多肽和生物合成途径的制作方法
专利名称多肽和生物合成途径的制作方法
相关申请的相互参照此专利申请要求日提交的美国专利申请60/374,831的优先权。
领域此说明书提供的多肽和生物合成途径用于生成吲哚-3-丙酮酸、2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)和/或monatin。
背景吲哚丙酮酸吲哚-3-丙酮酸是强抗氧化剂，它被认为在具有高氧浓度的组织中抵消氧化应激(Politi等《色氨酸研究的最新进展》(Recent advances in TryptophanResearch)，G.A.Filippini等主编.Plenum Press，New York，页)。吲哚丙酮酸也是生成吲哚-乙酸(IAA)途径中的中间物，IAA是主要的植物生长激素生长素(可扩散生长促进因子)。在生理过程范围中亚微克量的IAA有活性，包括顶端优势、向性、枝条伸长、诱导形成的层细胞分裂和发根。合成的生长素用于园艺以诱导生根和促进果实的种植和发育。高浓度的合成生长素是抗阔叶植物的有效除草剂。认为发酵产生的天然生长素比化学生成的除草剂对环境更有利。生长调节物在1999年的全球销售额为4亿磅(14亿美元)。
有关吲哚乙酸和其衍生物的一些专利的例子包括美国专利号5,843,782玫瑰植物的微繁殖、用于培养基的生长素和美国专利号5,952,231玫瑰植物的微繁殖。
除了植物相关的应用之外，吲哚乙酸用于药物应用。例如，美国专利号5,173,497《制备α-氧吡咯并[2，3-B]吲哚乙酸和衍生物的方法》建议这些化合物用于治疗记忆损伤，如与阿尔茨海默氏病和老年性痴呆相关的疾病。美国专利号5,173,497中提出的机制是这些化合物抑制多肽乙酰胆碱酯酶且增加脑中的乙酰胆碱水平。
吲哚-3-甲醇通过过氧化物酶催化的氧化从吲哚-3-乙酸中生成，并易转变成二吲哚甲烷。报导这2种化合物去除毒素且促进生成有益女性健康的激素。
色氨酸衍生物氯化D-色氨酸鉴定为非营养甜味剂，寻求其它衍生物的兴趣也日益增加。Monatin是天然甜味剂，其组成类似氨基酸色氨酸。它能提取自南非灌木硬壳冬青(Sclerochiton ilicifolius)的根树皮，有希望作为食物和饮料业的高强度甜味剂。有关monatin的一些专利的例子包括美国专利号5994559合成monatin一种高强度天然甜味剂、美国专利号-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁基-4-基)-吲哚化合物、美国专利号5128164用于人消耗的含3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁基-4-基)-吲哚化合物的组合物；美国专利号5128482生成3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁基-4-基)-吲哚的方法。
这里所述的monatin的一些前体也能用作合成甜味剂或monatin衍生物合成中的中间物。
概要说明书提供一些生物合成途径用于从葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸和/或通过monatin前体如吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸中产生monatin。公开了多肽和核酸序列可用于产生monatin、吲哚-3-丙酮酸和2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸。
Monatin可通过吲哚-3-丙酮酸、2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(monatin前体，MP，monatin的α酮式)、吲哚-3-乳酸、色氨酸和/或葡萄糖(附图说明
图1)生成。公开了生成或制备monatin或图1-3和11-13所示其中间物的方法，包括将底物转变成第一种产物，随后使第一种产物转变成第2种产物，等等，直到产生所需终产物。
图1-3和11-13以框显示潜在的中间产物和终产物。例如，从一种产物到另一种产物的转变能用这些方法进行，如葡萄糖到色氨酸、色氨酸到吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸到MP、MP到monatin或吲哚-3-乳酸(吲哚-乳酸)到吲哚-3-丙酮酸。这些转变可用化学方法或生物学方法促进。术语“转变”指在将第一种中间物转变成第2种中间物的反应中使用化学方法或多肽。术语“化学转变”指不由多肽活性促进的反应。术语“生物转变”指由多肽活性促进的反应。转变可体内或体外发生。当使用生物转变时，多肽和/或细胞能固定于支持物如化学附着于聚合物支持物。转变可用本领域普通技术人员已知的任何反应器完成，例如在分批或连续反应器中。
提供的方法包括使第一种多肽接触底物并产生第一种产物，随后使生成的第一种产物接触第2种多肽并产生第2种产物，然后使生成的第2种产物接触第3种多肽并产生第3种产物，例如monatin。使用的多肽和生成的产物示于图1-3和11-13。
公开了多肽和其编码序列，它们能用于进行图1-3和11-13所示的转变。在一些例子中，具有1个或多个点突变的多肽用于产生monatin，点突变可修饰底物特异性和/或多肽活性。
公开了生成monatin的分离和重组细胞。这些细胞可以是任何细胞，如植物、动物、细菌、酵母、藻类、古菌或真菌细胞。
在一个特定例子中，揭示的细胞包括一种或多种下列活性，例如2种或3种或多种下列活性色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号，Hadar等，J.Bacteriol 4，1976和Furuya等，BiosciBiotechnol Biochem ，2000)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、合酶/裂合酶(EC 4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(EC 4.1.2.-)、D-色氨酸转氨酶(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》(Proceedings of 8thInternational Symposium on VitaminB6and Carbonyl Catalysis)，Osaka，Japan 1990)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)和/或谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)。
在另一个例子中，细胞包括一种或多种下列活性，例如2种或多种或者3种或多种下列活性吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-色氨酸转氨酶和/或D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)。
此外，揭示的细胞可包括一种或多种下列活性，例如2种或多种或者3种或多种下列活性色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、酪氨酸(芳族)转氨酶(EC 2.6.1.5)、多底物转氨酶(EC 2.6.1.-)、天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)、L-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.2)、色氨酸氧化酶(无EC号)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、D-氨基酸氧化酶(EC 1.4.3.3)、D-丙氨酸转氨酶(EC 2.6.1.21)、吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)、R-4-羟苯基乳酸脱氢酶(EC1.1.1.222)、3-(4)-羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3)、(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)、乳酸氧化酶(EC 1.1.3.-)、合酶/裂合酶(4.1.3.-)如4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)或4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.16)、合酶/裂合酶(4.1.2.-)、谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.2、1.4.1.3、1.4.1.4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)和/或D-色氨酸转氨酶。
能生成Monatin的方法包括使色氨酸和/或吲哚-3-乳酸接触第一种多肽，其中第一种多肽将色氨酸和/或吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸(D或L型色氨酸或吲哚-3-乳酸可用作转变成吲哚-3-丙酮酸的底物；本领域技术人员理解选择用于此步骤的多肽理想地表现出适当特异性)，所得吲哚-3-丙酮酸接触第2种多肽，其中第2种多肽将吲哚-3-丙酮酸转变成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)，MP接触第3种多肽，其中第3种多肽将MP转变成monatin。能用于这些转变的示范多肽示于图2和3。
发明的另一方面提供组合物如MP、含至少2种多肽或者有时至少3种或至少4种多肽的细胞，多肽在至少一种外源核酸序列中编码。
说明书的这些和其它方面通过下列详细描述和说明性例子是显而易见的。
附图的概述图1显示用于生成monatin和/或吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径。一种途径经色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸，而另一种经吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。随后经2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)生成Monatin。
框中所示化合物是生物合成途径中生成的底物和产物。
与箭头相邻的组合物是辅因子或可在底物转变成产物期间使用的反应物。所用辅因子或反应物取决于生物合成途径的特定步骤使用的多肽。辅因子PLP(吡哆醛5’-磷酸)能催化不取决于多肽的反应，因此仅提供PLP可从底物进行到产物。
图2是使用MP中间物的生物合成途径的更详细图。途径中各步骤的底物以框显示。允许底物间转变的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其普通名称和酶分类(EC)号描述。
图3显示将吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸的生物合成途径的更详细图。底物以框显示，允许底物间转变的多肽列于底物间的箭头附近。各多肽通过其普通名称和酶分类(EC)号描述。
图4显示一种经化学方法产生MP的可能反应。
图5A和5B是色谱图，显示LC/MS鉴定的酶法生成的monatin。
图6是酶法合成monatin的电喷射质谱。
图7A和7B显示LC/MS/MS子离子分析酶混合物中生成的monatin的色谱图。
图8是色谱图，显示酶法生成monatin的高分辨质谱测量。
图9A-9C是色谱图，显示(A)R-色氨酸、(B)S-色氨酸和(C)酶法生成monatin的手性分离。
图10是柱状图，显示IPTG诱导后细菌细胞中生成的相对monatin量。(-)表示缺乏底物加入(不加入色氨酸或丙酮酸盐)。
图11-12是示意图，显示用于增加monatin产量的途径，monatin产生自色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
图13是示意图，显示能用于增加monatin产量的途径，monatin产生白色氨酸或吲哚-3-丙酮酸。
序列列表所附序列列表中列出的核酸和氨基酸序列用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的3字母密码显示。仅显示各核酸序列的一条链，但通过参考所示链认为包括互补链。
SEQ ID NOS1和2分别显示来自苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的转氨酶的核酸和氨基酸序列(tatA基因，文献中称为酪氨酸或芳族转氨酶)。
SEQ ID NOS3和4分别显示来自类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)(2.4.1)的酪氨酸转氨酶的核酸和氨基酸序列(与通过基因组软件预测为“天冬氨酸转氨酶”的tatA(SEQ ID NOS1和2)同源)。
