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硕士学位论文
质粒DNA发酵与分离纯化过程的研究
申请学位级别:硕士
专业:生物化工
指导教师:甘一如
菌株为对象,系统地研究了从
本论文以含有质粒的.
发酵到细胞裂解,再到阴离子交换色谱纯化的质粒大规模制备过程。
首先在摇瓶中进行的正交试验用以考察选定因素以及每个因素的各个水平
对质粒菌发酵中菌体浓度的影响程度。根据实验结果选取利于质粒菌高密度发酵
的最优化条件进行质粒的生产。同时进行了大肠杆菌生长曲线的测定和质粒小量
制备纯化及含量测定的实验,以研究该质粒在发酵液中含量同宿主菌生长曲线的
关系,找出收获质粒的最佳时间。然后重点研究了含有质粒的大肠杆菌 在发酵罐中的
高密度发酵。分别详细考察了间歇发酵和流加发酵过程。研究了包括菌体生长和
质粒含量等的关系。
最后用碱裂解法裂解细胞提取质粒,并将提取物进行阴离子交换层析以进一
步纯化质粒。通过改变层析条件,例如阴离子交换固定相,流动相组成,洗脱方
法,上样量等,得到不同的洗脱结果,最终确定阴离子交换色谱纯化质粒的理想
操作条件。
关键词:质粒;发酵:流加:碱裂解;阴离子交换层析 .
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的
研究成果,除了文中特别加以标注和致谢之处外,论文中不包含其他人已经发表
或撰写过的研究成果,也不包含为获得鑫注盘堂或其他教育机构的学位或证
书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中
作了明确的说明并表示了谢意。
学位论文作者签名: 签字日期: 年 月
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解苤叠盘茎有
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基因工程菌SIPI-A0707代谢产物表柔红霉素的分离纯化工艺研究
【摘要】：目的建立天蓝淡红链霉菌基因工程菌(SIPI-A0707)发酵液中表柔红霉素的分离纯化工艺。方法调节发酵液pH值为5,用甲醇抽提表柔红霉素;先采用大孔弱酸性阳离子交换树脂D152,吸附流速为2mL/min,0.05mol/L HCl-50%丙酮解吸;然后采用氯仿-水萃取体系,萃取pH为6.5,反萃取使用pH为1.5的蒸馏水,最后采用大孔吸附树脂Microsphere-1;吸附pH为7,吸附流速3mL/min,50%甲醇解吸分步收集,浓缩冻干。结果表柔红霉素HPLC纯度达到98.1%,总收率为40%以上。结论此工艺在生产上可行性较高,适合工业大量制备。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：TQ927【正文快照】：
图1所示。本实验室在筛选柔红霉素高产菌株的基础上,中断合成其糖基的酮基还原酶的基因,并导入产生表异构化产物的aveBIV基因,成功构建稳定的表柔红霉素(4'-epi-daunorubicin)是合成表柔比星(epirubicin)的重要中间体[1-2],目前主要由柔红霉素经多个复杂的化学反应制备[3],成
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于基因工程黑暗链霉菌发酵产物分离纯化研究的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：基因工程黑暗链霉菌发酵产物分离纯化研究 沈阳药科大学硕士学位论文基因工程黑暗链霉菌发酵产物分离纯化的研究姓名:侯曦凡申请学位级别:硕士专业:微生物与生化药学指导教师:夏焕章沈阳药科大学硕十学位论文摘耍摘要目前国内生产妥布霉素大多是采用产生氨甲酰妥布霉素的黑暗链霉菌发酵来获得含氨甲酰妥布霉素的发酵液,然后在提取过程中水解氨甲酰妥布霉素的氨甲酰基团来生产妥布霉素。这种工艺存在着提取困难、生产周期长、收率偏低等一系列缺陷。针对这些问题,本研究依托本实验室的基因工程黑暗链霉菌,对妥布霉素的分离提取进行了研究,以期建立一条适用于此基因工程菌发酵产物的技术路线。为评估纯化中间体的分离效果,本研究建立了针对中间体的HPLC.ELSD法并对流动相及操作参数进行了优化。