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分析化学（ppt课件）：第七章 第1节 色谱法概述
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第七章色谱分析法第一节色谱法概述一,色谱法的特点、分类和作用二、气相色谱分离过程第一节 色谱法概述一,色谱法的特点、分类和作用1.概述2.分类3.特点二、气相色谱分离过程1.气相色谱分离过程2.分配系数 K一,色谱法的特点、分类和作用1.概述俄国植物学家茨维特在 1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。? 色谱法是一种分离技术,? 试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。? 其中的一相固定不动，称为 固定相 ；? 另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为 流动相 。色谱法当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。? 两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础2.色谱法分类气相色谱, 流动相为气体 （ 称为载气 ） 。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱液相色谱液相色谱, 流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。离子色谱, 液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同 pH值的水溶液为流动相。其他色谱方法薄层色谱和纸色谱：比较简单的色谱方法凝胶色谱法,超临界色谱,高效毛细管电泳,九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。3.气相色谱法的特点（ 1） 分离效率高,复杂混合物, 有机同系物, 异构体 。 手性异构体 。（ 2） 灵敏度高：可以检测出 μ g.g-1(10-6)级甚至 ng.g-1(10-9)级的物质量,（ 3） 分析速度快：一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析 。（ 4） 应用范围广：适用于沸点低于 400℃ 的各种有机或无机试样的分析 。不足之处：不适用于高沸点, 难挥发, 热不稳定物质的分析 。被分离组分的定性较为困难 。二、气相色谱分离过程气相色谱分离过程是在色谱柱内完成的 。填充柱色谱, 气固色谱和气液色谱, 两者的分离机理不同 。气固色谱的固定相, 多孔性的固体吸附剂颗粒 。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同 。气液色谱的固定相, 由 担体和固定液所组成 。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同 。气固色谱的分离机理,吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：气液两相间的反复多次分配过程。气相色谱分离过程?当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时, 被固定相溶解或吸附 。?随着载气的不断通入, 被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附,?挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附 。?随着载气的流动, 溶解, 挥发, 或吸附, 脱附的过程反复地进行 。分配系数 K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位,g / mL） 比，称为分配系数，用 K 表示，即：组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度?K分配系数 K的讨论?一定温度下，组分的分配系数 K越大，出峰越慢；?试样一定时,K主要取决于固定相性质；?每个组份在各种固定相上的分配系数 K不同；?选择适宜的固定相可改善分离效果；?试样中的各组分具有不同的 K值是分离的基础；?某组分的 K = 0时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度?K第 七 章色谱分析法一、气相色谱仪及其流程二,气相色谱固定相三、气相色谱检测装置1．检测器特性2．热导检测器3．氢火焰离子化检测器4,电子捕获检测器5,具有定性功能的检测器（联用技术）第二节气相色谱装置气相色谱仪 1气相色谱仪 2气相色谱仪 3一、气相色谱流程1-载气钢瓶； 2-减压阀；3-净化干燥管； 4-针形阀；5-流量计 ;6-压力表； 4-针形阀； 5-流量计 ;6-压力表；9-热导检测器； 10-放大器；11-温度控制器； 12-记录仪；1,载气系统,包括气源、净化干燥管和载气流速控制 ;2,进样系统,进样器及气化室；3,色谱柱,填充柱（填充固定相）或毛细管柱（内壁涂有固定液）；4,检测器,可连接各种检测器，以热导检测器或氢火焰检测器最为常见；5,记录系统,放大器、记录仪或数据处理仪；6,温度控制系统,柱室、气化室的温度控制。二,气相色谱固定相1,气固色谱固定相种类：活性炭,有较大的比表面积, 吸附性较强 。活性氧化铝,有较大的极性 。 适用于常温下 O2,N2,CO,CH4,C2H6,C2H4等气体的相互分离 。 CO2能被活性氧化铝强烈吸附而不能用这种固定相进行分析 。硅胶,与活性氧化铝大致相同的分离性能, 除能分析上述物质外, 还能分析 CO2,N2O,NO,NO2等, 且能够分离臭氧 。气固色谱固定相分子筛,碱及碱土金属的硅铝酸盐 （ 沸石 ）, 多孔性 。 如 3A,4A,5A,10X及 13X分子筛等 （ 孔径：埃 ） 。 