
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实际上我用了大概1 cm长的尾巴,
用碱反应再中和以后大概110 ul, 取1 ul够pcr了. 如果你不确定, 测一下浓度就好了. 因为是genotyping, 我用40个循环.我想问题在于你的pcr引物和条件优化, 至少应该用一个Plasmid试试这个pcr行不行.
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还有, 如果你的反应需要更多的DNA, 那就加更多的DNA, 不要拘泥于别人的数据. 不过, 提取DNA的产率通常比我的方法低, 因为在我的方法里, DNA是稳定的, 蛋白被消化了, 理论上所有的DNA都在. 所以用这种方法, 要设计合适的引物, 不让cDNA参加反应, 比如跨过promoter或者intron.
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谢谢htscorpio,谢谢你给我的建议，我会按照你的方法试试，如果可以的话，真是省钱，省时又省力。我现在用试剂盒提取的DNA，定量以后，每个样品加等量的模版后，做PCR，体系，条件完全一样的情况下，有的可以P出来，有的就P不出来，甚至两个平行中，有一个有条带，一个就没有，真是一头雾水，摸不着头脑，是操作的问题吗？问题很幼稚，请指点，谢谢！
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全基因组做不出PCR的原因，有可能是因为全基因组的二级结构复杂，导致引物不能有效结合。我们实验室有人遇到过类似问题。他用了一些常见酶--但是在你自己的基因上没有的酶--切了切模板，然后再P就有了。当然我觉得也可以通过延长变形时间来试一下。
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我说的只是我自己的经验, 我的pcr产物大概500bp.还有, 一般来说, 1ulDNA做pcr应该够了, 如果需要7ul, 我觉得是pcr本身的问题.为了保证genotyping的准确性, 我用了比较长的延长时间, 保证阳性和阴性截然不同. 不过这些都得你自己摸索.(3) 60 ℃
1.5 min(4) 72 ℃
2 min(5) Go to (2) 39 times供参考.
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Taq酶要求模板的量在0.1-1ug，提取的DNA定量以后，保证模板的量在这个范围内，最少的时候也要这个体积，试剂盒提的DNA量不多，这样做pcr ,也不能保证每次都能P出来，我做的基因大小也在400-600之间.我想请问htscorip ,详细一点的获得基因组模板的方法，谢谢
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1. Preparation of genomic DNA from mouse tail tips for PCR
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DNA / 490ul 10mM Tris Tube 2 1:100 200ul of 1:50
/ 200ul 10mM Tris Tube 3 1:200 200ul of 1:100 / 200ul 10mM Tris Tube 4 1:400 200ul of 1:200 / 200ul 10mM Tris3. Label 27 Eppendorf 1.5 ml tubes
(samples 2-28)1:100 dilution: 10ul DNA + 990ul 10mM Tris10mM Tris1ml 1M Tris [1M Tris HCL pH8 (Invitrogen # ) 1000ml] 100ml d H20 [Gibco d H20 # ]Prepare Master Mix (on ice)Prepare enough mix for 3 reactions of each DNA sample, a standard curve, two control samples, plus 3 reactions for no template control (NTC) .
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1RXN 102 RXN's 2X Master Mix 12.5ul 1275ul IMR 1863 40UM 0.25ul 25.5ul IMR 1864 40uM 0.25ul 25.5ul IMR 1544 40uM 0.25ul 25.5ul IMR 1545 40uM 0.25ul 25.5ul TMoIMR023 5uM 0.75ul 76.5ul TMoIMR032 5uM 0.75ul 76.5ul H2O 0
Total 15ul 1530ul DNA (1:200 dilution) 10ul
Load 96 well optical plate (see below) adding DNA last15 ul
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我上面的方法对我自己的实验很简单. 你说的详细点是什么意思? 我觉得我已经把步骤都写清楚了啊.
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我按照你的方法提取基因组,那提取液跑电泳 ,没有看到条带, pcr也没有结果，我觉得是没有提到dna ，想到是不是在具体的操作细节上有什么错误，所以才问你详细的步骤，如果没有问题的话，很郁闷，我怎么就没有得到dna哪？
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htscorpio 同志们, 我做了几百个鼠尾genomic NDA PCR genotyping, 用以下方法又快又好.我觉得最好的方法是:1.Tail 2mm, add 100ul 50mM NaOH, 97 centidegree 2 hours.2. add 10ul 1M Tris pH7.5-8, mix. use 1ul in 25ul pcr reaction.简单而言, 就是用碱分解蛋白, 用tris中和, 然后取1 ul做PCR.当然, 这个pcr反应本身引物和反应条件要楼主自己琢磨.这个技术很好用，多谢
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