确定采用O.1 m01.L-1三氟乙酸溶液作为流动相,雾化管温度40*0,漂移管温度80。C,载气压力0.35 Mpa。使用离子交换法对基因工程黑暗链霉菌的发酵产物进行了提取,通过薄层色谱(TLC)、高效液相(HPLC.ELSD)及质谱(MS)确定其主要组分为妥布霉素和卡那霉素B。为代替经典提取工艺中使用的732强酸性阳离(来源：淘豆网[/p-4692820.html])子树脂,以发酵液为原料筛选了六种不同类型阳离子交换树脂。发现大孔弱酸性树脂HD一2具有吸附总量高、易于洗脱的特点。运用比较实验确定操作参数为吸附pH值6.8、解吸剂为0.1 mol·L-1氨水溶液,流速1.0ml·min~。采用阴离子交换树脂H401进行柱层析分离,确定层析分离操作条件:上样量为5ml,洗脱剂为0.6%(V/V)氨水溶液,流速O.5 ml·min~,层析后妥布霉素纯度达到89.70%。妥布霉素成品纯度可达到93.21%,总收率41.49%。关键词基因工程黑暗链霉菌妥布霉素分离纯化HPLC—ELSD沈阳药科人学硕上学位论文英文摘要AbstractCurrently,most of the tobromycin is produced by Streptomyces tenebrarius which producescarbamoyl tobramycin.And then people can get tobromycin in the proce(来源：淘豆网[/p-4692820.html])ss of hydro-lysis ofcarbamoyl tobramycin.But there are many defects in this peocess,such as long period,difficult tOextracet and low yield.To solve these problems,this study was based on the laboratory strain ofengineered Streptomyces tenebrarius,and the isolation of tobramycin was studied with a view tOthe establishment of a new technology roadmap.To assess the effect of separation and purification of intermediates,we establish a method ofHPLC—ELSD(来源：淘豆网[/p-4692820.html]) tO detect intermediate and operation of mobile phase parameters are optimized.Theuse of 0.1 mol·L-1 solution of trifluoroacetic acid as mobile phase,fog temperature of 40℃,drifttube temperature of 80&C,carrier gas pressure of 0.35Mpa was determined.The products wasextracted by ion-exchange chromatography from fermentation broth of ically EngineeredStreptomyces tenebrarius.The main products is identified as tobramycin and kanamycin B throu(来源：淘豆网[/p-4692820.html])ghdetecting by TLC,HPLC—ELSD and MS.In order tO replace sgong acid cation resins一732,sixdifferent types of cation exchange resin were selected.It was found that the weak acid macroporousresin—HD-2 has following characteristics such as high—adsorption,easy tO be eluted.Through