常用 5A和 13X（ 常温下分离 O2与 N2） 。 除了广泛用于 H2,O2,N2,CH4,CO等的分离外, 还能够测定 He,Ne,Ar,NO,N2O等 。高分子多孔微球 （ GDX系列 ）,新型的有机合成固定相 （ 苯乙烯与二乙烯苯共聚 ） 。型号,GDX-01,-02,-03等 。 适用于水, 气体及低级醇的分析 。气固色谱固定相的特点（ 1） 性能与制备和活化条件有很大关系；（ 2） 同一种固定相, 不同厂家或不同活化条件,分离效果差异较大；（ 3） 种类有限, 能分离的对象不多；（ 4） 使用方便 。2,气液色谱固定相气液色谱固定相 [固定液 + 担体 （ 支持体 ） ],? 固定液在常温下不一定为液体, 但在使用温度下一定呈液体状态 。? 固定液的种类繁多, 选择余地大, 应用范围不断扩大 。担体：化学惰性的多孔性固体颗粒, 具有较大的比表面积 。可以作为担体使用的物质应满足以下条件：? 比表面积大, 孔径分布均匀；? 化学惰性, 表面无吸附性或吸附性很弱, 与被分离组份不起反应；? 具有较高的热稳定性和机械强度, 不易破碎；? 颗粒大小均匀, 适度 。 一般常用 60~80目, 80~100目 。担体（硅藻土）红色担体,孔径较小，表孔密集，比表面积较大，机械强度好。适宜分离非极性或弱极性组分的试样。缺点是表面存有活性吸附中心点。白色担体,煅烧前原料中加入了少量助溶剂 (碳酸钠 )。颗 粒疏松，孔径较大。表面积较小，机械强度 较差。但吸附性显著减小，适宜分离极性组分的试样。表 5-1填充柱气液色谱担体一览表种类担体名称 特点及用途 生产厂家红色硅藻土担体201 红色担体301 釉化红色担体6201 红色担体适用于涂渍非极性固定液分析非极性物质由 201 釉化而成，性能介于红色与白色硅藻土担体之间，适用于分析中等极性物质上海试剂厂大连催化剂厂硅藻土类白色硅藻土担体101 白色担体101 酸洗101 硅烷化白色担体102 白色担体适用于涂渍极性固定液分析极性物质催化吸附性小，减小色谱峰拖尾上海试剂厂非硅藻土类高分子微球玻璃微球氟担体由苯乙烯和二乙烯苯共聚而成经酸碱处理，比表面积 0,02 m2/ g,可在较高温度下使用，适宜分析高沸点物质。由四氟乙烯聚合而成，比表面积 10,5 m2/g适宜分析强极性物质和腐蚀性物质上海试剂厂固定液固定液：高沸点难挥发有机化合物，种类繁多。(1)对 固定液的 要求应对被分离试样中的各组分具有不同的溶解能力，较好的热稳定性，并且不与被分离组分发生不可逆的化学反应。(2)选择的基本原则,相似相溶,，选择与试样性质相近的固定相。(3)固定液分类方法如按化学结构、极性、应用等的分类方法。在各种色谱手册中，一般将固定液按有机化合物的分类方法分为：脂肪烃、芳烃、醇、酯、聚酯、胺、聚硅氧烷等，(4) 最高最低使用温度。高于最高使用温度易分解，温度低呈固体；(5) 混合固定相：对于复杂的难分离组分通常采用特殊固定液或将两种甚至两种以上配合使用；(6) 固定液的相对极性：规定：角鲨烷（异三十烷）的相对极性为零,β,β’― 氧二丙睛的相对极性为 100，固定液名 称商品牌号 使用温度（最高）℃溶剂 相对极性麦氏常数总和分析对象（参考）1, 角鲨烷（异三十烷）SQ 150 乙醚 0 0 烃类及非极性化合物2,阿皮松 L A P L 300 苯 ― 143 非极性和弱极性各类高沸点有机化合物3,硅油 O V - 101 350 丙酮 +1 229 各类高沸点弱极性有机化合物，如芳烃4, 苯基 10%甲基聚硅氧烷O V - 3 350 甲苯 +1 4235, 苯基 （ 20% ）甲基聚硅氧烷O V - 7 350 甲苯 +2 5926, 苯基 （ 50% ）甲基 聚硅氧烷O V - 17 300 甲苯 +2 8277, 苯基 （ 60% ）甲基聚硅氧烷O V - 22 350 甲苯 +2 10758, 邻苯二甲酸二壬酯DNP 130 乙醚 +29, 三氟丙基甲基聚硅氧烷O V - 210 250 氯仿 +2 150010, 氰丙基 （ 25% ）苯基 （ 25% ）甲基聚硅氧烷O V - 225 250 +3 181311,聚乙二醇 P E G 20M 250 乙醇 氢键 2308 醇、醛酮、脂肪酸、酯等极性化合物12, 丁二酸二乙二醇聚酯D E G S 225 氯仿 氢键 3430表 8-2 优选固定液麦氏常数,x’,y’、z’,u’,s’表示, 分别代表了极性分子间存在着的静电力 （ 偶极定向力 ） ；极性与非极性分子间存在着的诱导力；非极性分子间的色散力；氢键等。 也可以用五个数的总和来表示固定相的极性大小, 如,β，β’― 氧二丙睛五个常数的总和为 4427,是强极性固定相 。三、气相色谱检测装置色谱仪的关键部件之一, 种类较多, 原理和结构各异 。有的具有广普性, 如热导检测器；有的具有高选择性, 仅对某类物质有高响应 。1,检测器特性浓度型检测器：测量的是载气中通过检测器组分浓度瞬间的变化, 检测信号值与组分的浓度成正比 。质量型检测器：测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化, 即检测信号值与单位时间内进入检测器组分的质量成正比 。检测器性能评价指标响应值（或灵敏度） S,在一定范围内, 信号 E与进入检测器的物质质量 m呈线性关系：E = S mS = E / m单位,mＶ /（ mg / cm3） ； （ 浓度型检测器 ）mＶ /（ mg / s） ； （ 质量型检测器 ）S 表示单位质量的物质通过检测器时, 产生的响应信号的大小 。 S值越大, 检测器 （ 也即色谱仪 ） 的灵敏度也就越高 。 检测信号通常显示为色谱峰, 则响应值也可以由色谱峰面积 （ A） 除以试样质量求得：S = A / m最低检测限（最小检测量）,噪声水平决定着能被检测到的浓度（或质量）。从图中可以看出：如果要把信号从本底噪声中识别出来, 则组分的响应值就一定要高于 N。 检测器响应值为 2倍噪声水平时的试样浓度 （ 或质量）, 被定义为最低检测限 （ 或该物质的最小检测量 ） 。线性度与线性范围,检测器的线性度定义为：检测器响应值的对数值与试样量对数值之间呈比例的状况 。 而检测器的线性范围定义为：检测器在线性工作时, 被测物质的最大浓度 （ 或质量 ） 与最低浓度 （ 或质量 ） 之比 。