& 水稻纹枯病菌粗毒素提取及活性初步研究
水稻纹枯病菌粗毒素提取及活性初步研究
摘 要：[目的]研究水稻纹枯病菌的致病机制及毒素的活性成分。[方法]将水稻纹枯病菌Rhizoctoniasolani在改良Richard培养基中培养，培养滤液经离心、灭菌、活性炭粒吸附层析、甲醇洗脱、蒸馏水洗
【题　名】水稻纹枯病菌粗毒素提取及活性初步研究
【作　者】黄文文 向准 龚亮 钟国华
【机　构】华南农业大学昆虫毒理研究室 广东广州510642
【刊　名】《安徽农业科学》2009年 第27期 页　共4页
【关键词】水稻纹枯病 粗毒素 提取 生物活性
【文　摘】[目的]研究水稻纹枯病菌的致病机制及毒素的活性成分。[方法]将水稻纹枯病菌Rhizoctoniasolani在改良Richard培养基中培养，培养滤液经离心、灭菌、活性炭粒吸附层析、甲醇洗脱、蒸馏水洗脱、浓缩得培养液粗提物、甲醇粗提物以及水粗提物，并对3种粗提物进行活性测定。[结果]3种粗提物均为黄褐色膏状物；活性测定表明，3种粗提物对水稻胚根、胚芽都有明显的生长抑制作用，对水稻4叶期幼苗都有致萎作用，对水稻离体叶片也有不同程度的毒害作用，能产生与病原茵侵染类似的云纹状褪绿斑。[结论]水稻纹枯病茵毒素的活性组分可能有多种成分。
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水稻纹枯病,粗毒素,提取,生物活性
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水稻纹枯病菌毒素的提纯、组分分析及钝化
【摘要】：
采用不同方法提取水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)毒素,结果表明,最佳提取方法为:将水稻纹枯病菌培养滤液于60℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/5,加等体积甲醇、离心去沉淀,60℃旋转蒸发去甲醇。取水相加等体积的乙醚萃取3次,合并有机相,40℃旋转蒸发去乙醚,即得水稻纹枯病菌粗毒素。该粗毒素对水稻胚根的伸长有明显抑制作用;以粗毒素针刺接种水稻叶鞘后,接种部位出现典型的纹枯病病斑。
不同方法提取的粗毒素具有相同的紫外吸收曲线,吸收峰在220nm左右。粗毒素经第1次Sephadex G-75硅胶柱层析,共收集43瓶洗脱液,主要活性成分集中在7~18瓶。将第1次层析后7~18瓶洗脱液同法进行第2次层析,共收集21瓶洗脱液,其中7~9瓶含活性成分最多。本研究将第2次层析后7~9瓶洗脱液定为精毒素。
对精毒素进行HPLC检测,发现其至少有4个特异吸收峰,即可能含有4种活性组分。通过红外光谱分析,该毒素可能含有N-H(或O-H)、C=O、C-N(或C-O)基团。薄层色谱分析表明该毒素为糖类物质。经气质联用进一步检测发现该毒素含有葡萄糖、N-乙酰氨基甘露糖和蔗糖。同时表明该毒素不含苯甲酸、苯乙酸及其衍生物。
将9种化合物与病菌粗毒素按一定浓度(100、500和1000μg/ml)混合后,测定其对水稻胚根伸长的抑制率。结果表明,多种化合物对毒素具有显著的钝化作用,其中KMnO4钝化率最大,达80%左右。对水稻叶鞘针刺接种显示,KMnO4与毒素混合接种仅出现褐色斑,而未见枯白色坏死斑,表明其病害症状比单用毒素明显减轻。
比较水稻纹枯病菌不同菌株的产毒能力与对水稻的致病力可以发现,两者之间呈显著正相关,即菌株产毒能力越强,其致病力也越强。由此可见,毒素是水稻纹枯病菌致病的重要因子之一。
【关键词】：
【学位授予单位】：扬州大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2009【分类号】：S435.111【目录】：
中文摘要7-8
英文摘要8-10
一、植物病原真菌致病因子10-14
（一） 胞壁降解酶10-12
（二） 毒素12-13
（三） 激素13-14
二、植物病原真菌毒素研究进展14-33
（一） 植物病原真菌毒素的种类15-20
1、寄主专化型毒素16-17
2、非寄主专化型毒素17-20