experiments,we determine operating parameters as follows:pH value of 6.8 for theadsorption,O.1 mol·L.1 ammonia solution asdesorption agent,1.0 ml·min~as flow rate.Ani(来源：淘豆网[/p-4692820.html])onexchange resin—H40 1 was used in column chromatography.The operating conditions wasdetermined as follows:the loading volume of 5ml,0.6%(V/V)ammonia solution as eluant,flowrate 0.5 ml。rain-i.The purity of tobramycin obtained after chromatography reach 89.70%,and thepurity of finial product Was 93.21%,with the recovery rate was 41.49%.Key words ically engineered Streptomyces tenebrarius Tobramycin PurificationHPLC.ELSD2关于学位论文独立完成和内容创新的声明本人声明所呈交的学位论文(来源：淘豆网[/p-4692820.html])是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得任何教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我~同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名: 儒戡凡签字日期:灭口可年f月f无Et学位论文版权使用授权书论文《基因工程黑暗链霉菌发酵产物分离纯化的研究》系生金登堂皇生塑剑药学院邀生塑量生丝蕴堂.专业堡曦。& (作者姓名)在沈阳药科大学攻读博士口/硕士囤学位而完成的作品。本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权沈阳药科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1、保密口,在口三年/口五,( 年解密后适用本授权书。2、不保密囹。(请在以上相应方框内打‘~”)作者签名(来源：淘豆网[/p-4692820.html]):前l美尺刷醛备盈滔c3:U卜、…1日期:知扫1年石月侈日日期:么,,仵石月f占日沈阳药科人学硕士学位论文第一章前言第一章前言1.1基因工程黑暗链霉菌及其发酵产物概述黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)是由美国礼莱公司(Eli Lilly Co.)的研究人员于1967年从土壤中分离到的,其发酵产物命名为尼拉霉素(nebramycin)¨】。其主组分为组分2、4、5’,组分2为安普霉素(Apramycin,Am),组分4为6”一O.氨甲酞卡那霉素B(6’,一O—Carbamoylkanamycin B,CKB),组分5’为6”一O一氨甲酞妥布霉素(6&-O—Carbamoyltobramycin,CTB)。组分4,5’经水解,分别形成卡那霉素B及妥布霉素。基因工程黑暗链霉菌是本实验室通过基因工程技术由黑暗链霉菌H6菌株改造而来的。黑暗链霉菌H6共产生三种抗生素,分别是氨甲酰妥布霉素、氨甲酰卡那霉素B和安普霉素。通过基因工程技术的改造,我们的目的是使其(来源：淘豆网[/p-4692820.html])仅产生妥布霉素,这样可以在分离纯化中省略水解的步骤,降低分离成本。1.2妥布霉素的理化性质和结构特点妥布霉素(tobramycin)又曾译为乃柏欣、托普霉素、妥布拉霉素,是黑暗链霉菌(S.tenebrarius)产生的尼拉霉素(nebramycin)混合物中的主要成分(尼拉霉素6)。妥布霉素属于氨基糖苷.氨基环醇类抗生素(又称氨基糖苷类抗生素)中的4,6.双取代去氧链霉胺衍生物类砼】。它的化学结构与卡那霉素B十分相似(卡那霉素B与妥布霉素结构的区别仅为卡那霉素B的C37位为OH,妥布霉素C37位为H)。