SEQ ID NOS5和6分别显示来自类球红细菌(35053)的转氨酶的核酸和氨基酸序列(新的，在2.4.1序列SEQ ID NOS 3和4基础上克隆)。
SEQ ID NOS7和8分别显示来自硕大利什曼原虫(Leishmania major)的广底物转氨酶(bsat)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS9和10分别显示来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的芳族转氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS11和12分别显示来自嗜淀粉乳杆菌(L.amylovorus)的芳族转氨酶(araT)的核酸和氨基酸序列(经同源性鉴定为芳族转氨酶)。
SEQ ID NOS13和14分别显示来自类球红细菌(35053)的多底物转氨酶(msa)的核酸和氨基酸序列(通过与登录号AAAE，bp 和登录号ZP的同源性鉴定为多底物转氨酶)。
SEQ ID NOS15和16显示用于克隆枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat)序列的引物。
SEQ ID NOS17和18显示用于克隆苜蓿根瘤菌tatA序列的引物。
SEQ ID NOS19和20显示用于克隆枯草芽孢杆菌araT转氨酶序列的引物。
SEQ ID NOS21和22显示用于克隆类球红细菌(2.4.1和35053)多底物转氨酶序列的引物。
SEQ ID NOS23和24显示用于克隆硕大利什曼原虫bsat序列的引物。
SEQ ID NOS25和26显示用于克隆嗜淀粉乳杆菌araT序列的引物。
SEQ ID NOS27和28显示用于克隆类球红细菌tatA序列(2.4.1和35053)的引物。
SEQ ID NOS29和30显示用于克隆大肠杆菌(E.coli)aspC序列(基因序列Genbank登录号AE，蛋白序列Genbank登录号AAC74014.1)的引物。
SEQ ID NOS31和32分别显示来自大肠杆菌的芳族转氨酶(tyrB)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS33和34显示用于克隆大肠杆菌tyrB序列的引物。
SEQ ID NOS35-40显示用于克隆多肽的引物，多肽具有4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶(KHG)(EC 4.1.3.16)活性。
SEQ ID NOS41和42显示的核酸序列分别来自大肠杆菌的色氨酸酶(tna)和来自弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter.freundii)的酪氨酸酚-裂合酶(tpl)，它们编码蛋白P00913(GI401195)和P31013(GI401201)。
SEQ ID NOS43-46显示用于克隆色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶(酪氨酸酚-裂合酶)多肽的引物。
SEQ ID NOS47-54显示用于突变色氨酸酶多肽和β-酪氨酸酶多肽的引物。
SEQ ID NOS55-64显示用于克隆多肽的引物，多肽具有4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17)活性。
SEQ ID NOS65和66分别显示来自睾丸酮丛毛单胞菌(C.testosteroni)的4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(proA)的核酸和氨基酸序列。
SEQ ID NOS67-68显示引物，用于克隆操纵子中睾丸酮丛毛单胞菌4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(proA)，操纵子具有pET30 Xa/LIC中的大肠杆菌aspC。
SEQ ID NOS69-72显示用于克隆大肠杆菌aspC和pESC-his中睾丸酮丛毛单胞菌proA的引物。
SEQ ID NOS73-74显示加入引物的5’末端的序列，用于克隆本文所示基因。
一些实施方案的详细描述缩写和术语提供下列术语和方法的解释以更好地描述本说明书并指导本领域普通技术人员实践本发明。如本文所用，“包含”指“包括”且单数形式“a”、“an”或“the”包括复数参考物，除非上下文另有明确规定。例如，提到“包含蛋白”，包括一种或多种这类蛋白，提到“包含细胞”，包括1个或多个细胞和本领域技术人员已知的其等价物等。
除非另有解释，本文所用全部技术和科学术语与此说明书所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。尽管与本文所述类似或相等的方法和材料能用于实践或测试本发明，适当方法和材料描述于下。材料、方法和例子仅用于阐明且不想限制。说明书的其它特征和优点从下列详细描述和权利要求中是显而易见的。
cDNA(互补DNA)缺乏内部、非编码区段(内含子)和决定转录的调节序列的DNA片段。能通过反转录从提取自细胞的信使RNA在实验室中合成的cDNA。
保守取代1个或多个氨基酸取代(例如2、5或10个残基)具有类似生化性质的氨基酸残基。通常，保守取代对所得多肽活性的影响小或没有。例如，包括1个或多个保守取代的色氨酸转氨酶多肽理想地保持色氨酸转氨酶活性。可通过操作编码所用多肽的核苷酸序列生成含1个或多个保守取代的多肽，例如标准方法如定点诱变或PCR。
取代变体中去除至少氨基酸序列中的1个残基且此位置中插入1个不同残基。可取代蛋白中原始氨基酸并认为是保守取代的氨基酸例子包括丝氨酸或苏氨酸取代丙氨酸；谷氨酰胺、组氨酸或赖氨酸取代精氨酸；谷氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸天冬氨酸、取代天冬酰胺；天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺取代天冬氨酸；丝氨酸或丙氨酸取代半胱氨酸；天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、天冬氨酸或精氨酸取代谷氨酰胺；天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或天冬氨酸取代谷氨酸；脯氨酸取代甘氨酸；天冬酰胺、赖氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、酪氨酸取代组氨酸；亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代异亮氨酸；异亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代亮氨酸；天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸取代赖氨酸；异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸取代甲硫氨酸；色氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸或亮氨酸取代苯丙氨酸；苏氨酸、丙氨酸取代丝氨酸；丝氨酸或丙氨酸取代苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸取代色氨酸；组氨酸、苯丙氨酸或色氨酸取代酪氨酸；甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸取代缬氨酸。
关于保守取代的进一步信息可发现于Ben-Bassat等，(J.Bacteriol.，1987)、O’Regan等，(Gene 89)、Sahin-Toth等，(Protein Sci.94)、Hochuli等，(Bio/Technology 98)、WO 00/67796(Curd等)和遗传学与分子生物学的标准课本。
外源如本文所用，关于核酸和特定细胞的术语“外源”指不是在自然界中发现那样起源自特定细胞的任何核酸。因此，认为非天然产生的核酸一旦导入细胞，它对细胞是外源的。天然产生的核酸也可对特定细胞外源。例如，一旦染色体导入Y的细胞，分离自人X的细胞的完整染色体对于人Y的细胞是外源性核酸。
功能相等具有相同功能。在酶方面，功能相等分子包括保持酶功能的不同分子。例如，可通过酶序列中的序列改变提供功能等价物，其中有1个或多个序列改变的肽保持未改变肽的功能，从而它保留其酶活性。在一个特定例子中，色氨酸转氨酶功能等价物保持使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的能力。
序列改变的例子包括但不限于保守取代、缺失、突变、移码和插入。在一个例子中，特定多肽结合抗体，功能等价物是结合相同抗体的多肽。因此，功能等价物包括具有结合特异性与多肽相同的肽，且能用作取代多肽的试剂。在一个例子中，功能等价物包括多肽，其中结合序列不连续，抗体结合线性抗原表位。因而，如果肽序列是MPELANDLGL(SEQ ID NO12的氨基酸1-10)，功能等价物包括不连续抗原表位，可表示如下(**＝任何数量的间插氨基酸)NH2-**-M**P**E**L**A**N**D**L**G**L-COOH。在此例子中，如果多肽的3维结构能使它结合单克隆抗体，此抗体结合SEQ ID NO12的氨基酸1-10，则多肽与SEQ ID NO12的氨基酸1-10功能相等。
杂交如本文所用，术语“杂交”指测试2种核酸分子的核苷酸序列中互补性的方法，以互补单链DNA和/或RNA形成双链分子的能力为基础。核酸杂交技术能用于在本发明范围内获得分离的核酸。简要地，与SEQ ID NO11所列序列有一些同源性的任何核酸可用作探针以通过在中等到高度严格的条件下杂交来鉴定类似核酸。一旦鉴定，随后可纯化核酸、测序并分析以确定它是否在本发明的范围内。
杂交能分别通过Southern或Northern分析进行以鉴定与探针杂交的DNA或RNA序列。标记探针可用生物素、洋地黄毒苷、多肽或放射性同位素如32P。待分析的DNA或RNA可在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转至硝化纤维、尼龙或其它合适的膜，用本领域熟知的标准技术与探针杂交，如Sambrook等，(1989)《分子克隆》(Molecular Cloning)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，NY的7.39-7.52部分所述。通常，探针至少约20个核苷酸长度。例如，对应于SEQ ID NO11所列20个连续核苷酸序列的探针能用于鉴定相同或类似核酸。此外，能使用比20个核苷酸长或短的探针。
本发明也提供至少约12个碱基长度(如至少约13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、100、250、500、750、、、个碱基长度)的分离的核酸序列并在杂交条件下与有SEQ ID NO11所列序列的核酸的有义或反义链杂交。杂交条件可以是中等或高度严格的杂交条件。
为了本发明目的，中等严格的杂交条件指杂交在杂交溶液中约42℃进行，溶液含25mM KPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart溶液、50μg/ml变性、超声处理的鲑精DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(约5×107cpm/μg)，而洗涤在约50℃进行，洗涤液含2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠。
高度严格的杂交条件指杂交在杂交溶液中约42℃进行，溶液含25mMKPO4(pH7.4)、5X SSC、5X Denhart溶液、50μg/ml变性、超声处理的鲑精DNA、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和1-15ng/mL探针(约5×107cpm/μg)，而洗涤在约65℃进行，洗涤液含0.2X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠。
分离如本文所用，关于核酸的术语“分离”指天然产生的核酸，它与生物体的天然产生基因组中直接毗连的序列(一个在5’末端且一个在3’末端)不直接毗连，它来源于此生物体。例如，分离的核酸可无限制地是任意长度的重组DNA分子，只要去除或缺少一种核酸序列，通常在天然产生的基因组中发现这些序列在重组DNA分子侧翼。因此，分离的核酸无限制地包括作为单独分子(如通过PCR或限制性核酸内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在且不取决于其它序列的重组DNA以及掺入载体、自主复制质粒、病毒(如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或者掺原核或真核生物基因组DNA的重组DNA。此外，分离的核酸可包括是部分杂合或融合核酸序列的重组DNA分子。
