[医][=aflatoxin B1]黄曲霉毒素B1
大家都在背：
1. The correlation of the two ADAs with AFB 1 induced carcinogenesis was also discussed.
ADA的 两种主要加合物的生成、分布和清除以及它们与AFB1致癌作用的关系也作了讨论.
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2. OBJECTIVE : To find the conditions of the Chinese materia media polluted by aflatoixin B 1 ( AFB 1 ).
目的: 了解中药污染黄曲霉毒素B1 ( AFB1 ) 情况.
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3. It is reported that the aflatoxin B 1 ( AFB 1 ) is a carcinogen that inducing the liver cancer.
早年就有报道黄曲霉毒素B1 ( AFB1 ) 可以诱发肝癌.
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4. Objective : To determine the protective effect of Carboxyethylgermanium ( Ge - 132 ) during AFB 1 - induced hepato - carcinogenesis for Wistar short term model experiments.
目的: 应用大鼠短期实验模型进行Ge - 132对 黄曲霉 毒素B1 ( AFB1)诱癌的化学预防研究.
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1. 黄曲霉毒素诱导
after induced by AFB1 the activity of liver microsomal enzymes in duck has been studied and has been compared with the control groups respectively .本文对1月龄麻鸭经过黄曲霉毒素诱导后在1月、1年及3年观察其肝微粒体酶(S9)的代谢活性并与各相应对照组进行比较。
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黄曲霉毒素B1(AFB1)ELISA试剂盒
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Kit，规格：96T/48T&CYP2A13在AFB1/AFG1所致BEAS-2B细胞急性损伤中的作用及机制--《南京医科大学》2012年硕士论文
CYP2A13在AFB1/AFG1所致BEAS-2B细胞急性损伤中的作用及机制
【摘要】：黄曲霉毒素（Aflatoxins, AFs）污染是一个全球性的公共卫生问题，在发展中国家尤为严重。目前已鉴定分离的AFs主要包括20余种，而天然存在的AFs主要有四种：黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）、黄曲霉毒素B2（Aflatoxin B2,AFB2）、黄曲霉毒素G1（Aflatoxin G1, AFG1）、黄曲霉毒素G2（Aflatoxin G2,AFG2），其中AFB1毒性最大，属于I类强致癌物。AFs主要污染农作物和食物，生产、制备、加工处理农产品的农业食品业工人经常高暴露于AFs污染的环境中。尽管肝脏一直被认为是AFB1毒作用的重要靶器官，但流行病学和实验室研究表明AFB1暴露可能与肺癌发生有关。国内流行病学和实验室研究亦表明，饮食AFs污染（主要是AFG1）可能与肺癌发生有一定的关联。AFs是间接致癌物，在体内需经代谢活化才能发挥作用。细胞色素P450酶（Cytochrome P450，CYP450）是AFs在体内代谢活化过程中最主要的代谢酶，它能高效代谢活化AFB1/AFG1，生成包括环氧化物在内的多种代谢产物，继而可在体内与DNA、RNA和蛋白质等生物大分子结合形成DNA、RNA和蛋白加合物，攻击机体内的生物大分子，引发细胞毒性、细胞凋亡、周期改变、DNA损伤等毒效应，进而可能引起细胞恶变，引发机体肿瘤。已有研究显示，CYP1A2和CYP3A4是公认的人肝脏代谢AFB1的优势酶，但在肺脏中表达甚微；而CYP2A13是主要在人呼吸系统组织中表达的肝外CYP酶。鉴于CYP2A13在人呼吸道和肺脏中的高表达，CYP1A2几乎不在肺组织中表达，提示CYP2A13可能与人呼吸系统原位代谢AFs并进而引起呼吸系统损伤甚至肿瘤的发生有关。本研究利用细胞及分子生物学手段侧重研究AFs对稳定表达CYP2A13的人支气管上皮细胞（B-2A13）的毒性作用，通过与CYP2A6和CYP1A2进行比较，系统探讨了CYP2A13代谢活化AFs并导致细胞毒作用的能力，为阐明AFs与人呼吸系统损伤及肿瘤的关系提供线索。
