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盆栽下西芹根物质对黄瓜枯萎病病菌的化感作用及其对相关酶的影响硕士论文
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3秒自动关闭窗口透明质酸发酵法制备及其复合改性研究--《江南大学》2010年博士论文
透明质酸发酵法制备及其复合改性研究
【摘要】：
透明质酸(hyaluronic acid,简称HA)是一种重要的医药材料和化妆品原料,并被列为新资源食品。近年来,微生物发酵法已经逐步取代了动物组织提取法,成为制备HA的主要方法。
在发酵法制备HA的过程中,需要对大量发酵液样品进行HA含量的测定。传统的Bitter-Miur法测定步骤繁琐,以浓硫酸-咔唑溶液为反应试剂,具有一定危险性。本研究考察了十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammonium bromide,简称CTAB)与HA反应产生混浊的特性,建立了CTAB比浊法:配制25 mg/ml的CTAB试液,选择400 nm作为CTAB比浊法的吸收波长,在室温下,将纯化后的样液与CTAB试液准确反应10 min,各样品的测定时间误差控制在10 s以内,通过标准曲线测算出待测样中HA含量。试验表明,CTAB比浊法的准确度、精确度和灵敏度均高于Bitter-Muir法。除了蛋白质外,其它杂质对CTAB比浊法影响较小。该法安全性高,操作简便快捷,适合对大量发酵液样品进行测定,适用于测定HA的分子量范围为≥50 000 Da。
本研究以马疫链球菌(Streptococcus equisimilis)为出发菌,通过紫外线和60CO-γ射线辐照相结合的方法对出发菌株进行诱变选育,筛选出无溶血性、HA产量和分子量均较高的突变株NC168,其HA产量为150.61 mg/L,分子量为677 000 Da。突变株经过多次传代,HA产量和HA分子量保持稳定,溶血性无回复突变现象,为进一步研究发酵法生产HA打下了基础。针对突变株NC168,通过单因素试验和二次正交旋转回归试验对其发酵培养基进行了优化,并建立了回归模型:
Y=174.22X3-9....20569X42由此得到了最佳培养基:酵母膏30 g/L,蛋白胨20 g/L,葡萄糖5 g/L和MgSO4·7H2O 1.5 g/L,模型预测HA产量为174.76 mg/L,验证试验HA产量达到178.53 mg/L,模型能较好的预测HA产量。将此培养基应用于5 L发酵罐,进行分批发酵试验。研究表明:pH值,初糖浓度,温度和搅拌速度对HA产量均有显著影响。优化的培养条件为:pH值为7.0,初糖浓度为30 g/L,温度35℃,搅拌转速200 r/min。5 L发酵罐分批发酵HA的产量可达3.0 g/L。在发酵条件优化基础上,以Logistic,Slogistic和SGompertz三种模型对菌体生长过程中生物量和HA产量进行非线性拟合,结果表明,生物量模型以Logistic模型拟合效果最佳,拟合方程为: y = 2 .933?1 +(x/21.18.,相关系数R2达到0.999;而在HA合成拟合中,以Slogistic模型最佳,拟合方程为:y =(?),相关系数R2为0.996;在对基质(葡萄糖)的消耗拟合中,采用DoseResp模型,拟合方程为: y =(?),相关系数R2为0.991。
采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀与超滤相结合的方法对HA进行分离纯化。将发酵液稀释到HA含量为0.6-0.8 g/L,加入发酵液体积15%的CTAB溶液(质量分数为10%),在35℃下沉淀1 h,将沉淀置于浓度为1.5 mol/L的NaCl溶液中解离4 h,选择浓度为70%乙醇进行沉淀。经上述处理后HA得率可达93.8%,HA中蛋白含量可降至1.5%。选择截留分子量为100 KDa的超滤膜对经过季铵盐沉淀得到的HA进行超滤,样液浓度为0.02%-0.05%,过膜压力为11 psi,HA得率可达到93.5%,蛋白去除率达到94.0%。经分离纯化后,HA总得率为87.7%,HA中蛋白含量可降至0.09%,葡萄糖醛酸含量可达43.5%,达到医药级水平。
为了获得性能良好的HA水凝胶,选择分子量为1 500 000 Da的HA与海藻酸钠(sodium alginate,简称SAL)进行复合改性。以醋酸盐缓冲液作为调节pH的试剂,碳化二亚胺(EDC)作为羧基激活剂,已二酰肼(ADH)作为交联剂,制备了HA-SAL复合水凝胶。通过红外光谱验证了HA与SAL之间形成的酰胺键,通过电镜观察了所形成凝胶的微结构。质构特征分析表明,凝胶的硬度随着两种多糖浓度升高而增加,随着HA/SAL摩尔比例升高而减小。凝胶的溶胀率与HA的比例成正相关,而与EDC用量成负相关。随着SAL比例和EDC用量的增加,所形成凝胶的抗透明质酸酶降解能力得到提高。所制备的HA-SAL水凝胶具有较高的溶胀率、理化稳定性、天然的生物相容性和一定的生物降解性,具有应用于真皮填充物、组织工程支架材料等生物医药领域的潜在用途。