2．热导检测器（ 1） 热导检测器的结构池体, 一般用不锈钢制成。热敏元件, 电阻率高、电阻温度系数大、且价廉易加工的钨丝制成。参考臂,仅允许纯载气通过，通常连接在进样装置之前。测量臂, 需要携带被分离组分的载气流过，则连接在紧靠近分离柱出口处。（ 2）检测原理平衡电桥，右图。不同的气体有不同的热导系数。? 钨丝通电，加热与散热达到平衡后，两臂电阻值：R参 =R测 ; R1=R2 则,R参 ·R2=R测 ·R1无电压信号输出；记录仪走直线（基线）。? 进样后，载气携带试样组分流过测量臂而这时参考臂流过的仍是纯载气，使测量臂的温度改变，引起电阻的变化，测量臂和参考臂的电阻值不等，产生电阻差,R参 ≠R测则,R参 ·R2≠R测 ·R1? 这时电桥失去平衡,a,b两端存在着电位差，有电压信号输出。信号与组分浓度相关。记录仪记录下组分浓度随时间变化的峰状图形。（ 3）影响 热导检测器灵敏度的因素① 桥路电流 I, I?,钨丝的温度 ?, 钨丝与池体之间的温差 ?,有利于热传导, 检测器灵敏度提高 。 检测器的响应值 S∝ I3,但稳定性下降, 基线不稳 。 桥路电流太高时, 还可能造成钨丝烧坏 。② 池体温度, 池体温度与钨丝温度相差越大, 越有利于热传导, 检测器的灵敏度也就越高, 但池体温度不能低于分离柱温度, 以防止试样组分在检测器中冷凝 。表 7-3 某些气体与蒸气的热导系数 (λ),单位,J / cm·℃ ·s③载气种类, 载气与试样的热导系数相差越大，在检测器两臂中产生的温差和电阻差也就越大，检测灵敏度越高。载气的热导系数大，传热好，通过的桥路电流也可适当加大，则检测灵敏度进一步提高。氦气也具有较大的热导系数，但价格较高。3,氢火焰离子化检测器（ 1） 特点（ FID,hydrogen flame ionization detector）a,典型的质量型检测器,b,对有机化合物具有很高的灵敏度,c,无机气体, 水, 四氯化碳等含氢少或不含氢的物质灵敏度低或不响应 。d,氢焰检测器结构简单, 稳定性好, 灵敏度高, 响应迅速等特点 。e,比热导检测器的灵敏度高出近 3个数量级, 检测下限可达10-12g·g-1。(2) 氢焰检测器的结构a,在发射极和收集极之间加有一定的直流电压（ 100― 300V）构成一个外加电场。b,氢焰检测器需要用到三种气体：N2,载气携带试样组分；H2,为燃气；空气：助燃气。使用时需要调整三者的比例关系，检测器灵敏度达到最佳。(3) 氢焰检测器的原理a,当含有机物 CnHm的载气由喷嘴喷出进入火焰时, 在 C层发生裂解反应产生自由基,CnHm ──→ ·CHb,产生的自由基在 D层火焰中与外面扩散进来的激发态原子氧或分子氧发生如下反应：·CH + O ──→CHO+ + ec,生成的正离子 CHO+ 与火焰中大量水分子碰撞而发生分子离子反应：CHO+ + H2O ──→H3O+ + COA区：预热区B层：点燃火焰C层：热裂解区：温度最高D层：反应区氢焰检测器的原理d,化学电离产生的正离子和电子在外加恒定直流电场的作用下分别向两极 定向 运动而产生微电流 （ 约 10-6～ 10-14A） ；e,在一定范围内, 微电流的大小与进入离子室的被测组分质量成正比, 所以 氢焰检测器是质量型检测器；f,组分在氢焰中的电离效率很低，大约五十万分之一的碳原子被电离；g,离子电流信号输出到记录仪，得到峰面积与组分质量成正比的色谱流出曲线。A区：预热区B层：点燃火焰C层：热裂解区：温度最高D层：反应区（ 4）影响氢焰检测器灵敏度的因素① 各种气体流速和配比的选择：N2流速的选择主要考虑分离效能,N2 ? H2 = 1 ? 1～ 1 ? 1.5氢气 ? 空气 =1 ? 10。② 极化电压正常极化电压选择在 100～ 300V范围内 。4.电子捕获检测器? 高选择性检测器，? 仅对含有卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，检测下限 10-14 g /mL，? 对大多数烃类没有响应。? 较多应用于农副产品、食品及环境中农药残留量的测定。5.具有定性功能的检测器（联用技术）色谱 -质谱；色谱 -红外等 。质谱作为色谱的检测器使用需要解决 四个问题,（ 1） 色谱柱出口压力与质谱仪高真空之间的匹配；（ 2） 试样组分与载气的分离；（ 3） 质谱对色谱流出峰的快速测定 （ 电子计算机解决 ） ；（ 4） 质谱仪的小型化 （ 小型化的质量分析器 ） 。质谱作为色谱检测器所存在 问题 的 解决：第一和第二个问题的解决：采用分子分离器；分子分离器类型：微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。喷射式分子分离器：由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室中，如图所示。可做成多级。第 七 章色谱分析法第三节色谱理论基础一, 气相色谱流出曲线二, 容量因子与分配系数三, 塔板理论四, 速率理论五, 分离度一,气相色谱流出曲线1.基线无试样通过检测器时,检测到的信号即为基线 。2.保留值（ 1）时间表示的保留值保留时间（ tR）,组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间死时间（ tM）,不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间。调整保留时间（ tR＇）,tR＇ = tR－ tM（ 2）用体积表示的保留值保留体积 （ VR）, VR = tR× F0（ F0为色谱柱出口处的载气流量，单位,m L / min。）死体积（ VM）,VM = tM × F0调整保留体积（ VR＇）,V R＇ = VR － VM3,相对保留值 r21组分 2与组分 1调整保留值之比：r21 = t’R2 / t’R1= V’R2 / V’ R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关,与其他色谱操作条件无关, 它表示了固定相对这两种组分的选择性 。4,区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数,有三种表示方法：（ 1） 标准偏差 (?)