一、AFB1对B-2A13细胞的急性损伤效应及分子机制
（一）目的
选用已验证的稳定表达AFB1代谢相关CYP450酶的单克隆BEAS-2B细胞株（B-CYPs）作为细胞模型，通过观察和比较经AFB1处理所致的细胞急性毒效应、细胞凋亡、细胞周期改变、DNA损伤作用以及相关的分子机制，系统阐述CYP2A13在代谢活化AFB1及其致细胞损伤中的关键作用，为深入探讨CYP2A13在空气AFB1污染引起呼吸系统损伤中的作用及相关的防治措施提供线索。
（二）方法
1、AFB1（或AFB2）所致B-2A13细胞的急性毒效应
采用MTT法测定细胞活性。用不同浓度的AFB1（1~10,000nM）或AFB2（1~100,000nM）处理B-CYPs细胞24或48h，通过比较细胞活性的差异，评价不同CYP450酶对AFB1或AFB2的代谢活化能力；此外，用0、1、10、100和500nM的AFB1处理B-2A13细胞6、12、24或48h，以观察AFB1所致细胞毒性的时间-反应关系。为进一步确认上述效应，分别给予B-2A13细胞两种处理：①分别联合给予100nM的AFB1和不同浓度的尼古丁（1、10和100μM）或8-MOP（0.01、0.1和1μM）24、48或72h；②先给予100μM尼古丁或1μM8-MOP处理2h，经1×PBS清洗后再加入100nM AFB1继续处理24、48或72h，通过分析尼古丁或8-MOP对AFB1所致细胞毒性的影响，验证CYP2A13对AFB1的代谢活化作用。
2、AFB1所致B-2A13细胞的凋亡作用
采用Hoechst33258染色和流式细胞仪分别检测细胞凋亡，采用Western blot检测相关凋亡蛋白的表达。首先用0、5、10、20、40和80nM AFB1处理B-CYPs细胞24h，再用相同浓度的AFB1处理B-2A13细胞12、24或48h，观察时间-反应关系，采用Hoechst33258染色测定细胞凋亡情况；此外，用0、5、20、80nM的AFB1处理单克隆细胞模型24h，采用流式细胞术验证细胞的凋亡情况。采用Western blot检测上述各浓度（或时间）点的相关凋亡蛋白的表达。为验证上述效应，分别采用80nMAFB1和100μM尼古丁（CYP2A13代谢活化AFB1的竞争性底物）或1μM8-MOP（CYP450酶的抑制剂）联合处理B-2A13细胞24h，进一步观察细胞凋亡状况并对相关凋亡蛋白的表达进行评价。
3、AFB1所致B-2A13细胞的DNA损伤和修复作用
采用彗星实验检测DNA损伤，Western blot检测DNA损伤和修复相关蛋白。首先用0、5、10、20、40和80nM AFB1处理B-CYPs细胞24h，比较不同CYP450酶对AFB1所致细胞DNA损伤的影响；然后再用相同浓度的AFB1处理B-2A13细胞6、12或24h，评价AFB1致B-2A13细胞DNA损伤的时间-反应关系。为评价DNA损伤后的修复效应，先用40nM AFB1处理B-2A13细胞24h，换新鲜培养基继续培养6、12或24h，检测各组DNA损伤的修复程度。同样，用80nM AFB1联合100μM尼古丁或1μM8-MOP处理B-2A13细胞24h，验证AFB1对B-2A13细胞的损伤作用。此外，通过分析上述各剂量（时间）点DNA损伤和修复蛋白的表达，评价AFB1致B-2A13细胞DNA损伤和修复的分子机制。
4、AFB1对B-2A13细胞周期的影响
采用流式细胞仪测定细胞周期。首先用0和80nM AFB1处理B-CYPs细胞24h，观察各细胞周期的变化；然后采用0、5、20和80nM AFB1处理B-2A13细胞24h，分析AFB1致B-2A13细胞周期变化的剂量-反应关系；最后再利用100μM尼古丁或1μM8-MOP与80nM AFB1的联合处理B-2A13细胞24h，进一步验证AFB1对B-2A13细胞周期的影响。
5、AFB1所致B-2A13细胞DNA加合物的形成及8-OHdG和γH2AX蛋白的表达
用0和80nMAFB1处理B-CYPs细胞24h，免疫荧光方法检测AFB1-DNA开环加合物的形成及8-OHdG和γH2AX蛋白的表达；此外，再利用100μM尼古丁或1μM8-MOP与80nM AFB1联合处理B-2A13细胞24h，进一步验证AFB1对B-2A13细胞AFB1-DNA开环加合物的形成以及8-OHdG和γH2AX蛋白表达的影响。
（三）结果
1、AFB1（或AFB2）所致B-2A13细胞的急性毒效应