如本文所用，关于核酸的术语“分离”也包括任何非天然产生的核酸，因为非天然产生的核酸序列不在自然界中发现且没有天然产生的基因组中的直接毗连序列。例如，非天然产生的核酸如认为工程核酸是分离的核酸。工程核酸能用普通分子克隆或化学核酸合成技术产生。分离的非天然产生的核酸可不取决于其它序列，或掺入载体、自主复制质粒、病毒(如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或者原核或真核生物的基因组DNA。此外，非天然产生的核酸可包括是部分杂合或融合核酸序列的核酸分子。
本领域技术人员明白在百到百万的其它核酸分子中存在的核酸不认为是分离的核酸，这些核酸分子在例如cDNA或基因组文库或者含基因组DNA限制酶切消化的凝胶切片内。
核酸如本文所用，术语“核酸”涵盖RNA和DNA，无限制地包括cDNA、基因组DNA和合成(如化学合成)DNA。核酸可以是双链或单链。当单链时，核酸可以是有义链或反义链。上外，核酸可以是环形或线性。
可操作连接当第一种核酸序列以与第2种核酸序列的功能性关系放置时，第一种核酸序列“可操作连接”第2种核酸序列。例如，如果启动子影响编码序列的转录，启动子可操作连接编码序列。一般，可操作连接的DNA序列是连续的，在相同读框中有必要连接2个多肽编码区。
多肽修饰本发明包括酶以及其合成的实施方案。此外，具有所需酶活性的类似物(非肽有机分子)、衍生物(化学功能性肽分子，以所示肽序列起始获得)和变体(同系物)能用于本文所述方法。本文所示肽包括氨基酸序列，氨基酸可以是L-和/或D-氨基酸，天然产生的或其它。
肽能通过多种化学技术修饰以产生衍生物，衍生物有与未修饰肽本质上相同的活性且任选有其它所需性质。例如，蛋白的羧酸基团无论是羧基末端或侧链，可以药学上可接受阳离子的盐形式提供或酯化以形成C1-C16酯，或者转变成公式NR1NR2的酰胺，其中R1和R2各是独立的H或C1-C16烷基，或者结合以形成杂环如5-或6-元环。肽的氨基无论是氨基末端或侧链，可以药学上可接受的酸加成盐形式提供如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其它有机盐，或可修饰成C1-C16烷基或二烷基氨基或者进一步转变成酰胺。
肽侧链的羟基可用公认的技术转变成C1-C16烷氧基或转变成C1-C16酯。肽侧链的苯基和酚环可用1个或多个卤原子取代如F、Cl、Br或I，或者用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸和其酯或者这种羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可延伸到同源的C2-C4亚烃基。硫醇可用一些公认保护基团的任何一种保护，如乙酰胺基团。本领域技术人员也认可将环状结构导入本发明肽的方法，用于选择和提供构象约束给结构，导致稳定性提高。例如，C-或N-末端半胱氨酸可加入肽中，这样肽在氧化时包含二硫键，产生环状肽。其它肽环化方法包括形成硫醚及羧基和氨基末端酰胺和酯。
肽模拟物和有机模拟物实施方案也在本发明的范围内，其中这类肽和有机模拟物的化学组分的三维排列模拟肽主链和组成氨基酸侧链的三维排列，产生本发明蛋白的这种肽和有机模拟物，它们有可检测酶活性。对于计算机模型应用，药效团是生物活性的结构要求的、理想的三维定义。能用目前的计算模型软件(使用计算机辅助的药物设计或CADD)设计肽和有机模拟物符合各药效团。参见Walters，“计算机辅助的药物模型”(Computer-Assisted Modeling of Drugs)，Klegerman和Groves(主编)，《制药生物技术》(Pharmaceutical Biotechnology)，1993，InterpharmPressBuffalo Grove，IL，165-74页和102章，Munson(主编)，《药理学原理》(Principlesof Pharmacology)，1995，Chapman&Hall，描述用于CADD的技术。本发明范围也包括用这些技术制备的模拟物。在一个例子中，模拟物模拟酶或者其变体、片段或融合产生的酶活性。
探针和引物核酸探针和引物可在本文提供的氨基酸序列和核酸序列基础上容易制备。“探针”包括分离的核酸，核酸含可检测标记或报道分子。示范标记包括但不限于放射性同位素、配基、化学发光剂和多肽。标记方法和选择适于不同目的的标记指南讨论于例如Sambrook等(主编)，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，1-3卷，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989，Ausubel等(主编)，《新编分子生物学实验指南》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York(定期更新)，1987。
“引物”通常是有10个或更多核苷酸的核酸分子(如有约10个核苷酸到约100个核苷酸的核酸分子)。引物可通过核酸杂交与互补靶核酸链退火以形成引物与靶核酸链间的杂合体，随后通过例如DNA聚合酶多肽沿着靶核酸链延伸。引物对能用于扩增核酸序列，如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它本领域已知的核酸扩增方法。
制备和使用探针及引物的方法描述于例如参考文献如Sambrook等(主编)，《分子克隆实验室手册》，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.1989；Ausubel等(主编)，《新编分子生物学实验指南》，Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York(定期更新)，1987；Innis等(主编)，《PCR操作方法和应用指南》(PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications)，AcademicPressSan Diego，1990。PCR引物对可来源于已知序列，例如使用用于此目的的计算机程序如Primer(版本0.5，?1991，Whitehead Institute for BiomedicalResearch，Cambridge，Mass.)。本领域技术人员理解特定探针或引物的特异性随着长度增加，但探针或引物大小范围可从全长序列到短至5个连续核苷酸的序列。因此，例如20个连续核苷酸的引物与靶退火的特异性高于仅15个核苷酸的对应引物。因而，为获得较大特异性，可选择探针和引物包含例如10、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、或更多连续核苷酸。
启动子核酸阵列控制指导核酸转录的序列。启动子包括转录起始位置附近的必需核酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况中的TATA元件。启动子可包括远端增强子或抑制子元件，它们可位于离转录起始位置多达几千碱基对的地方。
纯化如本文所用，术语“纯化”不需要绝对纯度；它作为一个相对术语。因此，例如在纯化的多肽或核酸制品中，主题多肽或核酸的浓度分别高于其在生物体内天然环境中的多肽或核酸。例如，如果制品中多肽含量代表至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％的制品总蛋白含量时，认为多肽制品纯化了。
重组“重组”核酸有(1)其表达生物体中非天然产生的序列或(2)通过人工组合2种不同分离、较短序列产生的序列。此人工组合通常通过化学合成完成，或更常通过人工操作分离的核酸区段，如遗传工程技术。“重组”也用于描述人工操作的核酸分子，但它含与生物体中发现的相同调节序列和编码区，核酸分离自此生物体。
序列同一性氨基酸序列间的相似性根据序列间的相似性表示，序列间的相似性另外称为序列同一性。序列同一性常以百分比同一性(或相似性或同源性)测量；百分比越高，2种序列越相似。当用标准方法排列时，肽如SEQ ID NO12的同系物或变体具有相对高程度的序列同一性。
用于比较的序列排列方法在本领域熟知。多种程序和排列算法描述于Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.70；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988；Higgins和Sharp，Gene 88；Higgins和Sharp，CABIOS 89；Corpet等，NucleicAcids Research ，1988；Altschul等，Nature Genet.94。
NCBI基本局部排列检索工具(BLASTTM)(Altschul等，J.Mol.Biol.，1990)可获得自一些来源，包括全国生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和因特网，用于连接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。
肽的变体的特征通常是在全长排列氨基酸序列时计算具有至少50％序列同一性，使用NCBI Blast 2.0，缺口blastp设定为默认参数。为比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列，使用Blast 2.0序列功能，用设定为默认参数的默认BLOSUM62矩阵(间隙存在值为11，每残基间隙值为1)。当排列短肽(少于约30个氨基酸)时，排列用Blast 2序列功能进行，使用设定为默认参数的PAM30矩阵(开放间隙9，延伸间隙1罚分)。当通过此方法评估与参考序列相似性更高的蛋白时，显示百分比同一性增加，如至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或者甚至至少99％序列同一性。当比较不够完整的序列用于序列同一性时，同秒物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗口中具有至少80％序列同一性，可具有的序列同一性为至少85％、至少90％、至少95％或98％，这取决于它们与参考序列的相似性。在这种短窗口中确定序列同一性的方法描述于全国生物技术信息中心，Bethesda，Maryland维护的网址。本领域技术人员理解提供这些序列同一性范围仅用于指导；完全有可能在所提供范围外获得很显著的同秒物。
类似方法能用于确定核酸序列的百分比序列同一性。在一个特定例子中，同源序列与天然序列一起排列，匹配数通过计算2种序列中存在的相同核苷酸或氨基酸残基的位置数来确定。确定百分比序列同一性是通过匹配数除以鉴定序列(如SEQ ID NO11)所示序列的长度或连接长度(如来自鉴定序列中所示序列的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，接着所得值乘以100。例如，当与SEQ ID NO11所示序列排列时，有1166个匹配的核酸序列与SEQ ID NO11所示序列是75％相同(即*100＝75.0)。注意到百分比序列同一性值四舍五入到最接近的十分之王。例如，75.11、75.12、75.13和75.14下舍到75.1，而75.15、75.16、75.17、75.18和75.19上舍到75.2。也注意到长度值总是整数。在另一个例子中，含20个核苷酸区的靶序列与来自鉴定序列的20个连续核苷酸如下排列，它包含的区域享有与鉴定序列75％序列同一性(即15÷20*100＝75)。
20靶序列AGGTCGTGTACTGTCAGTCA| || ||| |||| |||| |鉴定序列
ACGTGGTGAACTGCCAGTGA特异结合剂试剂能特异结合本文所述任何多肽。例子包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(包含人源化单克隆抗体)、单克隆抗体片段如Fab、F(ab’)2和Fv片段以及任何其它能特异结合这种多肽的抗原表位的试剂。
本文提供多肽(或其片段、变体或融合)的抗体能用于纯化或鉴定这种多肽。本文提供的氨基酸和核酸序列可生成以抗体为基础的特异结合剂，试剂识别本文所述多肽。
可生成多肽、多肽部分或其变体的单克隆或多克隆抗体。抗多肽抗原上1个或多个抗原表位产生的抗体最佳地特异检测多肽。即抗特定多肽产生的抗体会识别和结合此特定多肽，且不充分识别或结合其它多肽。抗体特异结合特定多肽通过任何一些标准免疫测定方法确定，例如蛋白质印迹(参见例如Sambrook等(主编)，《分子克隆实验室手册》，第2版，1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989)。
为通过蛋白质印迹确定特定抗体制品(如小鼠中抗多肽生成的制品，多肽具有SEQ ID NO12所列氨基酸序列)特异检测适当多肽(如有SEQ ID NO12所列氨基酸序列的多肽)，总细胞蛋白可从细胞提取并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