【关键词】：
【学位授予单位】：江南大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2010【分类号】：TQ920.1【目录】：
Abstract5-12
第一章 绪论12-33
1.1 透明质酸理化性质及其应用12-15
1.1.1 透明质酸的分布、结构和理化性质12-13
1.1.2 透明质酸在医药工业中的应用13-14
1.1.3 透明质酸在化妆品及食品工业中的应用14-15
1.2 透明质酸研究进展15-23
1.2.1 透明质酸生产和测定方法15
1.2.2 透明质酸生产菌种的诱变选育15-16
1.2.3 发酵条件与透明质酸生物合成的关系16-19
1.2.4 发酵液中透明质酸的分离纯化19-22
1.2.5 透明质酸改性及其衍生物的应用22-23
1.3 立题背景及意义23-24
1.4 本课题研究内容24-25
参考文献25-33
第二章 发酵液中透明质酸含量快速测定方法研究33-44
2.1 引言33
2.2 材料与方法33-34
2.2.1 主要仪器与试剂33
2.2.2 试验方法33-34
2.3 结果与讨论34-42
2.3.1 反应体系的光谱学特性34-35
2.3.2 反应时间对反应体系稳定性的影响35-36
2.3.3 温度对反应体系稳定性的影响36-37
2.3.4 准确度试验37-38
2.3.5 精密度试验38
2.3.6 灵敏度试验38-39
2.3.7 杂质对测定结果的影响39-40
2.3.8 测定方法适用于测定的透明质酸分子量范围40-42
2.4 本章小结42
参考文献42-44
第三章 透明质酸生产菌的诱变选育44-56
3.1 引言44
3.2 材料与方法44-47
3.2.1 主要材料与药品44
3.2.2 主要仪器与设备44-45
3.2.3 试验方法45-47
3.2.4 测定方法47
3.3 结果与讨论47-55
3.3.1 出发菌株的确定47-48
3.3.2 出发菌株生长曲线的测定48
3.3.3 不同诱变剂的致死率曲线48-50
3.3.4 无溶血性突变株的诱变选育50-51
3.3.5 透明质酸高产突变株的诱变选育51-53
3.3.6 传代稳定性试验53-54
3.3.7 突变株NC168 的诱变谱系54-55
3.4 本章小结55
参考文献55-56
第四章 透明质酸发酵条件优化及发酵动力学研究56-75
4.1 引言56
4.2 材料与方法56-57
4.2.1 主要材料与药品56
4.2.2 主要仪器与设备56-57
4.2.3 试验方法57
4.2.4 测定方法57
4.3 结果与讨论57-73
4.3.1 氮源种类及用量对透明质酸产量的影响57-59
4.3.2 碳源种类及用量对透明质酸产量的影响59-60
4.3.3 金属离子及用量对透明质酸产量的影响60-61
4.3.4 旋转正交设计对培养基的优化61-65
4.3.5 pH 值对分批发酵的影响65
4.3.6 初糖浓度对分批发酵的影响65-66
4.3.7 温度对分批发酵的影响66-67
4.3.8 搅拌转速对分批发酵的影响67-68
4.3.9 产透明质酸菌株发酵过程动力学曲线68-69
4.3.10 动力学模型的建立69-72
4.3.11 动力学模型适用性72-73
4.4 本章小结73-74
参考文献74-75
第五章 透明质酸分离纯化研究75-84
5.1 引言75
5.2 材料与方法75-76
5.2.1 主要材料与试剂75
5.2.2 主要仪器与设备75
5.2.3 试验方法75-76
5.2.4 测定方法76
5.3 结果与讨论76-82
5.3.1 CTAB 沉淀法分离纯化透明质酸76-80
5.3.2 超滤纯化透明质酸80-82
5.3.3 HA 产品分析82
5.4 本章小结82-83
参考文献83-84
第六章 透明质酸复合改性研究84-101
6.1 引言84
6.2 材料与方法84-87
6.2.1 主要试剂及设备84-85
6.2.2 透明质酸分子量的选择85
6.2.3 HA-SAL 复合凝胶的制备85-86
6.2.4 凝胶理化性质测定86-87
6.3 结果与讨论87-98
6.3.1 透明质酸分子量的选择87-91
6.3.2 调节pH 值用酸类型的选择91
6.3.3 HA-SAL 复合凝胶可能的形成机理91-93
6.3.4 复合凝胶红外光谱分析93-94
6.3.5 复合凝胶微结构分析94-95
6.3.6 复合凝胶质构特征95-96
6.3.7 复合凝胶溶胀能力96-97
6.3.8 复合凝胶抗透明质酸酶降解试验97-98
6.4 本章小结98
参考文献98-101
论文主要结论101-103
论文的创新点103-104
附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文104-105
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