随着AFB1浓度的增加，B-2A13细胞活性呈现出剂量依赖性下降；随着AFB1处理时间的增加，B-2A13细胞活性也呈时间依赖性降低；AFB1处理细胞48h，B-2A13、B-1A2和B-2A6细胞的IC50值分别为140nM、740nM（约为B-2A13的5倍）和3020nM（约为B-2A13的20倍），B-2A13细胞显然比B-1A2细胞敏感，而B-2A6细胞则和空载细胞（B-Vector）一样，对AFB1的敏感性较差。AFB2对各B-CYPs细胞基本无毒性作用。尼古丁和8-MOP都可剂量依赖地抑制AFB1所致的B-2A13细胞毒作用，100μM尼古丁或0.1μM8-MOP处理细胞均可完全抑制AFB1的细胞毒作用。结果提示，CYP2A13在AFB1所致的细胞急性毒效应中有重要作用。
2、AFB1所致B-2A13细胞凋亡作用
无论Hochest33258染色结果还是流式细胞仪结果均显示，不同浓度AFB1处理各细胞24h，B-2A13细胞凋亡率存在着剂量-反应关系，B-Vector、B-1A2、B-2A6细胞基本无凋亡；不同浓度AFB1处理B-2A13细胞12、24或48h，B-2A13细胞凋亡率存在着时间-反应关系。100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致的细胞凋亡。结果提示，CYP2A13在AFB1所致的细胞凋亡中有重要作用。
通过对凋亡相关蛋白表达的分析发现，C-PARP、C-Caspase-3蛋白表达随AFB1剂量增加而增加，并在20nM AFB1处理时显著增加（P0.001）；Bcl-2蛋白表达随AFB1剂量增加而减少，Bax蛋白表达随AFB1剂量增加而增加。C-PARP、C-Caspase-3蛋白表达随处理时间的延长而显著增加（P0.001）。与80nM AFB1处理组相比，100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致的细胞C-PARP、C-Caspase-3蛋白表达的增加（P0.05, P0.001），并可抑制AFB1所致的细胞Bcl-2蛋白表达的减少。结果提示，AFB1引起的B-2A13细胞凋亡可能与线粒体信号通路的激活有关。
3、AFB1所致B-2A13细胞DNA损伤和修复作用
不同浓度AFB1处理各细胞24h，B-2A13细胞DNA损伤存在着剂量-反应关系，B-2A13细胞DNA损伤效应强于B-1A2细胞，约为B-1A2细胞的3倍；B-Vector和B-2A6细胞基本无DNA损伤。不同浓度AFB1处理B-2A13细胞6、12或24h，DNA损伤存在着时间-反应关系。与24h+0h处理组相比，换用新鲜培养基继续培养，其AFB1所致的细胞DNA损伤效应仍继续存在，且随培养时间的延长，DNA损伤效应增强（P0.001）。而100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致的DNA损伤（P0.001）。结果提示，CYP2A13在AFB1所致的细胞DNA损伤中有重要作用。
Western blot结果显示，p-ATM、p-BRCA1、p-Chk1、p-Chk2、p-p95、p-p53、γH2AX蛋白表达随AFB1剂量增加而增加；p-ATR、Mre11、Ku-80、XLF、Rad50、Rad52的蛋白表达水平基本未变。与20nM处理24h+0h组相比，DNA-PK、p-BRCA1、p-ATM、p-Chk1、p-Chk2、p-p95、p-p53、γH2AX蛋白表达随时间的增加而增加；Mre11、Ku-80、XLF、Rad50、Rad52的蛋白表达水平基本未变。上述实验中，CYP2A13和GFP的表达始终未变，提示细胞具有良好的稳定性。此外，100μM尼古丁或1μM8-MOP与80nM AFB1共处理细胞，可明显抑制AFB1所致的细胞p-BRCA1、p-ATM、p-Chk1、p-Chk2、p-p95、p-p53、γH2AX蛋白表达的增加。结果表明，AFB1引起的B-2A13细胞DNA损伤，可能通过激活DNA损伤修复相关蛋白的表达而发生。
4、AFB1对B-2A13细胞周期的影响
80nM AFB1处理各细胞24h，B-2A13和B-1A2细胞出现明显的S期阻滞（P0.001），且B-2A13细胞S期阻滞现象较B-1A2细胞明显（P0.001）；B-2A13细胞出现的S期阻滞存在着一定的剂量-反应关系；100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致的细胞周期改变（P0.001）。结果表明，AFB1所致的B-2A13细胞周期改变主要以S期阻滞为主。
5、AFB1所致B-2A13细胞DNA加合物的形成及8-OHdG和γH2AX蛋白的表达