H2NTobramycin Kanamycin B图1.1妥布霉素与卡那霉素B的结构比较Fig 1一l parison of kanamycin B and tobramycin妥布霉素是一种碱性抗生素,易溶于水,微溶于甲醇,不溶于大部分有机溶剂(如丙酮,高级醇等)。在37。C,pH 3。11下稳定,其溶液在热压器下加热20分钟,不失去抗菌活性。与磷钨酸反应成白色沉淀,与茚三酮反应显色吲。据文献(来源：淘豆网[/p-4692820.html])[41报道,妥布霉素的离解常数如下表:3沈阳药科大学硕上学位论文第一章前言L+H十=【HL]+【HL】++H+=【H2L】2+【H2L】2++H+=:【H3L]3+f心L】3++H+=fH4L]“[叫4++H+=【H5L]5+9.37..3妥布霉素的药理作用妥布霉素是一种高效的广谱抗生素,抗菌谱比卡那霉素广,与庆大霉素相似,对绿脓杆菌的抑制作用比庆大霉素强2倍,同时对庆大霉素耐药菌株仍有效,在动物实验中,妥布霉素的耳、肾毒性比庆大霉素低侈】。临床主要用于敏感细菌引起的严重感染,特别是绿脓杆菌、大肠杆菌及肺炎杆菌等引起的烧伤感染、败血症、呼吸系统感染、泌尿系统感染、胆囊胆道感染及软组织严重感染等嘲。1.4妥布霉素的分析方法近年来,氨基糖甙类抗生素分析方法不断发展,主要有微生物检定法、旋光法分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法等【71,用这几种方法测定妥布霉素成品的含量已有文献报道【81,但未见用于评估纯化中间体分离效果的报道。下面对妥布霉素分析中常用的(来源：淘豆网[/p-4692820.html])几种方法做以分述。1.4.1微生物检定法目前,各国药典绝大多数用微生物检定法分析妥布霉素等氨基糖甙类抗生素的含量‘91。该法的优点是能真实反映抗菌活性,但该法不能排除产品中存在的理化性质与妥布霉素相近的其他氨基糖甙类杂质的干扰,只能测定发酵液中各活性物质的总效价0101,因此微生物检定法仅适用于树脂类型的筛选,而无法对纯化中间体的分离效果给予评价。1.4.2旋光法李秀蓉、王铁杰等采用旋光法测定妥布霉素注射液的含量,据称测定结果与运用微生物法所得结果基本一致‘11’1 21,但该方法不能排除妥布霉素溶液中存在的其它旋光性物质的干扰,因此,李秀蓉等仅将该法用于制备注射液,而未用于发酵液的分离纯化过程。4沈阳药科大学硕上学位论文第一章前言1.4.3薄层色谱法陈晓英、刘光华等【l 3】采用自制的硅胶H板对纯化中间体进行了分离测定,并对展开剂进行了优化,据称达到了美国药典24版的分离要求,但该方法定量测定极不准确,仅适用于对发酵液进行定性分析,影响了这种方法在纯化过程中的应用。在薄层色谱法的基础上,叶傅华、陈树玉等发展了薄层层析生物显影测定法【l 4】,并对尼拉霉素进行了测定,该法结合了薄层层析法的快速分离和微生物鉴定法真实反映抗菌活性的优点,能直接用于快速分离氨基糖甙类抗生素的发酵液或分离过程中解吸液的效价测定,但该法仍存在人为估计抑菌圈面积时难度大,操作条件严格等缺点,并不能用于纯化中间体的定量分析。1.4.4高效液相法另一种用于氨基糖甙类抗生素的方法是高效液相色谱法(HPLC),其全面发展了色谱法的优点,具有高效、快速、灵敏,适用范围广等突出优点。但由于氨基糖甙类抗生素具有水溶性强,本身结构中缺少强紫外吸收基团等特点,使有关高效液相色谱法分离测定工作的开展受到了一定的限制,现有的一些关于妥布霉素HPLC分析的报道,多为用2,4.二硝基氟苯(FI)NB)或邻苯二醛(OPA)在柱前进行衍生化反应,色谱柱后采用紫外或荧光检测器进行检测【151。该法虽能提高检测器对妥布霉素的检出能力,但衍生化反应对检测结果的影响很大,导致测定结果的重现性差,因此限制了该法在妥布霉素检测中的应用。蔡玉娥,蔡亚岐等使用电化学检测器检测妥布霉素【16】,据称具有灵敏度高的优点,但由于电化学检测器的价格昂贵,经济性不好,因此一直未被广泛接受。近年来,国内、外陆续有采用蒸发光散射检测技术(ELSD)分析氨基糖苷类抗生素的报道H 7。20],HPLC.ELSD法由于操作简单,定量结果准确,蒸发光检测器价格相对较低,日益受到关注。其中,洪利娅,陈悦等将蒸发光散射检测技术应用于妥布霉素的分析中¨71,但主要集中在成品含量检测方面,并无对发酵后纯化中间体进行HPLC.ELSD分析的报道,因此本研究将对使用蒸发光散射检测技术评估纯化中间体的分离效果进行探讨。