：即 0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半 。（ 2） 半峰宽 (Y1/2)：色谱峰高一半处的宽度 Y1/2 =2.354?（ 3） 峰底宽 (Wb)：Wb=4 ?二、容量因子与分配系数分配系数 K,组分在两相间的浓度比；容量因子 k,平衡时，组分在各相中总的质量比；k =MS / MmMS为组分在固定相中的质量, Mm为组分在流动相中的质量 。容量因子 k与分配系数 K的关系为：式中 β为相比 。填充柱相比,6～ 35；毛细管柱的相比,50～ 1500MRMMRtttttk '????KVVccVVMVVMMMkmSmsmmSSSSmS ?????容量因子越大, 保留时间越长 。可由保留时间计算出容量因子, 两者有以下关系：三、塔板理论 -柱分离效能指标色谱柱长,L，虚拟的塔板间距离,H，色谱柱的理论塔板数,n，则三者的关系为：n = L / H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：222116545 )()(./ bRRWtYtn ??有效塔板数和有效塔板高度? 单位柱长的塔板数越多, 表明柱效越高 。? 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数 。? 组分在 tM时间内不参与柱内分配 。 需引入有效塔板数和有效塔板高度：222116545 )()(./ bRRWtYtn ??有效有效有效nLHWtYtnbRR???2'22/1')(16)(54.5塔板理论的特点和不足：(1)当色谱柱长度一定时, 塔板数 n 越大 (塔板高度 H越小 ),被测组分在柱内被分配的次数越多, 柱效能则越高,所得色谱峰越窄 。(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同, 用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时, 应指明测定物质 。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果, 当两组分的分配系数 K 相同时, 无论该色谱柱的塔板数多大, 都无法分离 。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果, 也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径 。四,速率理论 -影响柱效的因素速率方程 （ 也称范,弟姆特方程式 ）,H = A + B/u + C·uH：理论塔板高度, u：载气的线速度 (cm/s)减小 A,B,C三项可提高柱效；存在着最佳流速；A,B,C三项各与哪些因素有关？1,涡流扩散项－ AA = 2λdpdp,固定相的平均颗粒直径λ,固定相的填充不均匀因子固定相颗粒越小 dp↓,填充的越均匀, A↓,H↓,柱效n↑。 表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻, 色谱峰较窄 。2,分子扩散项 ― BB = 2 νDg? ν, 弯曲因子, 填充柱色谱, ν&1。? Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数 （ cm2·s -1） 。 由于柱中存在着浓度差, 产生纵向扩散：a,扩散导致色谱峰变宽, H↑(n↓),分离变差 。b,分子扩散项与流速有关, 流速 ↓,滞留时间 ↑,扩散 ↑，c,扩散系数,Dg∝ （ M载气 ） -1/2； M载气 ↑,B值 ↓3.传质阻力项 ― C组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力。传质阻力包括气相传质阻力 Cg和液相传质阻力 CL，液相传质阻力大于气相传质阻力。即：C =（ Cg + CL）LfL DdC 2?4,载气流速与柱效 -最佳流速载气流速高时：传质阻力项是影响柱效的主要因素, 随着流速的提高, 柱效下降,右图曲线的右边 。载气流速低时：H - u曲线与最佳流速：由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度 H对应载气流速 u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。分子扩散项成为影响柱效的主要因素, 随着流速的增加,柱效提高, 右图曲线的坐边 。5,速率理论的要点(1) 被分离组分分子在色谱柱内运行的 多路径, 浓度梯度所造成的 分子扩散 及 传质阻力 使气液两相间的 分配平衡不能瞬间达到 等因素是造成 色谱峰扩展, 柱效下降 的主要原因 。(2) 通过选择适当的固定相粒度, 载气种类, 液膜厚度及载气流速可提高柱效 。(3) 速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导 。 阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响 。(4) 各种因素相互制约, 如载气流速增大, 分子扩散项的影响减小, 使柱效提高, 但同时 传质阻力项的影响增大, 又使柱效下降；柱温升高, 有利于传质, 但又加剧了分子扩散的影响, 选择最佳条件, 才能使柱效达到最高 。五,分离度塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度 。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差 ── 色谱过程的热力学因素；区域宽度 ── 色谱过程的 动力学 因素 。色谱分离中的四种情况如图所示：① 柱效较高,△ K (分配系数 )较大,完全分离；② △ K 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，,△ K 较大,但分离的不好；④ △ K 小,柱效低，分离效果更差。