与DMSO处理组相比，B-2A13和B-1A2细胞核中有明显的AFB1-DNA开环加合物的形成（P0.001），但B-2A13细胞相对荧光强度约为B-1A2细胞的9倍（311vs36），B-2A6和B-Vector细胞核中未见AFB1-DNA开环加合物的形成。同样，B-2A13和B-1A2细胞核中8-OHdG的表达明显增加（P0.001），且B-2A13细胞的相对荧光强度约为B-1A2细胞的3倍（160vs55），B-2A6和B-Vector细胞核中无明显的8-OHdG表达。此外，B-2A13细胞核中出现γH2AX的显著表达（P0.001），但B-1A2、B-2A6和B-Vector细胞核中未见γH2AX的表达。100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFB1所致DNA加合物的形成及8-OHdG和γH2AX蛋白的表达（P0.001）。结果提示，CYP2A13可代谢活化AFB1生成AFB1-exo-8,9-环氧化物，并与细胞中DNA结合形成DNA加合物；此外，AFB1可致B-2A13细胞DNA中鸟嘌呤发生氧化损伤，可致细胞DNA发生双链断裂。
（四）小结
1．AFB1对B-CYPs细胞的损伤效应明显强于AFB2，B-2A13细胞对AFB1的毒作用比B-1A2细胞敏感，远强于B-2A6细胞及空载细胞（B-Vector），结果进一步证实了CYP2A13对AFB1较强的代谢活化能力，可能是AFB1的潜在的优势代谢酶。
2．AFB1诱导的B-2A13细胞凋亡，可能是通过线粒体途径发挥作用的，而其诱导的细胞DNA损伤，可能与DNA损伤修复相关蛋白的激活有关。
3．初步证实了AFB1可诱导B-2A13细胞形成AFB1-DNA开环加合物，并诱导细胞表达8-OHdG和γH2AX蛋白，从而导致细胞氧化损伤并最终发生DNA双链断裂，可能是其导致细胞毒性、细胞凋亡、DNA损伤和细胞周期改变的分子机制。
二、AFG1对B-2A13细胞的急性损伤效应
（一）目的
通过观察和比较AFG1对B-CYPs细胞的急性损伤效应及其相关蛋白的表达，初步揭示CYP2A13对AFG1的代谢活化作用，阐明CYP2A13在AFG1所致细胞毒性、细胞凋亡以及DNA损伤中的关键作用，为探讨CYP2A13在空气AFG1及AFB1混合污染引起的呼吸系统损伤及其健康危害中的作用提供实验依据。
（二）方法
1、AFG1（或AFG2）所致B-2A13细胞的急性毒效应
分别采用不同浓度的AFG1（1~10,000nM）或AFG2（1~100,000nM）处理B-CYPs细胞24或48h，MTT法检测细胞活性。此外，分别给予B-2A13细胞以下两种处理：①分别给予100nMAFG1和不同浓度尼古丁（1、10和100μM）或8-MOP（0.01、0.1和1μM）共同培养24、48或72h；②先给予100μM尼古丁或1μM8-MOP处理2h，再用1×PBS清洗细胞，最后加100nM AFG1继续处理24、48或72h，然后采用MTT法测定细胞活性。
2、AFG1所致B-2A13细胞凋亡作用
用0、5、20和80nMAFG1、80nM AFB1、10,000nMAFB2和10,000nMAFG2处理B-CYPs细胞24h，Hoechst33258染色测定细胞凋亡情况；用0、5、20和80nM AFG1、80nM AFB1和10,000nM AFG2处理B-2A13和B-Vector细胞24h，流式细胞仪测定细胞凋亡情况；此外，先用80nM AFG1与100μM尼古丁或1μM8-MOP联合处理B-2A13细胞24h，再用Hoechst33258染色和流式细胞仪检测细胞凋亡。
3、AFG1所致B-2A13细胞DNA损伤作用
用0、5、20和80nMAFG1、80nM AFB1、10,000nMAFB2和10,000nMAFG2处理B-2A13和B-Vector细胞24h，彗星实验检测细胞DNA损伤作用；此外，用80nM AFG1与100μM尼古丁或1μM8-MOP联合处理B-2A13细胞24h，彗星实验检测细胞DNA损伤作用。
4、AFG1对B-2A13细胞周期的影响
用0和80nM AFG1处理B-CYPs细胞24h，流式细胞仪测定各细胞周期；然后用0、5、20和80nM AFG1处理B-2A13细胞24h，评价AFG1对B-2A13细胞周期的影响。最后，再用80nMAFG1与100μM尼古丁或1μM8-MOP处理B-2A13细胞24h，进一步验证AFG1对B-2A13细胞周期的影响。
5、AFG1所致B-2A13细胞8-OHdG和γH2AX蛋白的表达
用80nM AFG1与100μM尼古丁或1μM8-MOP联合处理B-2A13细胞24h，免疫荧光方法检测8-OHdG和γH2AX蛋白，评价AFG1对8-OHdG和γH2AX蛋白表达的影响。
（三）结果
1、AFG1（或AFG2）所致B-2A13细胞急性毒效应
