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HPLC 主峰后杂峰有机相浓度低跑不出来，浓度高主峰前面杂峰有重合
最近在摸方法，色谱小白。请教各位大侠：
合成出来的物质杂比较多，当用流动相为甲醇：醋酸铵=70:30，流速为0.8时，主峰前面的杂峰可以跑出来，主峰拖尾，后面貌似有个杂峰跑不出来。调节流动相为甲醇：醋酸铵=75:25，流速0.8时，明显看见主峰后面的有杂峰，但依然没分开，主峰前的杂峰数量减少了，应该是杂峰重合了。这种情况要怎么办啊？想设置梯度洗脱，但也不知道如何设置？
谱图没弄下来，等明天去实验室搞下来。这个物质很让人无语，只溶于甲醇，我用甲醇溶解之后如果加水，就变得不透明，貌似在水中溶解度不大。用乙腈也不怎么溶，所以当时流动相没敢考虑乙腈。
:D不一样也没关系啊，只要不会柱头析出就好啊，而且一般也不会！只能说保持流动相一致比较好，而不是定死了！
对呀，60%的甲醇保留时间已经16min了
你说的不一样也没关系是什么不一样？还没进行梯度，问题依然存在，好烦啊
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【公告】 HPLC专家解答专用贴.pdf95页
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【公告】 HPLC 专家解答专用贴 小青蛙 wrote: 我想问个问题 我做了一个新药，主药的含量大约为93%，我把有关物质订为8%，我现在没有对 照品，我用的是自身对照法，这样2 个问题 一、我是否配制自身对照必须用8mL 稀释到100ML；如果用1ML 来做，再乘以8 是否合理？ 二、有关物质订为8％是否合理？ 在下先谢谢专家。 第一个问题，自身对照法是不太合适的，但你现在没有对照品，只能用归一化。 这是没有好办法的办法。用归一化法，则似乎与你上述配的浓度方式 关。 第二个问题，一个新药，主药的含量大约为93%，把有关物质订为8%，这要看此 药是否为生化药或半合成药或国外标准就是如此，并有充分理由，如能完全说明 8%的有关物质的结构和毒性等。 叶赫娜拉来贴 HPLC 专家： 您好！正当我急的没有头绪的时候突然想到帮我解决问题的方法不是没有，就 找您就对了。感觉还是直接问您比较好，还请您不吝赐教了！ 现在我有岛津液相，用的是LC-10AT 的泵和SPD-10A 的检测器，老板想让我用 这色谱做和毒物代谢有关的检测，大的范围也包括药理毒理的。 以前我没接触过药理毒理方面的分析，现在我特急的想知道用HPLC 能测哪些 指标？具体怎么来处理样品？听说可以测学药浓度，怎么来处理样品，大体的测 定方式是怎样的 ？以前只是做药物的，现在弄关于动物的，大头了？老板催的 要命，救命啊！！ 我会在线等待您的答复！假如您想知道毒物代谢的测定项目的话，我在药理与 临床版发了一个关于《毒物代谢动力学》的帖子。谢谢您了 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建
期待答复中。可以PM 给我，也可以给我发到邮箱里,当然 也可以在贵版块答复，谢谢了 叶赫娜拉：
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这是一个重定向条目，共享了的内容。为方便阅读，下文中的高效液相色谱法已经自动替换为HPLC，可点此恢复原貌，或使用备注方式展现目录1 HPLC的定义是指具有高效能的柱。HPLC系采用高压将的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入器，由积分仪或数据处理记录和处理色谱信号。2 对仪器的一般要求和色谱条件HPLC所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。2.1 色谱柱反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂为合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。系统使用交换填充剂；排阻色谱系统使用或多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的（如的、粒径、孔径、表、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留和分离效果。分子量小于2000的应选择孔径在15nm（1nm=10A）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间，粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以项下规定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。流动相的应在2～8之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机－无机杂化填充剂等。
2.2 检测器最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有检测器、光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供试品有关，还与化合物的有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录供试品的，故可用于供试品的光谱和色谱峰的纯度。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈，但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应符合紫外－可见（A）项下对的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不性盐组分的流动相。2.3 流动相反相色谱系统的流动相首选－水系统（采用紫外末端波长检测时，首选－水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相中不易伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不。各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的等，均可适当改变，以供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对于自身的改不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的超过总量的10%时，则改变量以总量的±10%为限。对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下注明。
3 系统适用性试验HPLC的适用性试验通常包括理论板数、分离度、和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和重复性尤为重要。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。3.1 色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（W）或半高峰宽（Wh/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。3.2 分离度（R）用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。无论是鉴别还是，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为：式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽（如图）。当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）均以峰宽（W）的计算结果为准。
3.3 重复性用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。采用外标，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。3.4 拖尾因子（T）用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：式中W0.05h为5%峰高处的峰宽；d1为峰顶点至峰前沿之间的距离（如图）。除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确测量。必要时，应在各品种项下对拖尾因子作出规定。4 测定法4.1 内标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：式中&AS为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；cS为内标物质的浓度；cR为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：式中AX为供试品的峰面积或峰高；cX为供试品的浓度；A'X为内标物质的峰面积或峰高；c'S为内标物质的浓度；f为校正因子。采用内标法，可避免因前处理及进样体积对测定结果的影响。
4.2 外标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：式中各符号意义同上。由于微量不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。4.3 加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分[通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%;含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%;含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%]。，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积，依法计算各杂质含量。
4.4 不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。4.5 面积归一化法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时，由于峰面积归一化法测定误差大，因此，通常只用于粗略考查供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。5 参考资料 [1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS/T 455—2014 卫生监测与评价名词术语[Z].. [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版：二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.
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