分离度的表达式：R =0.8：两峰的分离程度可达 89%；R =1.0：分离程度 98%；R =1.5：达 99.7%（ 相邻两峰完全分离的标准 ） 。)(.)()()(/)(/)()()()()()(1212211212126 99122YYttWWttRRRbbRR??????令 Wb(2)=Wb(1)=Wb（ 相邻两峰的峰底宽近似相等 ）,引入相对保留值和塔板数，可导出下式：161112212121121221211212有效nrrWtttrWtttWttWWttRbbbbbRRRRRRRRRR)()()()('''''''')()()()()()()()()()()()(?????????????有效有效HrrRLrrRn?????221212221212116116)()(例题 1：在一定条件下, 两个组分的调整保留时间分别为 85秒和100秒, 要达到完全分离, 即 R=1.5 。 计算需要多少块有效塔板 。 若填充柱的塔板高度为 0.1 cm,柱长是多少？解,r21= 100 / 85 = 1.18n有效 = 16R2 [r21 / (r21 ― 1) ]2= 16× 1.52 × (1.18 / 0.18 ) 2= 1547（ 块 ）L有效 = n有效 ·H有效= ; 0.1 = 155 cm即柱长为 1.55米时, 两组分可以得到完全分离 。例题 2：在一定条件下, 两个组分的保留时间分别为 12.2s和12.8s,计算分离度 。 要达到完全分离, 即 R=1.5, 所需要的柱长 。解：8 5 3 3.03 6 0 08.12448 1 3 3.03 6 0 02.12442211????????ntWntWRbRb分离度,72.08 1 3 3.08 5 3 3.0)2.128.12(2 ?????RmLRRL 34..1212122 ???????????????????塔板数增加一倍，分离度增加多少？第 七 章色谱分析法一,色谱柱及使用条件的选择二,载气种类和流速的选择三,其它操作条件的选择第四节色谱分离操作条件的选择一,色谱柱及使用条件的选择1,固定相的选择气－液色谱, 应根据, 相似相溶, 的原则① 分离非极性组分时, 通常选用非极性固定相 。 各组分按沸点顺序出峰, 低沸点组分先出峰 。② 分离极性组分时, 一般选用极性固定液 。 各组分按极性大小顺序流出色谱柱, 极性小的先出峰 。③ 分离非极性和极性的 （ 或易被极化的 ） 混合物, 一般选用极性固定液 。 此时, 非极性组分先出峰, 极性的 （ 或易被极化的 ） 组分后出峰 。④ 醇, 胺, 水等强极性和能形成氢键的化合物的分离, 通常选择极性或氢键性的固定液 。⑤ 组成复杂, 较难分离的试样, 通常使用特殊固定液, 或混合固定相 。2,固定液配比（涂渍量）的选择配比,固定液在担体上的涂渍量, 一般指的是固定液与担体的百分比, 配比通常在 5%～ 25%之间 。配比越低, 担体上形成的液膜越薄, 传质阻力越小, 柱效越高, 分析速度也越快 。配比较低时, 固定相的负载量低, 允许的进样量较小 。分析工作中通常倾向于使用较低的配比 。3.柱长和柱内径的选择增加柱长对提高分离度有利 （ 分离度 R正比于柱长 L2）,但组分的保留时间 tR↑, 且柱阻力 ↑,不便操作 。? 柱长的选用原则是在能满足分离目的的前提下, 尽可能选用较短的柱, 有利于缩短分析时间 。? 填充色谱柱的柱长通常为 1~3米, 内径 3~4厘米 。4.柱温的确定? (1) 首先应使柱温控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度（低于此温度固定液以固体形式存在）范围之内。? (2) 柱温升高，分离度下降，色谱峰变窄变高。柱温 ↑,被测组分的挥发度 ↑,即被测组分在气相中的浓度 ↑, K↓,tR↓,低沸点组份峰易产生重叠。? (3) 柱温 ↓,分离度 ↑,分析时间 ↑ 。对于难分离物质对，降低柱温虽然可在一定程度内使分离得到改善，但是不可能使之完全分离，这是由于两组分的相对保留值增大的同时，两组分的峰宽也在增加，当后者的增加速度大于前者时，两峰的交叠更为严重。柱温的确定? (4)柱温一般选择在接近或略低于组分平均沸点时的温度。? (5)组分复杂，沸程宽的试样，采用程序升温。程序升温二,载气种类和流速的选择1,载气种类的选择载气种类的选择应考虑 三个方面,载气对柱效的影响、检测器要求及载气性质。(1)载气摩尔质量大, 可抑制试样的纵向扩散, 提高柱效 。(2)载气流速较大时, 传质阻力项起主要作用, 采用较小摩尔质量的载气 （ 如 H2,He）, 可减小传质阻力, 提高柱效。(3)热导检测器需要使用热导系数较大的氢气有利于提高检测灵敏度 。 在氢焰检测器中, 氮气仍是首选目标 。(4)在载气选择时, 还应综合考虑载气的安全性, 经济性及来源是否广泛等因素 。2,载气流速的选择作图求最佳流速 。实际流速稍大于最佳流速, 缩短时间 。三,其它操作条件的选择1.进样方式和进样量的选择? 液体试样采用色谱微量进样器进样，规格有 1μL，5μL,10μL等。?进样量应控制在柱容量允许范围及检测器线性检测范围之内。进样要求动作快、时间短。?气体试样应采气体进样阀进样。2.气化温度的选择? 色谱仪进样口下端有一气化器，液体试样进样后，在此瞬间气化 ;? 气化温度一般较柱温高 30~70℃? 防止气化温度太高造成试样分解。第 七 章色谱分析法一、色谱定性鉴定方法二、色谱定量分析方法第五节色谱定性、定量分析方法一,色谱定性鉴定方法1.利用纯物质定性的方法利用保留值定性, 通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰, 来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置 。 不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比 。利用加入法定性, 将纯物质加入到试样中, 观察各组分色谱峰的相对变化 。2.利用文献保留值定性相对保留值 r21,相对保留值 r21仅与柱温和固定液性质有关 。 在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据, 可以用来进行定性鉴定 。