（二） 植物病原真菌毒素的化学成分20-22
1、多糖和糖肽20
2、酚类和杂环化合物20-21
3、氨基酸衍生物21
4、类萜化合物21
5、其他21-22
（三） 植物病原真菌毒素的提取与纯化方法22-26
1、毒素提取22-23
2、毒素纯化23-26
（四） 植物病原真菌毒素的组分分析技术26
1、紫外光谱（UV）26
2、红外光谱（IR ）26
3、核磁共振谱（NMR ）26
4、质谱（MS ）26
（五） 植物病原真菌毒素的致病机理26-30
1、对寄主细胞结构的破坏作用27-29
2、对寄主植物酶的影响29
3、其他29-30
（六） 植物病原真菌毒素的应用30-32
1、在植物病害防治与杂草防除上的应用30-31
2、在真菌分类上的应用31
3、在抗病育种上的应用31-32
（七） 植物病原真菌毒素的钝化32-33
1、非生物钝化作用32
2、生物钝化作用32-33
三、丝核菌毒素研究现状33-35
（一） 毒素的提纯33-34
（二） 毒素的本质34-35
（三） 毒素的作用35
四、本论文研究的目的与意义35-36
材料与方法36-41
一、供试菌株36
二、培养基36
（一） 马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）36
（二） 改良的 Richard 培养液36
三、主要供试药剂与仪器36
（一） 主要药剂36
（二） 主要仪器36
四、毒素产生方法36-37
五、粗毒素提取方法37
（一） 活性炭吸附法37
（二） 酸度调节萃取法37
（三） 活性炭吸附萃取法37
（四） 乙醚萃取法37
六、毒素生物活性检测方法37-38
（一） 胚根伸长抑制法37-38
（二） 叶鞘针刺接种法38
七、毒素纯化与检测方法38
（一） 粗毒素紫外扫描分析38
（二） 粗毒素柱层析分离纯化38
八、毒素组分分析方法38-40
（一） 精毒素高效液相色谱( HPLC) 检测38-39
（二） 精毒素红外光谱（IR）分析39
（三） 精毒素薄层层析（TLC）分析39
（四） 精毒素气质联用（GL-MS）分析39-40
1、检测物甲酯化处理39
2、检测物衍生化处理39-40
九、毒素钝化方法40
（一） 不同化合物处理后毒素对水稻胚根伸长的抑制测定40
（二） 高锰酸钾钝化后毒素对水稻叶鞘的致病力测定40
十、水稻纹枯病菌苗期致病力测定40-41
结果与分析41-58
一、水稻纹枯病菌毒素的提取41-44
（一） 不同有机溶剂萃取的粗毒素的生物活性41
（二） 不同方法提取的粗毒素的生物活性41-44
1、不同方法提取的粗毒素的生物活性41-42
2、乙醚萃取法分步萃取后各相生物活性监测42
3、不同浓度的粗毒素对水稻胚根生长的抑制作用42-43
4、粗毒素对水稻叶鞘的致病力43-44
二、水稻纹枯病菌毒素的分离纯化44-47
（一） 粗毒素的提取44-45
1、不同溶剂提取毒素的紫外吸收图谱44
2、不同方法提取毒素的紫外吸收图谱44-45
（二） 粗毒素的纯化45-47
1.S ephadex G-75 第一次柱层析45-46
2.S ephadex G-75 第二次柱层析46-47
三、水稻纹枯病菌毒素的组分分析47-54
（一） 精毒素HPLC 检测47-48
1、流动相检测条件47
2、HPLC 检测结果47-48
（二） 精毒素红外光谱(IR)分析48-49
（三） 精毒素薄层色谱(TLC)分析49-50
（四） 精毒素气质联用(GL-MS)分析50-54
1、苯甲酸、苯乙酸及其衍生物类检测结果50-52
2、糖、糖胺类检测结果52-54
四、水稻纹枯病菌毒素的钝化54-56
（一） 不同化合物对水稻纹枯病菌毒素的钝化作用54-55
（二） KMnO4 钝化后毒素对水稻叶鞘的致病力55-56
五、水稻纹枯病菌产毒能力与致病力的关系56-58
一、水稻纹枯病菌毒素的提取58-59
二、水稻纹枯病菌毒素的本质59-60
三、水稻纹枯病菌毒素的钝化60-62
参考文献62-75
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