分离的总细胞蛋白随后可转至膜(如硝化纤维)，抗体制品与膜孵育。洗膜以去除非特异结合抗体后，特异结合抗体的存在能用缀合多肽如碱性磷酸酶的适当二抗(如抗小鼠的抗体)检测，因为应用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/硝基蓝四唑通过免疫定位的碱性磷酸酶法生成浓的蓝色化合物。
适合用作免疫原的充分纯化多肽能获得自转染细胞、转化细胞或野生型细胞。可调节终制品中的多肽浓度到几微克每毫升的水平，例如通过Amicon过滤装置上的浓度。此外，能用作免疫原的多肽大小范围从全长多肽到有少至9个氨基酸残基的多肽。这种多肽可在细胞培养中生成，能用标准方法化学合成，或可通过将大多肽切割成能纯化的较小多肽来获得。当主要组织相容性复合体(MHC)分子中呈递给免疫系统时，有少至9个氨基酸残基长度的多肽可以是免疫原性的，MHC分子如MHC I类和II类分子。因此，有本文所示任何氨基酸序列的至少9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、900、、、、或更多连续氨基酸残基的多肽可用作免疫原以生成抗体。
本文所示任何多肽的单克隆抗体可根据Kohler和Milstein(Nature ，1975)的经典方法或其衍生方法制备自鼠杂交瘤。
多克隆抗血清含本文所示任何多肽的异源抗原表位的抗体，抗血清可通过多肽(或其片段)免疫合适的动物来制备，多肽可以是未修饰或修饰的以增强免疫原性。用于兔的有效免疫操作可发现于Vaitukaitis等(J.Clin.Endocrinol.Metab.71)。
抗体片段可用于取代完整抗体且易在原核宿主细胞中表达。免疫有效部分的单克隆抗体也称为“抗体片段”，其产生和使用的方法熟知且包括Better和Horowitz(Methods Enzymol.，1989)、Glockshuber等(Biochemistry，1990)、美国专利号5,648,237(《功能性抗体片段的表达》(Expression ofFunctional Antibody Fragments))、美国专利号4,946,778(《单一多肽链结合分子》(Single Polypeptide Chain Binding Molecules))、美国专利号5,455,030(《使用单链多肽结合分子的免疫治疗》(Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide BindingMolecules))和其引用的参考文献中描述的抗体片段。
转化“转化”细胞是核酸分子导入的细胞，例如通过分子生物学技术。转化涵盖所有将核酸分子导入这种细胞的技术，包括但不限于用病毒载体转染、接合、用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染和粒子枪加速导入裸露DNA。
变体、片段或融合蛋白所示蛋白包括其变体、片段和融合。DNA序列(例如SEQ ID NO11)编码蛋白(例如SEQ ID NO12)、融合蛋白或者蛋白片段或变体，能改造序列以使蛋白在真核细胞、细菌、昆虫和/或植物中表达。为获得表达，可改变DNA序列并可操作连接其它调节序列。含调节序列和蛋白的终产物称为载体。此载体能导入真核生物、细菌、昆虫和/或植物细胞。一旦进入细胞，载体允许蛋白生成。
融合蛋白包括蛋白如色氨酸转氨酶(或其变体、多态性、突变体或片段)，例如SEQ ID NO12，融合蛋白连接其它不抑制所需蛋白活性的氨基酸序列，例如使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的能力。在一个例子中，其它氨基酸序列长度不大于约10、12、15、20、25、30或50个氨基酸。
本领域普通技术人员理解DNA序列能以多种方法改变而不影响编码蛋白的生物活性。例如，PCR可用于在编码蛋白的DNA序列中产生变化。这种变体可以是对宿主细胞中密码子优先性最佳化的变体，用于表达蛋白，或者是其它促进表达的序列变化。
载体核酸分子导入细胞，从而生成转化细胞。载体可包括能使它在细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体也可包括1个或多个可选择标记基因和本领域已知的其它遗传元件。
生物合成途径的概述如图1-3和11-13所示，许多生物合成途径能用于生成monatin或其中间物如吲哚-3-丙酮酸或MP。为将各底物(葡萄糖、色氨酸、吲哚-3-乳酸、吲哚-3-丙酮酸和MP)转变成各产物(色氨酸、吲哚-3-丙酮酸、MP和monatin)，可使用一些不同多肽。此外，这些反应可体内、体外完成，或通过体内反应和体外反应的组合，如包括非酶化学反应的体外反应。因此，图1-3和11-13是示范，显示能用于获得所需产物的多种不同途径。
葡萄糖到色氨酸许多生物体能从葡萄糖合成色氨酸。含从葡萄糖和/或色氨酸生成monatin、MP和/或吲哚-3-丙酮酸所需基因的构建物可克隆入这种生物体中。本文显示色氨酸可转变成monatin。
在其它例子中，生物体用已知多肽改造以生成色氨酸或超量产生色氨酸。例如，美国专利号4,371,614(纳入本文供参考)描述用质粒转化的大肠杆菌菌株，质粒含野生型色氨酸操纵子。
美国专利号4,371,614所示色氨酸的最大效价约为230ppm。类似地，WO8701130(纳入本文供参考)描述遗传改造以生成色氨酸的大肠杆菌菌株并讨论增加发酵生产L-色氨酸。本领域技术人员认识到能从葡萄糖生成色氨酸的生物体也能利用其它可转变成葡萄糖或果糖-6-磷酸的碳源和能源，结果类似。示范性碳源和能源包括但不限于蔗糖、果糖、淀粉、纤维素或甘油。
色氨酸到吲哚-3-丙酮酸一些多肽可用于使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸。示范性多肽包括酶种类(EC)2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1和2.6.1.21的成员。这些种类包括名为色氨酸转氨酶的多肽(也命名为L-苯丙氨酸-2-氧戊二酸转氨酶、色氨酸转氨酶、5-羟基色氨酸-酮戊二酸转氨酶、羟基色氨酸转氨酶、L-色氨酸氨基转移酶、L-色氨酸转氨酶、L-色氨酸2-氧戊二酸转氨酶)，它将L-色氨酸和2-氧戊二酸转变成吲哚-3-丙酮酸和L-谷氨酸；D-色氨酸转氨酶，它使D-色氨酸和2-含氧酸转变成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶(也名为NAD(P)-L-色氨酸脱氢酶、L-色氨酸脱氢酶、L-Trp-脱氢酶、TDH和L-色氨酸NAD(P)氧化还原酶(脱氨))，它将L-色氨酸和NAD(P)转变成吲哚-3-丙酮酸和NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脱氢酶，它使D-氨基酸和FAD转变成吲哚-3-丙酮酸和NH3和FADH2；色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(也名为L-色氨酸-α-酮异已酸转氨酶和L-色氨酸苯基丙酮酸转氨酶)，它将L-色氨酸和苯基丙酮酸转变成吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶(也名为蛇氨基酸氧化酶和L-氨基酸氧氧化还原酶(脱氨))，它使L-氨基酸和H2O和O2转变成2-含氧酸和NH3和H2O2；D-氨基酸氧化酶(也名为蛇氨基酸氧化酶和D-氨基酸氧氧化还原酶(脱氨))，它将D-氨基酸和H2O和O2转变成2-含氧酸和NH3和H2O2；色氨酸氧化酶，它使L-色氨酸和H2O和O2转变成吲哚-3-丙酮酸和NH3和H2O2。这些种类也包含酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或D-丙氨酸)转氨酶和有多种转氨酶活性的广(多底物)转氨酶，其中一些能使色氨酸和2-含氧酸转变成吲哚-3-丙酮酸和氨基酸。
转氨酶种类的11个有这种活性的成员描述于下面的实施例1，包括SEQ IDNOS11和12所示的新转氨酶。因此，本发明提供分离的核酸和蛋白序列，与SEQID NOS11和12有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或甚至至少99％的序列同一性。本发明也涵盖SEQ ID NOS11和12的片段和融合，它们保持转氨酶活性或编码有转氨酶活性的蛋白。示范性片段包括但不限于至少10、12、15、20、25、50、100、200、500或1000个SEQ ID NO11的连续核苷酸或至少6、10、15、20、25、50、75、100、200、300或350个SEQ ID NO12的连续核苷酸。所示序列(和其变体、片段和融合)可以是部分载体。载体能用于转化宿主细胞，从而生成重组细胞，重组细胞可从色氨酸产生吲哚-3-丙酮酸，在一些例子中能进一步生成MP和/或monatin。
已知L-氨基酸氧化酶(1.4.3.2)，序列可分离自一些不同来源，如蝰蛇(Viperalebetine)(sp P81375)、眼睛蛇(Ophiophagus hannah)(sp P81383)、蝮蛇(Agkistrodonrhodostonma)(sp P81382)、响尾蛇(Crotalus atrox)(sp P56742)、洋葱假单孢菌(Burkholderia cepaica)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、新月柄杆菌(Caulobactercresentus)、莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小鼠(Mus musculus)、丁香假单胞菌(P.Syringae)、和红球菌(Rhodococcus)菌株。此外，色氨酸氧化酶描述于文献且能分离自例如鬼伞(Coprinus)属SF-1、有根肿病的大白菜、拟南芥和哺乳动物的肝。能将色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸的1个L-氨基酸氧化酶类成员讨论于下面的实施例3以及分子克隆的另外来源。许多D-氨基酸氧化酶基因存在于分子克隆的数据库。
已知色氨酸脱氢酶，且可分离自例如菠菜、豌豆(Pisum sativum)、柔黄花牧豆树(Prosopis juliflora)、豌豆、牧豆树、小麦、玉米、番茄、烟草、紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和乳杆菌(Lactobacilli)。已知许多D-氨基酸脱氢酶序列。
如图11-13所示，如果氨基酸氧化酶如色氨酸氧化酶用于使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸，能加入过氧化氢酶以减少或甚至去除过氧化氢的存在。
吲哚-3-乳酸到吲哚-3-丙酮酸将吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸的反应可通过多种多肽催化，如1.1.1.110、1.1.1.27、1.1.1.28、1.1.2.3、1.1.1.222、1.1.1.237、1.1.3.-或1.1.1.111多肽类的成员。1.1.1.110多肽类包括吲哚乳酸脱氢酶(也名为吲哚乳酸NAD+氧化还原酶)。1.1.1.27、1.1.1.28和1.1.2.3类包括乳酸脱氢酶(也名为乳酸脱氢酶、乳酸NAD+氧化还原酶)。1.1.1.222类包含(R)-4-羟苯基乳酸脱氢酶(也名为D-芳族乳酸脱氢酶、R-芳族乳酸脱氢酶和R-3-(4-羟苯基)乳酸NAD(P)+2-氧化还原酶)且1.1.1.237类包含3-(4-羟苯基丙酮酸)还原酶(也名为羟苯基丙酮酸还原酶和4-羟苯基乳酸NAD+氧化还原酶)。1.1.3.-类包含乳酸氧化酶，1.1.1.111类包含(3-咪唑-5-基)乳酸脱氢酶(也名为(S)-3-(咪唑-5-基)乳酸NAD(P)+氧化还原酶)。可能这些种类的一些多肽能从吲哚-3-乳酸生成吲哚-3-丙酮酸。此转变的例子提供于实施例2。
化学反应也能用于使吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸。这种化学反应包括能用一些方法完成的氧化步骤，例如空气氧化，使用B2催化剂(China ChemicalReporter，13卷，28期，18页(1)，2002)、d金属催化剂存在时稀释高锰酸盐和高氯酸盐或过氧化氢。
吲哚-3-丙酮酸到2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(MP)一些已知多肽能用于使吲哚-3-丙酮酸转变成MP。示范多肽种类包括4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17和4.1.2.-。这些种类包括碳-碳合酶/裂合酶，如催化2种羧酸底物缩合的醛缩酶。肽类EC 4.1.3.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用含氧酸底物(如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电体，而EC 4.1.2.-是形成碳-碳键的合酶/裂合酶，使用醛底物(如苯甲醛)作为亲电体。