3.保留指数又称 Kovats指数 （ Ⅰ ）, 是一种重现性较好的定性参数 。测定方法：? 将正构烷烃作为标准, 规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以 100（ 如正己烷的保留指数为 600） 。? 其它物质的保留指数 （ IX） 是通过选定两个相邻的正构烷烃, 其分别具有 Z和 Z＋ 1个碳原子 。 被测物质 X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间如图所示：保留指数计算方法)lglglglg(')(')(')(')(')(')(')(ZttttItttZRZRZRXRXZRXRZR????????111 0 03.与其他分析仪器联用的定性方法小型化的台式色质谱联用仪（ GC-MS； LC-MS）色谱 -红外光谱仪联用仪；组分的结构鉴定SampleSample58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972A M ass Selective DetectorD C BAABCDGas Chromatograph (GC) Mass Spectrometer (MS)Separation IdentificationBA C D二,色谱定量分析方法1,峰面积的测量（ 1） 峰高 （ h） 乘半峰宽 （ Y 1/2） 法,近似将色谱峰当作等腰三角形 。 此法算出的面积是实际峰面积的 0.94倍：A = 1.064 h·Y1/2（ 2） 峰高乘平均峰宽法,当峰形不对称时, 可在峰高 0.15和 0.85处分别测定峰宽, 由下式计算峰面积：A = h·（ Y 0.15 + Y 0.85 ） / 2（ 3） 峰高乘保留时间法,在一定操作条件下, 同系物的半峰宽与保留时间成正比, 对于难于测量半峰宽的窄峰, 重叠峰 （ 未完全重叠 ）, 可用此法测定峰面积：A = h·b·tR（ 4） 自动积分和微机处理法2,定量校正因子?试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比, 即：m i = fi ·Ai?绝对校正因子,比例系数 f i, 单位面积对应的物质量：f i =m i / Ai? 定量校正因子与检测器响应值成倒数关系：f i = 1 / Si? 相对校正因子 f ’i,即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比 。? 当 mi,mS以摩尔为单位时，所得相对校正因子称为相对摩尔校正因子（ f ’M）,用表示；当 mi,mS用质量单位时,以（ f ’W）,表示。ississiisii AAmmAmAmfff ????//'3,常用的几种定量方法（ 1） 归一化法：特点及要求：?归一化法简便、准确；?进样量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大；?仅适用于试样中所有组分全出峰的情况 。100100121???????????niiiiiniiAfAfmmmmc)(%''?（ 2） 外标法外标法也称为标准曲线法。特点及要求：?外标法不使用校正因子，准确性较高,?操作条件变化对结果准确性影响较大。?对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析。（ 3）内标法内标物要满足以下要求：（ 1） 试样中不含有该物质；（ 2） 与被测组分性质比较接近；（ 3） 不与试样发生化学反应；（ 4） 出峰位置应位于被测组分附近, 且无组分峰影响 。试样配制,准确称取一定量的试样 W,加入一定量内标物 mS计算式：SsiisiSsiisiAfAfmmAfAfmm''''; ??% ''''???????SsiisSsiisii AfAfWmWAfAfmWmc内标法特点(1) 内标法的准确性较高, 操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大 。(2) 每个试样的分析, 都要进行两次称量, 不适合大批量试样的快速分析 。(3)若将内标法中的试样取样量和内标物加入量固定,则：常数??Sii AAc %第 七 章色谱分析法一、毛细管色谱的特点二,结构流程及操作条件的优化三,分流比调节第六节毛细管色谱法一、毛细管色谱的特点1,毛细管色谱分离能力提高的途径(1) 由塔板理论：增加柱长减小柱径, 即增加柱子塔板数；(2) 由速率理论：减小组分在柱中的涡流扩散和传质阻力,也即降低塔板高度 。2,毛细管色谱柱的结构特点（ 1） 不装填料阻力小，长度可达百米的毛细管柱，管径0.2mm。（ 2）气流单途径通过柱子，消除了组分在柱中的涡流扩散。（ 3）固定液直接涂在管壁上，总柱内壁面积较大,涂层很薄，则气相和液相传质阻力大大降低。（ 4）毛细管色谱柱柱效高达每米 3000～ 4000块理论塔板，一支长度 100米的毛细管柱，总的理论塔板数可达 104～ 106。3,毛细管色谱具有的优点（ 1）分离效率高：比填充柱高 10～ 100倍；（ 2）分析速度快：用毛细管色谱分析比用填充柱色谱速度（ 3）色谱峰窄、峰形对称。较多采用程序升温方式；（ 4）灵敏度高，一般采用氢焰检测器。（ 5）涡流扩散为零。4,毛细管色谱的 种类与制备方法毛细管柱按其制备方法可分为以下几种：? 涂壁开管柱 （ wall coated open tubular,WCOT柱）：将固定液直接涂敷在管内壁上。柱制作相对简单，但柱制备的重现性差、寿命短。?多孔层开管柱 （ porous layer open tubular,PLOT柱）：在管壁上涂敷一层多孔性吸附剂固体微粒。构成毛细管气固色谱。?载体涂渍开管柱 （ support coated open tubular，SCOT柱）：将非常细的担体微粒粘接在管壁上，再涂固定液。柱效较 WCOT柱高。?化学键合或交联柱,将固定液通过化学反应键合在管壁上或交联在一起。使柱效和柱寿命进一步提高。二,结构流程具有分流和尾吹装置三,分流比调节毛细管柱内径很细，因而带来三个问题：（ 1）允许通过的载气流量很小。