与AFB1的作用类似，AFG1对B-CYPs细胞的毒效应呈现剂量依赖性增加，B-2A13细胞的敏感性要显著强于B-1A2细胞，远高于B-2A6和B-Vector细胞，而AFG2对各细胞的毒性都不明显；随AFG1处理时间的增加，B-2A13细胞活性呈现剂量依赖性降低，且有时间-反应关系；AFG1处理细胞48h，B-2A13、B-1A2和B-2A6细胞的IC50值分别为140nM，4320nM（约为B-2A13的30倍）和6290nM（约为B-2A13的45倍）。尼古丁和8-MOP都可剂量依赖地抑制AFG1所致的B-2A13细胞的毒性作用，100μM尼古丁或0.1μM8-MOP均可完全抑制AFG1所致的B-2A13细胞的毒性作用。结果表明，CYP2A13在AFG1代谢活化所致的细胞毒作用中发挥了重要作用。
2、AFG1所致B-2A13细胞凋亡作用
不同浓度AFG1处理B-CYPs细胞，B-2A13细胞凋亡率存在剂量依赖性增加，80nM AFG1处理细胞，其细胞凋亡率略低于同样浓度的AFB1，而10μMAFB2或10μM AFG2处理各细胞，基本未见细胞凋亡。流式细胞仪与Hoechst33258染色均显示，AFG1对B-Vector、B-1A2、B-2A6细胞基本无细胞凋亡作用。100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFG1所致的细胞凋亡（P0.001）。结果提示，AFG1的细胞损伤效应明显强于AFG2，CYP2A13在AFG1所致细胞凋亡中发挥重要作用。
3、AFG1所致B-2A13细胞DNA损伤作用
不同浓度AFG1处理B-CYPs细胞，B-2A13细胞DNA损伤存在着剂量依赖性增加，而B-Vector细胞基本无DNA损伤。与DMSO处理组相比，80nMAFG1可诱导B-2A13细胞发生DNA损伤(P0.001），其效应略低于同浓度的AFB1；10μM AFB2或10μM AFG2基本不能诱导细胞发生DNA损伤。此外，100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFG1所致的DNA损伤（P0.001）。结果提示，AFG1的DNA损伤效应明显强于AFG2，CYP2A13在AFG1所致细胞DNA损伤中发挥重要作用。
4、AFG1对B-2A13细胞周期的影响
80nM AFG1处理各细胞24h，B-2A13细胞出现S期阻滞（P0.001），且B-2A13细胞S期阻滞存在剂量-反应关系；100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFG1所致的细胞周期改变（P0.001）。结果表明，AFG1可引起B-2A13细胞发生以S期阻滞为主的细胞周期变化，CYP2A13在其中发挥了重要作用。
4、AFG1所致B-2A13细胞8-OHdG和γH2AX蛋白的表达
与DMSO处理组相比，B-2A13细胞核中出现8-OHdG和γH2AX蛋白的显著表达（P0.001）；100μM尼古丁或1μM8-MOP可明显抑制AFG1所致8-OHdG和γH2AX蛋白的表达（P0.001）。结果表明，CYP2A13在AFG1诱发的细胞氧化损伤和DNA双链断裂中发挥重要作用。
（四）小结
1．AFG1对B-CYPs细胞的损伤效应与AFB1相近，明显强于AFG2，B-2A13细胞对AFG1的毒作用较B-1A2细胞敏感，远强于B-2A6细胞及空载细胞（B-Vector），结果首次证实了CYP2A13有较强的代谢活化AFG1的能力，可能也是AFG1潜在的优势代谢酶。
2．初步证实了AFG1可诱导B-2A13细胞表达8-OHdG和γH2AX蛋白，从而导致细胞氧化损伤并最终发生DNA双链断裂，可能是其导致细胞毒性、细胞凋亡、DNA损伤和细胞周期改变的分子机制。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：R114【目录】：
中文摘要5-15ABSTRACT15-28前言28-32材料与方法32-48 一、主要仪器32-33 二、细胞来源及培养33 三、主要试剂33-34 四、主要试剂的配制34-37 五、检测指标及方法37-46 六、统计分析46-48结果48-94 一、AFB1 对 B-2A13 细胞的急性损伤效应及分子机制48-79 二、AFG1 对 B-2A13 细胞的急性损伤效应79-94小结94-95分析与讨论95-103总结103-104参考文献104-112综述112-132 参考文献125-132附录一132-134 攻读学位期间的研究成果132-134附录二134-135 主要中英文缩略词表134-135致谢135
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