例如，EP 中所述多肽(EC 4.1.3.16、4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸-裂合酶，也名为4-羟基-2-氧戊二酸醛缩酶、2-氧-4-羟基戊二酸醛缩酶或KHG醛缩酶)将乙醛酸和丙酮酸转变成4-羟基-2-酮戊二酸，多肽4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(EC 4.1.3.17，也名为4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸-裂合酶或ProA醛缩酶)缩合2种酮酸如2个丙酮酸到4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸。本文描述利用这些裂合酶的反应。
图1-2和11-13显示这些反应的示意图，其中3-碳(C3)分子结合吲哚-3-丙酮酸。EC 4.1.2.-和4.1.3.-的许多成员特别是利用PLP的多肽能使用C3分子，C3分子是氨基酸如丝氨酸、半胱氨酸和丙氨酸或其衍生物。由EC 4.1.2.-和4.1.3.-代表催化的醛醇缩合需要此途径的3个碳分子是丙酮酸或丙酮酸衍生物。然而，其它化合物能作为C3碳源且可转变成丙酮酸。丙氨酸可通过许多利用PLP的转氨酶来转氨以产生丙酮酸，包括许多上述的转氨酶。可通过β消除反应(如由色氨酸酶或β酪氨酸酶催化)获得丙酮酸和氨，反应用于L-丝氨酸、L-半胱氨酸、有足够离去基团的丝氨酸和半胱氨酸的衍生物，如O-甲基-L-丝氨酸、O-苄基-L-丝氨酸、S-甲基半胱氨酸、S-苄基半胱氨酸、S-烷基-L-半胱氨酸、O-酰基-L-丝氨酸和3-氯-L-丙氨酸。天冬氨酸可在PLP-介导的β-裂合酶反应中用作丙酮酸的来源，如色氨酸酶(EC4.1.99.1)和/或β-酪氨酸酶(EC 4.1.99.2，也名为酪氨酸-酚裂合酶)催化的反应。通过在(4.1.99.1-2)多肽上进行定点突变可增加β-裂合酶反应速度，如Mouratou等(J.Biol.Chem ，1999)和实施例8所述。这些修饰使多肽接受二羧基氨基酸底物。乳酸盐也能用作丙酮酸的来源，且通过加入乳酸脱氢酶和氧化辅因子或乳酸氧化酶和氧来氧化成丙酮酸。这些反应的例子描述于下。例如，如图2和图11-13所示，当丙酮酸用作C3分子时，ProA醛缩酶能接触吲哚-3-丙酮酸。
MP可用化学反应产生，如实施例5提供的醛醇缩合。
MP到MonatinMP到monatin的转变可由下列1个或多个催化色氨酸转氨酶(EC 2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(EC1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯丙酮酸转氨酶(EC 2.6.1.28)或更多转氨酶家族(2.6.1.-)的一般成员如天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶或D-丙氨酸(2.6.1.21)转氨酶(图2)。转氨酶类的11个成员描述于下(实施例1)，包括SEQ ID NOS11和12所示新的种类成员，实施例7提供证明转氨酶和脱氢酶活性的反应。
此反应也能用化学反应进行。酮酸(MP)胺化通过还原性胺化用氨和氰硼氢化钠进行。
图11-13显示另外的多肽，它们能用于使MP转变成monatin以及增加来自吲哚-3-丙酮酸或色氨酸的monatin产量。例如，如果天冬氨酸用作氨基供体，天冬氨酸转氨酶能用于使天冬氨酸转变成草酰乙酸(图11)。草酰乙酸通过脱羧酶转变成丙酮酸和二氧化碳，如草酰乙酸脱羧酶(图11)。此外，如果赖氨酸用作氨基供体，赖氨酸ε转氨酶可用于使赖氨酸转变成ε-醛基赖氨酸(图12)。ε-醛基赖氨酸自发转变成1-哌啶6-羧酸盐(图12)。如果能催化还原性胺化反应的多肽(如谷氨酸脱氢酶)用于将MP转变成monatin，可使用能再循环NAD(P)H和/或生成挥发性产物的多肽，如甲酸脱氢酶。
设计生物合成途径中的另外考虑取决于哪种多肽用于产生吲哚-3-丙酮酸、MP和/或monatin，能提供辅因子、底物和/或另外多肽给生产细胞以提高产物形成。
去除过氧化氢过氧化氢(H2O2)是产物，如果产生，可对生产细胞有毒且可能损害多肽或产生的中间物。上述L-氨基酸氧化酶产生H2O2作为产物。因此，如果使用L-氨基酸氧化酶，能去除所得H2O2或其水平减少以降低对细胞或产物的潜在损伤。
过氧化氢酶能用于降低细胞中的H2O2水平(图11-13)。生产细胞可表达编码过氧化氢酶(EC 1.11.1.6)的基因或cDNA序列，此酶催化过氧化氢降解成水和氧气。例如，过氧化氢酶可从转染入生产细胞的载体中表达。能使用的过氧化氢酶例子包括但不限于tr|Q9EV50(木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus))、tr|Q9KBE8(耐盐杆菌)、tr|Q9URJ7(白色念珠菌)、tr|P77948(天兰色链霉菌)、tr|Q9RBJ5(野油菜黄单胞菌)(SwissProt登录号。使用L-氨基酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶或色氨酸氧化酶的生物催化反应也能包含过氧化氢酶多肽。
PLP(吡哆醛5’-磷酸)有效性的调节如图1所示，PLP可用于本文所述1个或多个生物合成步骤。能补充PLP浓度，从而PLP不成为对反应总效率的限制。
充分研究大肠杆菌中维生素B6(PLP的前体)的生物合成途径且已结晶一些蛋白(Laber等，FEBS Letters，99)。其它代谢途径中需要2个基因(epd或gapB和serC)，而3个基因(pdA、pdxB和pdxJ)是吡哆醛磷酸生物合成独有的。大肠杆菌途径中的起始物质之一是1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)。从共同的2和3碳中心代谢物合成此前体是由多肽1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DSX)催化。另一个前体是苏氨酸衍生物，它形成自4-碳糖，D-赤藓糖4-磷酸。转变到磷酸-4-羟基-L苏氨酸(HTP)所需的基因是epd、pdxB和serC。形成PLP的最后一个反应是DXP与HTP间的复杂分子内缩合和闭环反应，由pdxA和pdxJ的基因产物催化。
如果PLP成为发酵生产monatin期间的限制营养物，1个或多个途经基因在生产宿主细胞中的表达增加可用于提高monatin产量。宿主生物体可包含多个其天然途径基因的拷贝或非天然途径基因的拷贝可掺入生物体基因组中。另外，补救途径基因的多个拷贝能克隆入宿主生物体中。
1个在所有生物体中保守的补救途径使多种维生素B6的衍生物再循环成活性PLP形式。参与此途径的多肽是pdxK激酶、pdxH氧化酶和pdxY激酶。过量表达1个或多个这些基因可增加PLP有效性。
提高维生素B6水平可通过去除或阻抑宿主生物体中天然生物合成途径基因的代谢调节。PLP阻抑多肽，此多肽参与黄杆菌属(Flavobacterium)菌株238-7中前体苏氨酸衍生物的生物合成。此细菌菌株无代谢控制，过度生成吡哆醛衍生物且能分泌多至20mg/L的PLP。遗传操作以类似方式ε-醛基赖氨酸生成monatin的宿主生物体可增加PLP生成而不过度表达生物合成途径基因。
铵利用能推动色氨酸酶反应趋向合成方向(从吲哚生成色氨酸)，这是通过制备更能利用的氨或去除水。还原性胺化反应如由谷氨酸氢化酶催化的反应，也能通过铵过量来推动。
氨可作为碳酸或磷酸缓冲系统中的碳酸铵或磷酸铵盐存在。氨也能作为丙酮酸铵或甲酸铵提供。另外，如果反应偶联产生氨的反应如谷氨酸脱氢酶或色氨酸脱氢酶，可提供氨。加入EC 4.1.99.-的天然底物(酪氨酸或色氨酸)能产生氨，底物会水解成酚或吲哚、丙酮酸和NH3。通过酶水解其优选底物也能使增加的合成产物的产量超过正常平衡量。
取出产物和副产物色氨酸经色氨酸转氨酶转变成吲哚-3-丙酮酸可能不利地影响吲哚-3-丙酮酸的产率，因为反应生成谷氨酸并需要共底物2-氧戊二酸(α-酮戊二酸)。谷氨酸可能引起转氨酶的抑制，反应会消耗大量共底物。此外，高谷氨酸浓度对下游分离过程有害。
多肽谷氨酸脱氢酶(GLDH)使谷氨酸转变成2-氧戊二酸，从而在反应中再循环共底物，反应由色氨酸转氨酶催化。GLDH也产生还原等价物(NADH或NADPH)，能用于在需氧条件下产生细胞所用能量(ATP)。通过GLDH利用谷氨酸也减少副产物形成。另外，反应产生氨，它能用作细胞的氮源或作为图1所示最后步骤中还原性胺化的底物。因此，过度表达GLDH多肽的生产细胞能用于增加产量和降低培养基和/或分离方法的成本。
在色氨酸到monatin的途径中，如果使用来自适当酶类的转氨酶，步骤3的氨基供体(如谷氨酸或天冬氨酸)可反转变成步骤1所需的氨基受体(如2-氧戊二酸或草酰乙酸)。使用此途径的2个不同转氨酶能提高此途径的效率，其中1个转氨酶的底物不竞争性地抑制另一个转氨酶的活性。
所述途径中的许多反应是可逆的且因此会到达底物和产物间的平衡。可通过从多肽中连续取出产物来增加此途径的产量。例如，monatin用通透酶或其它转运蛋白分泌入发酵液或者从生物催化反应器流中选择性结晶monatin并伴随底物再循环会提高反应产量。
通过另外的酶反应或氨基供体基团的取代来去除副产物是另一种增加反应产量的方法。一些例子讨论于实施例13且示于图11-13。理想生成的副产物不能在反方向中反应，这是通过相变(蒸发)或自发转变成惰性的终产物如二氧化碳。
底物库的调节调节吲哚库可通过增加色氨酸前体生成和/或改变包括吲哚-3-丙酮酸和/或色氨酸的分解代谢途径。例如，减少或去除从吲哚-3-丙酮酸生成吲哚-3-乙酸可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC 4.1.1.74的基因。减少或去除从色氨酸生成吲哚可通过功能性缺失宿主细胞中编码EC 4.1.99.1的基因。另外，过量吲哚能用作体外或体内过程中的底物，结合增加量的编码EC 4.1.99.1的基因(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.，96)。可进行遗传修饰以增加中间物的水平，如D-赤藓糖4-磷酸和分支酸。
在大部分生物体中调节色氨酸生成。一种机制是通过反馈抑制途径中的某些酶；随着色氨酸水平增加，色氨酸的产率减少。因此，当使用经色氨酸中间物生成monatin的工程宿主细胞时，可使用对色氨酸浓度不敏感的生物体。例如，玫瑰长春花(Catharanthus roseus)品系抗多种色氨酸类似物的生长抑制，它通过反复暴露于高浓度5-甲基色氨酸来选择(Schallenberg和Berlin，Z Naturforsch79)。可能由于基因突变，所得品系的色氨酸合酶活性受到产物抑制的影响小。类似地，用于monatin生成的宿主细胞可最优化。
最优化色氨酸生成可使用定向进化，以形成对产物抑制不太敏感的多肽。例如，筛选能在培养基中不含色氨酸的平板上进行，但具有高水平的非代谢色氨酸类似物。美国专利号5,756,345；4,742,007和4,371,614描述用于增加发酵生物体中色氨酸产率的方法。色氨酸生物合成的最后步骤是加入丝氨酸到吲哚；因此能增加丝氨酸的有效性以提高色氨酸生成。
可通过增加宿主生物体产生的丙酮酸量来提高发酵生物体产生的monatin量。一些酵母如丝孢酵母菌(Trichosporon cutaneum)(Wang等，Lett.Appl.Microbiol.02)和光滑球拟酵母菌(Torulopsis glabrata)(Li等，Appl Microbiol.Biotechnol.01)超量产生丙酮酸且能用于实践本文所述方法。另外，可对生物体进行遗传修饰以促进丙酮酸生成，如在大肠杆菌菌株W1485lip2(Kawasaki等，J.Ferm.and Bioeng.96)中。
控制手性通过控制分子的立体化学(手性)能改变monatin的味觉分布。例如，不同食物系统需要不同浓度混合的不同monatin异构体。手性可通过pH和多肽的组合控制。
通过去质子化和再质子化α碳可在monatin的C-4位置(见上面编号的分子)外消旋，这能通过pH变化或与辅因子PLP反应来发生。在微生物中，pH不太可能变化到足以引起外消旋，但PLP丰富。控制多肽手性的方法取决于用于生成monatin的生物合成途径。
当monatin用图2所示途径形成时，可考虑下列各项。在生物催化反应中，碳-2的手性由酶确定，酶使吲哚-3-丙酮酸转变成MP。多种酶(如来自EC 4.1.2.-、4.1.3.-)能使吲哚-3-丙酮酸转变成MP，因此可选择形成所需异构体的酶。另外，将吲哚-3-丙酮酸转变成MP的酶的对映特异性可用定向进化修饰或能改造催化抗体以催化所需反应。一旦生成MP(通过酶法或化学缩合)，可用转氨酶立体特异性加入氨基，如本文所述的转氨酶。能产生碳-4的R或S构象，这取决于使用D-还是L-芳族酸转氨酶。大部分转氨酶对L-异构体特异，然而，D-色氨酸转氨酶存在于一些植物(Kohiba和Mito，《第8届国际维生素B6和羰基催化讨论会会议录》，Osaka，Japan 1990)。此外，鉴定了D-丙氨酸转氨酶(2.6.1.21)、D-甲硫氨酸-丙酮酸转氨酶(2.6.1.41)、(R)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.61)和(S)-3-氨基-2-甲基丙酸转氨酶(2.6.1.22)。一些转氨酶仅接受在C2碳有特定构象的此反应的底物。因此，即使转变成MP不是立体定向的，可通过适当选择转氨酶控制终产物的立体化学。由于反应是可逆的，未反应MP(不需要的异构体)可再循环回到其组分且可再形成MP的外消旋混合物。