（ 2）柱容量很小，允许的进样量小。需采用分流技术，（ 3）分流后，柱后流出的试样组分量少、流速慢。解决方法：灵敏度高的氢焰检测器，采用尾吹技术。分流比：放空的试样量与进入毛细管柱的试样量之比。一般在 50,1到 500,1之间调节。第 七 章色谱分析法一,高效液相色谱法的特点二、流程及主要部件三,影响分离的因素四,高效液相色谱法的主要分离类型第七节高效液相色谱法液相色谱仪（ 1）液相色谱仪（ 2）液相色谱仪（ 3）液相色谱仪（ 4）一,高效液相色谱法的特点特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。二、流程及主要部件1.流程2.主要部件(1) 高压输液泵?主要部件之一, 压力,150～ 350× 105 Pa。?为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相 （ &10μm）, 液体的流动相高速通过时, 将产生很高的压力, 因此高压, 高速是高效液相色谱的特点之一 。?应具有压力平稳, 脉冲小, 流量稳定可调, 耐腐蚀等特性(2) 梯度淋洗装置外梯度,利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度,一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。(3) 进样装置流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：(4) 高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径 1～ 6 mm,柱长 5～ 40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。(5) 高效液相色谱检测器紫外光度检测器（ UV）,最小检测量 10-9g·mL-1,对流量和温度的波动不敏感，可用于梯度洗脱。最常用的检测器。光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器,1024个二极管阵列, 各检测特定波长, 计算机快速处理, 三维立体谱图, 如图所示 。三,影响分离的因素在高效液相色谱中,速率方程中的分子扩散项 B/U较小,可以忽略不计, 而只有两项, 即：H = A + C u故液相色谱 H-u曲线与气相色谱的形状不同, 如图所示：影响分离的主要因素有流动相的流量、性质和极性。1,影响分离的因素 ―― 流速流速大于 0.5 cm/s时,H～ u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。2,固定相及分离柱气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。选择合适的固定相，降低填料粒度可显著提高柱效，但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。选择短柱、细内径提高分析速度；研制高效柱填料是一活跃领域。3,流动相及流动相的极性（ 1） 可显著改变组分分离状况的流动相选择在液相色谱中显得特别重要 。 液相色谱的流动相又称为：淋洗液, 洗脱剂 。（ 2） 亲水性固定液常采用疏水性流动相, 即流动相的极性小于固定相的极性, 称为正相液液色谱法, 极性柱也称正相柱 。（ 3） 若流动相的极性大于固定液的极性, 则称为反相液液色谱, 非极性柱也称为反相柱 。 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反 。流动相组成流动相按组成不同可分为单组分和多组分；按极性可分为极性, 弱极性, 非极性；按使用方式有固定组成淋洗和梯度淋洗 。常用溶剂,己烷, 四氯化碳, 甲苯, 乙酸乙酯, 乙醇, 乙腈, 水 。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性, 以改进分离或调整出峰时间 。选择流动相时应注意的几个问题：（ 1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（ 2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（ 3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（ 4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。四,高效液相色谱法的主要分离类型1,吸附色谱 （ 液 -固吸附色谱 ）以固体吸附剂为固定相, 如硅胶, 氧化铝等, 较常使用的是 5～ 10μm的硅胶吸附剂 。 流动相可以是各种不同极性的一元或多元溶剂 。2,分配色谱 （ 液 -液分配色谱 ）早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定相,现多为化学键合固定相, 即用化学反应的方法通过化学键将固定液结合在担体表面 。3,离子交换色谱固定相为离子交换树脂, 流动相为无机酸或无机碱的水溶液 。 各种离子根据它们与树脂上的交换基团的交换能力的不同而得到分离 。4,凝胶色谱 （ 空间排阻色谱 ）以凝胶为固定相 。 凝胶是一种经过交联的, 具有立体网状结构和不同孔径的多聚体的通称 。 如葡聚糖凝胶,琼脂糖等软质凝胶；多孔硅胶, 聚苯乙烯凝胶等硬质凝胶；第 七 章色谱分析法一、离子色谱法原理二、离子色谱连续抑制装置三、离子色谱的应用第八节离子色谱法离子色谱仪一、离子色谱法原理(Ion Chromatography,简称 IC)以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在七十年代出现、八十年代迅速发展。传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：?(1) 需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；?(2) 洗脱后的组分缺乏灵敏, 快速的再线检测方法 。