底物的激活磷酸化底物如磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP)可用于本文所示反应。磷酸化底物可在能量上更有利，因此可用于增加反应速度和/或产量。在醛醇缩合中，加入磷酸基团稳定亲核底物的烯醇互变异构体，使它更具反应性。在其它反应中，磷酸化底物通常提供更好的离去基团。类似地，可通过转变成CoA衍生物或焦磷酸盐衍生物激活底物。
实施例1色氨酸转氨酶的克隆和表达此例子描述用于克隆色氨酸转氨酶的方法，它可用于使色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸。
实验概述11个编码转氨酶的基因克隆入大肠杆菌中。这些基因是枯草芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶(dat，Genbank登录号Y14082.1 bp 和Genbank登录号NP 分别为核酸序列和氨基酸序列)、苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)酪氨酸转氨酶(tatA，SEQ ID NOS1和2分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1酪氨酸转氨酶(tatA通过同源性确定，SEQ ID NOS3和4分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球细红菌35053酪氨酸转氨酶(通过同源性确定，SEQ IDNOS5和6，分别硕大利什曼原虫广底物转氨酶(bsat，通过与来自墨西哥利什曼原虫(L.mexicana)的肽片段的同源性确定，SEQ ID NOS7和8分别为核酸序列和氨基酸序列)、枯草芽孢杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NOS9和10分别为核酸序列和氨基酸序列)、嗜淀粉乳杆菌芳族转氨酶(araT，通过同源性确定，SEQ ID NOS11和12，分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌35053多底物转氨酶(通过同源性确定，SEQ ID NOS13和14分别为核酸序列和氨基酸序列)、类球红细菌菌株2.4.1多底物转氨酶(msa，通过同源性确定，Genbank登录号AAAE，bp 和Genbank登录号ZP分别为核酸序列和氨基酸序列)、大肠杆菌天冬氨酸转氨酶(aspC，Genbank登录号AE bp和Genbank登录号AAC74014.1分别为核酸序列和氨基酸序列)和大肠杆菌酪氨酸转氨酶(tyrB，SEQ ID NOS31和32分别为核酸序列和氨基酸序列)。
克隆、表达了基因并测试它在色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸中的活性，与可商业购买的酶一起。所有11个克隆有活性。
鉴定可能包含有所需活性的多肽的细菌菌株NCBI(全国生物技术信息中心)数据库中没有基因命名为色氨酸转氨酶。然而，鉴定了有此酶活性的生物体。在细胞提取物或纯化蛋白中测量到L.色氨酸转氨酶(TAT)活性，蛋白来自下列来源羊茅(Festuca octoflora)的根瘤菌分离物、豌豆线粒体和细胞溶质、向日葵冠瘿细胞、豌豆根瘤菌三叶草生物变种(R.leguminosarumbiovar trifoli)、草生欧文氏菌石头花致病变种(e.herbicola pv.Gypsophilae)、丁香假单胞菌萨氏致病变种(P.Syringae pv.Savastanio)、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、生脂固氮螺菌(Azospirillum lipferum)、巴西固氮力(A.brasilense)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、团聚肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanii)、麦芽念珠菌(C.maltosa)、棕色固氮菌(A.vinelandii)、大鼠脑、大鼠肝、苜蓿根瘤菌、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0、乳酸乳球菌(L.Lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、瑞士乳杆菌(L.Helveticus)、小麦苗、大麦、金色菜豆菌(？Phaseolus aureus)(绿豆)、酵母uvarum(carlsbergensis)、利什曼原虫属、玉米、番茄茎、豌豆植物、烟草、猪、生孢梭菌(C.Sporogenes)和灰色链霉菌(Streptomyces griseus)。
分离基因组DNA用于克隆苜蓿根瘤菌(ATCC号9930)在TY培养基中25℃，pH7.2生长。细胞生长到600nm(OD600)的光密度为1.85且2％接种物用于基因组DNA制备。Qiagen genomietip 20/G试剂盒(Valencia，CA)用于基因组DNA分离。
枯草芽孢杆菌6051(ATCC)在Bereto营养肉汤(Difco；Detroit，MI)中30℃生长。Qiagen genomic tip 20/G操作用于分离基因组DNA，有下列变化蛋白酶K和溶菌酶的浓度加倍且接种时间增加2-3倍。
硕大利什曼原虫ATCC 50122基因组DNA由IDI，Inc.(Quebec，Canada)提供，此DNA在pH8.0，17ng/μL的TE缓冲液中。
类球红细菌2.4.1(由Sam Kaplan教授，Univeristy of Texas，Houston提供)、类球红细菌35053(ATCC号)和嗜淀粉乳酸菌基因组DNA通过标准酚抽提制备。细胞在后对数后收集，重悬浮于TEN缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5、1mM EDTA、100mM NaCl)，每mL细胞悬浮液加入0.024mL月桂基肌氨酸钠裂解。用等体积酚抽提至少3次后，DNA溶液用9∶1氯仿∶辛醇抽提1次并用氯仿抽提3次，酚用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7.5、1mM EDTA)饱和。通过加入0.1体积3M乙酸钠，pH6.8和2体积乙醇沉淀DNA。通过离心收集沉淀并用70％乙醇洗涤1次。最后，DNA溶于0.10mL蒸馏水。
大肠杆菌基因组DNA从菌株DH10B(Invitrogen)分离且用QiagenGenomic-tipTM(500/G)试剂盒制备。菌株在LB中生长到OD650为1.87，从30mL此菌株中获得0.3mg纯化的DNA。纯化的DNA以0.37μg/μL的浓度溶于Qiagen洗脱缓冲液(EB)。
聚合酶链式反应操作设计引物的突出端与pET30 Xa/LIC载体(Novagen，Madison，WI)相容。PET载体在Xa/LIC位点的5’侧有12个碱基的单链突出端且在Xa/LIC位点的3’侧有15个碱基的单链突出端。设计质粒用于连接独立的克隆，用N-末端His和S-标记和任选的C-末端His标记。Xa蛋白酶识别位点(IEGR)直接位于感兴趣基因的起始密码子前，从而能去除融合蛋白标记。
当设计引物时，下列序列加到生物体特定序列的5’末端正向引物，5’GGTATTGAGGGTCGC(SEQ ID NO73)；反向引物5’AGAGGAGAGTTAGAGCC(SEQ ID NO74)。
枯草芽孢杆菌dat引物N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAGGTTTTAGTCAATGG-3’和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGAAATGCTAGCAGCCT-3’(SEQ ID NO15和16)。
苜蓿根瘤菌tatA引物N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTCGACGCCCTCGCCCG和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGAGACTGGTGAACTTGC(SEQ ID NO17和18)。
枯草芽孢杆菌araT引物N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAACATTTGCTGAATCC和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAAACGCCGTTGTTTATCG(SEQ ID NO19和20)。
类球红细菌msa(2.4.1和35053)N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCGAGCCTCTTGCCCT和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGGGGAAGCTCCGGG(SEQ ID NO21和22)。
硕大利什曼原虫bsatN末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCACGCAGGCGGCCAT和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCACTCGATTCACATTGC(SEQ ID NO23和24)。
嗜淀粉乳杆菌araTN末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCCAGAATTAGCTAATGA和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATTCGTCCTCTGTAAAA(SEQ ID NO25和26)。
类球红细菌tatA(2.4.1和35053菌株)N末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGCTCTACGACGGCTCC和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCGCGCAGCACCTTGG(SEQ ID NO27和28)。
大肠杆菌aspCN末端5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTTTGAGAACATTACCGC-3’和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3’(SEQ ID NO29和30)。
大肠杆菌tyrBN末端5’-GGTATTGAGGGTCGCGTGTTTCAAAAAGTTGACGC和C末端5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACATCACCGCAGCAAACG-3’(SEQ ID NO33和34)。
来源于苜蓿根病菌(tatA)的基因用下列PCR操作扩增。在50μL反应中使用0.1-0.5μg模板、1.5μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真聚合酶(Roche，Indianapolis，IN)和有Mg的1x expandTM缓冲液。所用热循环仪程序包括96℃ 5分钟的热启动，接着是29个下列步骤的重复94℃ 30秒，55℃ 2分钟，72℃ 2.5分钟。29个重复后，样品在72℃保持10分钟，随后4℃贮存。此PCR操作产生1199bp的产物。
来源于类球红细菌(msa和tatA)、嗜淀粉乳杆菌araT和杆菌araT的基因序列用下列PCR操作扩增。在50μL反应中，使用0.1-0.5μg模板、1.5μM各引物、0.4mM各dNTP、3.5U扩增高保真TM聚合酶和有Mg的1X ExpandTM缓冲液。所用热循环仪程序包括96℃ 5分钟的热启动，接着是29个下列步骤的重复94℃ 30秒，40-60℃ 1分钟、45秒(梯度热循环仪)和72℃ 2分钟、15秒。29个重复后，样品在72℃保持10分钟，随后4℃贮存。
对于各类球红细菌msa基因，42℃和48℃退火温度产生多种产物，但有约1464bp的明显带。对于嗜淀粉乳杆菌araT，42℃、48℃和56℃退火温度产生单一产物，在1173bp有强带。对于枯草芽孢杆菌araT，40℃、45℃、50℃和55℃退火温度产生单一强产物(1173bp)，来自基因组DNA和菌落。对于硕大利什曼原虫bsat，55℃退火温度产生最清楚的产物(1239bp)。对于红细菌tatA基因，50-55℃退火温度产生正确大小的清楚产物(1260bp)。对于大肠杆菌基因和枯草芽孢杆菌dat基因，使用55-60℃的退火温度，退火时间缩短至45秒。获得正确大小的清楚产物(对于大肠杆菌基因约为1.3kb，dat基因为850bp)。