离子色谱法原理?采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；?细颗粒柱填料, 高柱效；采用高压输液泵；?低浓度淋洗液；?在分离柱后, 用另外一支抑制柱来消除淋洗液的高本底电导；?采用电导检测器检测流出组分 。 快速分离分析微量无机离子混合物；?各种抑制装置及无抑制方法的出现, 发展迅速 。离子色谱具有以下优点：（ 1）分析速度快可在数分钟内完成一个试样的分析；（ 2） 分离能力高在适宜的条件下, 可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法,在十几分钟内, 可使七种阴离子完全分离 。（ 3）分离混合阴离子的最有效方法（ 4）仪器流路采用全塑件，玻璃柱，耐腐蚀二、离子色谱装置类型抑制型：抑制柱型, 连续抑制型分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在 0.01～ 0.05毫摩尔 /克干树脂 。非抑制型, 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～ 0.07毫摩尔 /克干树脂 ),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。离子色谱连续抑制装置图三、离子色谱的应用阴离子分析,双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱 (3× 250mm),流动相,0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3，流量 138 mL/hr。七种阴离子在 20分钟内基本上得到完全分离, 各组分含量在 3～ 50 ppm。第 七 章色谱分析法一、高效毛细管电泳基本原理二、仪器装置三、影响柱效的因素及改进方法四、主要特点和应用第九节高效毛细管电泳高效毛细管电泳仪器（ 1）高效毛细管电泳仪器（ 2）高效毛细管电泳仪器（ 3）一、高效毛细管电泳基本原理在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。1.经典电泳分离法的不足所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC）,温度影响大 。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。2.高效毛细管电泳技术上的重要突破高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：一是采用了 0.05mm内径的毛细管,；二是采用了高达数千伏的电压 。? 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发, 大大减小了温度效应, 使电场电压可以很高 。? 电压升高, 电场推动力大, 又可进一步使柱径变小,柱长增加,? 高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱, 理论塔板数高达几十万块 /米, 特殊柱子可以达到数百万 。3.电泳现象与电渗流现象电泳现象, 带电离子在电场作用下的迁移，速度 ν 电泳电渗流现象, 玻璃表面存在硅羟基,pH&3时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度 ν 电渗流 。4,分离过程? 电场作用下,柱中出现：电泳现象和电渗流现象 。? 带电粒子的迁移速度 =电泳和电渗流两种速度的矢量和 。? 正离子：两种效应的运动方向一致, 在负极最先流出；? 中性粒子无电泳现象, 受电渗流影响, 在阳离子后流出；? 阴离子：两种效应的运动方向相反, ν 电渗流 &ν 电泳 时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离 。5.分离类型八种分离类型(1) 毛细管区带电泳（ CZE）最普遍、最基本的一种分离模式。(2) 毛细管凝胶电泳（ CGE）将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质,DNA等。(3) 毛细管胶束电动色谱（ MECC）在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。由于电泳流和电渗流的方向相反，且 ν 电渗流 & ν 电泳,则带负电的胶束以较慢的速度向负极方向移动，中性试样分子在胶束相和溶液（水相）两相间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围 。二、仪器装置? 电压,0～ 30KV。? 分离柱不涂敷任何固定液,? 紫外或激光诱导荧光检测器（ 可检测到,10-19～ 10-21 mol/L）三、影响柱效的因素及改进方法热效应, 焦耳热仍是影响柱效的主要因素。采用外部冷却的方法散热，择合适的电压和电解质也是提高柱效的有效途径。选择合适的电解质降低电阻，电流低于 200微安，一般几十微安。电渗流控制, 电渗流的大小和方向依赖于毛细管壁与溶液间电势的极性和大小。使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。四、主要特点和应用?高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。?高灵敏度：可检测出低至 10-21 mol/L浓度的物质。?高分析速度：可在 3分钟内分离 30种阴离子； 1.7分钟分离 19种阳离子 ;4分钟可分离 10种蛋白质,?试样用量少：仅需几 nL（ 10-9 L） 的试样?仪器简单，操作成本低, 分析一个试样仅需几毫升流动液。不足之处：?进样不够方便。应用范围相对较窄。?分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反，出峰时间较长。
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