克隆用Qiagen凝胶提取试剂盒(Valencia，CA)从0.8或1％TAE-琼脂糖凝胶中凝胶纯化PCR产物。定量PCR产物，通过与琼脂糖凝胶上的标准比较，随后用T4 DNA聚合酶处理，遵循厂商推荐的连接独立克隆方案(Novagen，Madison，WI)。
简要地，在dGTP存在时，约0.2pmol纯化的PCR产物用1U T4 DNA聚合酶22℃处理30分钟。聚合酶从PCR产物的3’末端去除连续碱基。当聚合酶遇到鸟嘌呤残基时，酶的5’到3’聚合酶活性抵消核酸外切酶活性以有效防止更多切除。这产生与pET30 Xa/LIC载体相容的单链突出端。通过在75℃孵育20分钟使聚合酶失活。
如Novagen的建议退火载体和处理插入物。约0.02pmol处理的插入物和0.01pmol载体在22℃孵育5分钟，加入6.25mM EDTA(终浓度)，重复22℃孵育。退火反应(1μL)加入NovaBlueTM单感受态细胞(Novagen，Madison，WI)，冰上孵育5分钟。混合后，42℃热激30秒转化细胞。细胞置于冰上2分钟，在250μL室温SOC中37℃恢复30分钟，以225rpm振荡。细胞平板培养于含卡那霉素(25-50μg/mL)的LB平板。
质粒DNA用Qiagen spin miniprep试剂盒纯化，通过XhoI和XbaI限制性消化筛选正确插入物。似乎有正确插入物的质粒序列通过双脱氧链终止DNA测序确认。
SEQ ID NOS1-14和31-32显示重组转氨酶的核苷酸和对应氨基酸序列，来自Genbank序列的任何变化在蛋白序列中是沉默或产生保守取代。SEQ ID NOS11和12是新序列。
基因表达和测定通过序列分析确认的质粒DNA亚克隆入大肠杆菌表达宿主BLR(DE3)或BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)。培养物生长且质粒用Qiagen miniprep试剂盒分离，用限制酶切消化分析以证实同一性。
诱导开始用嗜淀粉乳杆菌araT、枯草芽孢杆菌araT和苜蓿根病菌tatA在BLR(DE3)或BL21(DE3)细胞中进行。时程研究用培养物进行，培养物在含卡那霉素(30mg/L)的LB中生长到OD600为0.5-0.8，用1mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导且在诱导后0、1、2和4小时取样。来自2.0mL的细胞重悬浮于0.10mL 120mMTris-HCl，pH6.8，其中含10％十二烷基硫酸钠、10％2-巯基乙醇和20％甘油，95℃加热10分钟，冷却，用0.1mL H2O稀释。这些总细胞蛋白样品的等分部分用4-15％梯度凝胶通过SDS-PAGE分析。2小时和4小时间诱导的表达蛋白量间没有显著差异，BLR(DE3)和BL21(DE3)细胞间也没有。
也从4小时样品中制备细胞提取物，这是通过将来自2mL培养物的细胞沉淀悬浮于0.25mL Novagen BugBusterTM试剂，试剂含0.25μL benzonase核酸酶，室温温和振荡孵育20分钟，16,000xg离心以去除细胞碎片。上清(细胞提取物)上样于4-15％梯度凝胶以分析细胞可溶蛋白。
3个克隆(嗜淀粉乳杆菌araT(SEQ ID NOS11和12)、枯草芽孢杆菌araT(SEQID NOS9和10)和苜蓿根病菌tatA(SEQ ID NOS1和2)显示对应于正确大小(约45kDa)的可溶蛋白。枯草芽孢杆菌araT基因产物以最高水平超量表达和/或经另2种基因产物更溶解。
在随后的表达方法中，来自阳性克隆的质粒DNA亚克隆入BL21(DE3)，因为此宿主的生长特征更佳。用1mM IPTG重复诱导，培养物在含50mg/L卡那霉素的LB中生长，当OD600达到约0.8时诱导。37℃生长4小时后收集细胞，3000rpm离心10分钟(4℃)，用TEGGP缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.0)、0.5mM EDTA、100mg/L谷胱甘肽、5％甘油，具有Roche完整蛋白酶抑制剂混合物)洗涤，在-80℃乙醇中急骤冷冻。
样品重悬浮于5mL/g湿细胞重的BugBusterTM(Novagen)试剂，试剂含5μL/mL蛋白酶抑制剂混合物#3批(Calbiochem-Novabiochem Corp.，San Diego，CA)和1μL/mL benzonase核酸酶。样品在定轨摇床上室温孵育20分钟。16,000Xg 4℃离心20分钟去除不溶的细胞碎片。
细胞提取物通过SDS-PAGE分析，通过追踪吲哚-丙酮酸生成来测定色氨酸转氨酶活性，使用下列操作。1mL反应在50mM四硼酸钠(pH8.5)、0.5mM EDTA、0.5mM砷酸钠、50μM吡哆醛磷酸、5mM α-酮戊二酸和5mM L-色氨酸中完成。加入无细胞提取物或纯化酶来起始反应且30℃孵育30分钟。加入20％TCA(200μL)以终止反应，沉淀的蛋白通过离心取出。测量327nm的吸光度并与测定缓冲液中新颖制备的吲哚-3-丙酮酸的标准曲线比较。也进行对照反应，反应无底物色氨酸或用来自克隆的无细胞提取物，仅用pET30a转化克隆。
由于细胞提取物中来自天然大肠杆菌转氨酶的背景，重组蛋白用His-结合柱体遵循厂商方案(Novagen，Madison，WI)纯化。洗脱部分在PD-10(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)柱上脱盐并在50mM Tris，pH7.0中洗脱。纯化的蛋白通过SDS-PAGE分析并测定转氨酶活性。
来自1mM IPTG 37℃诱导(4小时)的结果证明硕大利什曼原虫bsat、苜蓿根病菌tatA、大肠杆菌aspC和2种类球红细菌tatA克隆有显著水平的色氨酸转氨酶活性。来自枯草芽孢杆菌的araT蛋白超量表达且可溶，但显示小的酶活性。嗜淀粉乳杆菌araT基因产物似乎在细胞提取物中可溶，但用His-结合柱体纯化仅产生少量有正确分子量的蛋白。msa基因产物不溶，进一步的表达实验在24℃进行以将包含体形成减至最低程度。一些10μM和1mM间的IPTG浓度用于使可溶蛋白的量达到最大限度。
表1列出每毫克蛋白每分钟形成的吲哚-3-丙酮酸(I3P)的特异活性，活性以微克测量。在一些情况中，很少量的重组蛋白显示大于测定的有效线性范围的高活性水平。在这些情况中，’＞’在比活数前。
表1细胞提取物(CE)中的克隆和纯化(P)及商业酶的特异活
比较所有克隆的重组蛋白的排列阐明araT、tatA、bsat和msa序列间没有许多高度保守的区域。排列活性最高的重组蛋白红细菌tatA基因产物同系物、硕大利什曼原虫广底物转氨酶和苜蓿根瘤菌酪氨酸转氨酶显示出一些保守区，尽管它们在蛋白水平仅约30-43％相同。D-特异(D-丙氨酸)转氨酶的有效性范围广，可用于生成monatin的其它立体异构体。
吲哚-3-乳酸转变成吲哚-3-丙酮酸如图1和3所示，吲哚-3-乳酸能用于生成吲哚-3-丙酮酸。乳酸和丙酮酸间的转变是可逆反应，正如吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乳酸间的转变也是可逆反应。由于在340nm来自吲哚-3-丙酮酸的高背景量，通常可跟踪吲哚-乳酸的氧化。
0.1mL标准测定混合物包含100mM磷酸钾，pH8.0、0.3mM NAD+、7单位乳酸脱氢酶(LDH)(Sigma-L2395，St.Louis，MO)和2mM底物。测定在UV-透明微量滴定板中进行2次，使用Molecular Devices SpectraMax Plus板阅读器。混合多肽和缓冲液并移吸到含吲哚-3-乳酸和NAD+的孔中，短暂混合后，各孔在340nm的吸光度以9秒间隔阅读。反应在25℃保持5分钟。从NAD+生成NADH后，340nm的吸光度增加。进行单独的负对照，没有NAD+且没有底物。来自肠膜明串珠菌(L.Mesenteroides)的D-LDH(Sigma目录号L2395)似乎与吲哚衍生物底物的活性大于来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Baccilus stearothermophilus)的L-LDH(Sigma目录号L5275)。
类似方法使用D-乳酸和NAD+或NADH和丙酮酸、D-LDH多肽的天然底物。丙酮酸还原的Vmax比乳酸氧化的Vmax高100-1000倍。吲哚-3-乳酸与D-LDH氧化反应的Vmax约为乳酸的五分之一。也通过跟踪在327的吸光度变化(烯醇-硼酸盐衍生物)测量吲哚-3-丙酮酸的存在，使用含0.5mM EDTA和0.5mM砷酸钠的50mM硼酸钠缓冲液。与用于L和D-LDH多肽的负对照相比，观察到小但可重复的吸光度变化。
此外，可克隆广特异性乳酸脱氢酶(酶活性与EC 1.1.1.27、EC 1.1.1.28和/或EC 1.1.2.3相关)并用于从吲哚-3-乳酸产生吲哚-3-丙酮酸。广特异性脱氢酶的来源包括大肠杆菌、淋病奈瑟氏球菌和植物乳杆菌(L.plantarum)。
另外，生成吲哚-3-丙酮酸可通过吲哚-3-乳酸接触来自生孢梭菌(C.sporogenes)的细胞提取物，提取物包含吲哚乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.110)；或接触克氏锥虫(Trypanosoma cruzi epimastigotes)细胞提取物，提取物包含已知对吲哚-3-丙酮酸有活性的p-羟苯基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)；或接触嗜酸假单胞菌(P.Acidovorans)或大肠杆菌细胞提取物，提取物包含咪唑-5-基乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.111)；或接触锦紫苏(Coleus blumei)，它包含羟苯基丙酮酸还原酶(EC 1.1.1.237)；或接触麦芽念珠菌，它包含D-芳族乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.222)。描述这种活性的参考文献包括Nowicki等(FEBS Microbiol Letters，92)、Jean和DeMoss(Canadian J.Microbiol.14 1968、Coote和Hassall(Biochem.J.，1969)、Cortese等(C.R.Seances Soc.Biol.Fil.162 390-5，1968)、Petersen和Alfermann(Z.Naturforsch.CBiosci.43 501-4，1988)和Bhatnagar等(J.Gen Microbiol ，1989)。此外，乳酸氧化酶如来自假单胞菌属(Pseudomonas)的酶(Gu等J.Mol.CatalysisBEnzymatic，2002)可用于使吲哚-3-乳酸氧化成吲哚-3-丙酮酸。
实施例3用L-氨基酸氧化酶使L-色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸此例子描述的方法用于经氧化酶(EC 1.4.3.2)使L-色氨酸转变成吲哚-3-丙酮酸，作为实施例1所述使用色氨酸转氨酶之外的另一种选择。L-氨基酸氧化酶纯化自响尾蛇(Crotalus durissus)(Sigma，St.Louis，MO，目录号A-2805)。用于分子克隆的L-氨基酸登录号包括CAD21325.1、AAL14831、NP 490275、BAB78253、A38314、CAB71136、JE0266、T08202、S48644、CAC00499、P56742、P81383、O93364、P81382、P81375、S62692、P23623、AAD45200、AAC32267、CAA88452、AP003600和Z48565。
反应在微离心管中进行，总体积1mL，37℃振荡孵育10分钟。反应混合物包含5mM L-色氨酸、100mM磷酸钠缓冲液pH6.6、0.5mM砷酸钠、0.5mM EDTA、25mM四硼酸钠、0.016mg过氧化氢酶(83U，Sigma C-3515)、0.008mg FAD(Sigma)和0.005-0.125单位的L-氨基酸氧化酶。负对照包含所有成分，除了色氨酸，空白包含所有成分，除了氧化酶。过氧化氢酶用于去除在氧化脱氨中形成的过氧化氢。四硼酸钠和砷酸钠用于稳定吲哚-3-丙酮酸的烯醇-硼酸盐形式，它在327nm显示最大吸光度。在反应混合物中制备0.1-1mM浓度的吲哚-3-丙酮酸标准。
购得的L-氨基酸氧化酶具有每分钟每毫克蛋白形成的比活540μg吲哚-3-丙酮酸。这与色氨酸转氨酶的比活是相同的数量级。
实施例4用醛缩酶使吲哚-3-丙酮酸转变成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸此例子描述的方法可用于将吲哚-3-丙酮酸转变成2-羟基2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸monatin前体(MP)，使用醛缩酶(裂合酶)(图2)。醛醇缩合是形成碳-碳键的反应，键在一种醛的β-碳与另一种醛或酮的羰基碳间。在一个底物的羰基相邻碳上形成碳负离子，并用作亲核体攻击第2个底物的羰基碳(亲电碳)。最通常地，亲电底物是醛，因此大部分醛缩酶属于EC 4.1.2.-类别。亲核底物通常是丙酮酸。醛缩酶不常催化2个酮酸或2个醛间的缩合。
然而，鉴定了催化2个羧酸缩合的醛缩酶。例如，EP 描述从乙醛酸和丙酮酸生成L-4-羟基-2-酮戊二酸，使用假单胞菌培养物(EC 4.1.3.16)。此外，4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸醛缩酶(4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶，EC4.1.3.17)能催化2个酮酸的缩合。因此，类似的醛缩酶多肽用于催化吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸的缩合。
克隆4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸丙酮酸裂合酶(ProA醛缩酶，EC 4.1.3.17)和4-羟基-2-氧戊二酸乙醛酸裂合酶(KHG醛缩酶，EC 4.1.3.16)催化反应很类似图2的醛缩酶反应。设计引物的突出端与pET3o Xa/LIC载体(Novagen，Madison，WI)相容。这些引物的设计描述于上面的实施例1。
设计下列引物用于pET30 Xa/LIC克隆1.稻草假单胞菌(Pseudomonas straminea)proA基因(Genbank登录号版本)和g睾丸酮丛毛单胞菌(睾丸酮丛毛单胞菌)proA基因(SEQ ID NOS65-66，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTACGAACTGGGAGTTGT-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTAGTCAATATATTTCAGGC-3’(SEQ ID NOS55和56)。
2.苜蓿根瘤菌1021 SMc00502基因(与proA同源，Genbank登录号和CAC46344，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCGTGGTTCACCGGAA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAATCGATATATTTCAGTC-3’(SEQ ID NOS61和62)。
3.鞘氨醇单孢菌属LB126 fldZ基因(Genbank登录号7573247版本7573247，编码推定的酰基转移酶)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGTCCGGCATCGTTGTCCA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGACATATTTCAGTCCCA-3’(SEQ ID NOS57和58)。
4.凯氏节杆菌(Arthorbacter keyseri)pcmE基因(Genbank登录号AF331043版本AF，编码草酰柠苹酸醛缩酶)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGACTGAACAACCTCGG-3’和反向5’-
AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGTTCTCCACGTATTCCA-3’(SEQ ID NOS59和60)。
5.鼠疫耶尔森氏菌菌株CO92 YPO0082基因(Genbank登录号版本，编码可能的转移酶)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAGCCTGGTTAATATGAA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTATGACTTTAACGCGTTGA-3’(SEQ ID NOS63和64)。
6.枯草芽孢杆菌khg基因(Genbank登录号Z99115.1 GI和CAB 14127.1，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGGAGTCCAAAGTCGTTGA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACACTTGGAAAACAGCCT-3’(SEQ IDNOS35和36)。
7.大肠杆菌khg基因(Genbank登录号AE-1972和AAC74920.1，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGAAAAACTGGAAAACAAG-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTTACAGCTTAGCGCCTTCTA-3’(SEQ ID NOS37和38)。
8.苜蓿根病菌khg基因(Genbank登录号ALGI353-64673和CAC47463.1，分别为核酸序列和氨基酸序列)正向5’-GGTATTGAGGGTCGCATGCGAGGGGCATTATTCAA-3’和反向5’-AGAGGAGAGTTAGAGCCTCAGCCCTTGAGCGCGAAG-3’(SEQ ID NOS39和40)。
来自上面1-2和6-8所述生物体的基因组DNA用Qiagen genomic tip操作纯化。使用类似技术，能从3-5所述生物体纯化基因组DNA。
稻草假单胞菌(ATCC 33636)在营养肉汤和羟基苯甲酸盐培养基中30℃生长。睾丸酮丛毛单胞菌(ATCC 49249)在营养肉汤和羟基苯甲酸盐培养基中26℃生长。鞘氨醇单孢菌属LB126(Flemish Institute for Technological Research，VITO，B-2400Mol，Belgium)根据Wattiau等(Research in Microbiol.，2001)所述方法生长。凯氏节杆菌(海湾生态部门，国立日生和环境作用研究实验室，美国环境保护署，海湾Breeze，FL 32561，USA)根据Eaton(J.Bacteriol.3，2001)所述方法生长。苜蓿根瘤菌1021(ATCC 51124)在ATCCTY培养基和羟基苯甲酸盐培养基中26℃生长。鼠疫耶尔森氏菌菌株CO92(ATCC)在ATCC培养基739马血琼脂中26℃生长。枯草芽孢杆菌6051(ATCC)在Bereto营养肉汤(Difco；Detroit，MI)中30℃生长。大肠杆菌基因组DNA从菌株DH10B(Invitrogen)中分离，如实施例1所述。
实施例1所述PCR、克隆和筛选操作用于克隆睾丸酮丛毛单胞菌和苜蓿根病菌proA序列以及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和苜蓿根病菌khg序列。相同方法用于克隆上述其它序列。
阳性克隆用双脱氧链终止测序法(Seqwright，Houston，TX)测序，用S-标记和T7终止引物(Novagen)和来自Integrated DNA Technologies，Inc.(Coralville，IA)的内部引物。
表达和活性测定质粒DNA(通过序列分析验证)亚克隆入表达宿主BLR(DE3)(Novagen)。培养物在含50mg/L卡那霉素的LB中生长，质粒用Qiagen spin plasmid miniprep试剂盒分离，随后通过限制酶切消化分析以确定特性。用BL21(DE3)构建物进行诱导实验，构建物在含50mg/L卡那霉素的LB中37℃生长。OD600达到约0.6后，用0.1mMIPTG诱导蛋白表达。细胞在30℃生长4小时并离心收集。随后用BugBusterTM试剂(Novagen)裂解细胞且His-标记重组蛋白用上述His-结合柱体纯化(实施例1)纯化的蛋白在PD-10一次性柱上脱盐并在50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.3中洗脱，缓冲液有2mM MgCl2。
蛋白在4-15％梯度凝胶上通过SDS-PAGE分析以检测在预测重组融合蛋白分子量的可溶性蛋白水平。
使用吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸钠作为底物测定蛋白活性。1mL测定混合物中包含100mM Tris-HCl(pH7-pH8.9)、0-8mM MgCl2、3mM磷酸钾(pH8)和6mM各底物。通过加入不同量的多肽(例如从10到100μg)来起始反应，25℃-37℃孵育30分钟，过滤，然后-80℃冷冻。
proA基因产物的活性结果当用IPTG诱导时，睾丸酮丛毛单胞菌proA和苜蓿根病菌SMc00502基因构建物有高水平表达。重组蛋白是高度可溶的，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品所确定。睾丸酮丛毛单胞菌因产物纯化至＞95％纯度。由于用His-结合柱体亲和纯化后苜蓿根病菌基因产物的产量很低，细胞提取物用于酶测定。
2种重组醛缩酶都催化从吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸形成MP。酶活性需要二价镁和磷酸钾的存在。当缺乏吲哚-3-丙酮酸、丙酮酸或磷酸钾时，没有明显产物。缺乏酶时也形成少量产物(与酶存在时通常不到1个量数量级)。
从反相C18柱洗脱的产物峰稍迟于吲哚-3-丙酮酸标准，此峰的质谱显示292.1的碰撞诱导亲本离子([M+H]+)，亲本离子预期产物MP。质谱中存在的主要子片段包括具有m/z＝158(1H-吲哚-3-碳醛正碳离子)、168(3-丁-1，3-二烯基-1H-吲哚-正碳离子)、274(292-H2O)、256(292-2H2O)、238(292-3H2O)、228(292-CH4O3)和204(失去丙酮酸)的子片段。产物也表现出其它含吲哚的化合物的UV光谱特征，如色氨酸，λmax为279-280且有约290nm的小肩部。
随着反应温度从室温增加到37℃、底物量和镁量增加，睾丸酮丛毛单胞菌醛缩酶法生成的MP量提高。酶的合成活性随着pH增加而减少，在pH7观察到最多产物。在色氨酸标准基础上，用20μg纯化的蛋白在标准测定下生成的MP量约为10-40μg酶1mL反应。
由于苜蓿根病菌和睾丸酮丛毛单胞菌ProA醛缩酶编码序列与上述其它基因的高度同源性，预期所有重组基因产物能催化此反应。此外，预期有类似活性的醛缩酶在59位和87位有苏氨酸(T)，在119位有精氨酸(R)，在120位有天冬氨酸(D)，在31位和71位有组氨酸(H)的醛缩酶(以睾丸酮丛毛单胞菌的编号系统为基础)。
khg基因产物的活性结果当用IPTG诱导时，枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因构建物有高水平表达，而苜蓿根病菌khg的表达水平较低。重组蛋白高度可溶的，如通过SDS-PAGE分析总蛋白和细胞提取物样品判断。枯草芽孢杆菌和大肠杆菌khg基因产物纯化到＞95％纯度；用His-结合柱体亲和纯化后，苜蓿根病菌基因产物的产量不高。
没有迹象证明此酶活性需要镁和磷酸盐。然而，文献报导在磷酸钠缓冲液中进行测定，报导的酶是双功能并对磷酸化底物如2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸(KDPG)有活性。酶测定如上所述进行，在一些情况中省略磷酸盐。结果表明重组KHG醛缩酶法产生MP，但活性不如ProA醛缩酶。在一些情况中，KHG产生的MP水平几乎与镁和磷酸盐单独产生的量相同。磷酸盐似乎不增加KHG活性。杆菌酶活性最高，比单独镁和磷酸盐的活性约高20-25％，如SRM所确定(见实施例10)。根瘤菌酶活性量最低，这可能与表达中注意到的折叠和溶解度问题相关。所有3种酶有活性位点谷氨酸(枯草芽孢杆菌编号系统中的43位)以及与丙酮酸形成Shiff碱基所需的赖氨酸(130位)；然而，枯草芽孢杆菌酶在47位包含活性位点残基苏氨酸，而不是精氨酸。枯草芽孢杆菌KHG较小且似乎在簇中不同于苜蓿根病菌和大肠杆菌酶，其它酶有活性位点苏氨酸。活性位点的差异可能是枯草芽孢杆菌酶活性增加的原因。
改进醛缩酶活性催化抗体可与天然醛缩酶一样有效，接受广范围的底物，并能用于催化图2所示反应。
也能通过定向进化改进醛缩酶，例如上述用于KDPG醛缩酶的例子(与上述KHG高度同源)，KDPG醛缩酶通过DNA改组和易错PCR来发展以去除对磷酸盐的需求和反转对映选择性。KDPG醛缩酶多肽用于生化反应，因为它们高度特异于供体底物(本文是丙酮酸)，但对于受体底物(即吲哚-3-丙酮酸)相对灵活(Koeller和Wong，Nature .2001)。KHG醛缩酶有缩合丙酮酸与一些羧酸的活性。认为KHG醛缩酶的哺乳动物形式的特异性比细菌形式更广，包括对4-羟基-4-甲基-2-氧戊二酸活性较高和接受4-羟基-2-酮戊二酸的2种立体异构体。细菌来源似乎对R异构体有10倍的优先性。基因组数据库中存在将近100个KHG同系物，在假单胞菌、副球菌、普罗威登斯菌、根瘤菌、摩根氏菌、大肠杆菌和哺乳动物组织中证明活性。这些酶能用作修改对映特异性的起始点，monatin生成需要对映特异性。
利用丙酮酸和另一底物的醛缩酶能“进化”以修改多肽特异性、速度和选择性，另一底物是酮酸和/或有大的疏水基团像吲哚。除了本文证明的KHG和ProA醛缩酶之外，这些酶的例子包括但不限于KDPG醛缩酶和相关多肽(KDPH)；来自类诺卡氏菌属(Nocardioides sp)的转羧基苯丙酮酸水