1.5妥布霉紊的提取方法1.5.1应用阳离子树脂分离提取发酵液中妥布霉素的技术路线分析采用离子交换法分离抗生素是利用某些抗生素(如妥布霉素)能解离为阳离子或阴离子的特性,使其与离子交换树脂进行交换作用,将抗生素暂时吸附在树脂上,然后再以适当的条件将抗生素从树脂上洗脱下来,这样能使体积缩小到几十分之一,从而达到分离、浓缩、提纯的目的口¨。妥布霉素为碱性抗生素,在酸性条件下呈阳离子状态,可与阳离子交换树脂进行交换作用,因此可以使用离子交换法进行分离,这是应用阳离子树脂从发酵液中分离提取妥布霉素的理论基础。气鲨里垫型盔堂堡主茎垡笙壅至二里萱童离子交换树脂是一种化学稳定性良好的固态高分子化合物。其巨大的分子可以分为两部分【22】:一部分是不能移动的多价的高分子基团,构成树脂的骨架;另一部分是可移动的离子,称为活性离子。骨架上的活性离子在水溶液中发生解离,可在较大的范围内自由移动,扩散到溶液中。同时,在溶液中的同类型离子,也能从溶液中扩散到骨架的网格或孔内。当这两种离子浓度差较大时,就产生一种交换的推动力,使它们之间产生交换作用。浓度差越大,交换速度越快。利用这种浓度差的推动力使树脂上的可交换离子发生可逆交换反应。其离子交换过程包括下列五个步骤:(1)溶液中的阳离子或阴离子自溶液中扩散到树脂表面;(2)溶液中的阳离子或阴离子自树脂表面扩散到树脂内部活性中心;(3)溶液中的阳离子或阴离子与树脂上相应的活性离子发置换反应;(4)解吸下来的离子自树脂内部的活性中心扩散到树脂表面;(5)解吸下来的离子再从树脂表面扩散到溶液中。因为离子交换反应的速度较快,而离子的扩散速度较慢,因此离子的扩散步骤是整个离子交换过程的控制步骤[231。离子交换树脂可以按照可交换功能基团中活性离子来分类,通常将树脂分为强酸性(一S03H)和弱酸性(--COOH)阳离子交换树脂和强碱性(一N+3R3C1。)弱碱性(一NH2,一NRH,--NR2)阴离子交换树脂四大类。强酸性离子交换树脂在溶液中能完全解离,在酸性、中性、碱性溶液中均能进行交换吸附,交换容量基本上一致,化学稳定性好,而弱酸性阳离子交换树脂在酸性溶液中仅微解离。离子交换分离妥布霉素的主要依据是阳离子交换树脂对妥布霉素、卡那霉素B及杂质的亲和力不同,从而达到分离的目的。离子交换树脂对离子的结合力取决于该离子的化合价数、树脂的种类与性质以及溶液中其它离子的影响。阳离子交换树脂对离子的结合力随交换离子的价数增加而变大。对不同价的离子,电荷越高,结合力越大。而对同价离子,水合离子半径小即原子半径大或离子半径大,其结合力大,反之则小。不同于强酸性树脂,弱酸性树脂与H+的结合能力很强,杀和力大于其他阳离子。根据离子交换理论,一般分离提取弱碱性抗生素宜选用强酸性树脂。但强酸性树脂与妥布霉素结合牢固,洗脱困难,同时选择性较差。而弱酸性树脂具有吸附容量高、易洗脱、洗脱液高峰集中、选择性较高等优点。根据严希康、赵丽等的报道幽】,使用弱酸性树脂分离同为氨基糖苷类抗生素的卡那霉素,洗脱容易,生产周期短,收率也比使用强酸性树脂高。这一点也得到本研究的证实。离子交换树脂根据骨架结构还可分为凝胶型树脂和大孔型树脂两大类。凝胶离子交换树脂水化后,处于溶胀状态,交联链之间的距离拉长,形成空隙,并随外界溶液浓度、溶剂和起交换离子的性质而改变。由于凝胶树脂的空隙较小,对吸附有机大分子比较困难。有时吸附后不容易洗脱下来,使树脂交换能力降低,若降低交联度,固然可使空隙增大,但会降低树脂的机械强度。大孔离子交换树脂与凝胶树脂相比,有下列优点:(1)结构比凝胶型树脂跟6沈阳药科大学硕上学位论文第一覃前言稳定;(2):fL径大,适宜于交换有机大分子,且交换速度一般也较快;(3)比表面积大;(4)大孔离子交换树脂即使完全失水也能维持其多孔结构和巨大的内部表面积。基于以上优点,本研究主要采用大孔型树脂进行。妥布霉素发酵液的组成成分比较复杂,主要含有妥布霉素、卡那霉素B和大量的各种杂质组分,因此在妥布霉素发酵液中存在着大量的混合离子。离子交换树脂对混合离子的分离功能是基于其离子交换选择性。在稀溶液中,离子的电荷越高,水合离子半径越小,树脂对其选择性越高。对于体积较大的离子,树脂因其它非静电作用而呈现较大离子选择性。离子交换树脂的交联度增加,选择性也会随之提高。在吸附和洗脱过程中,由于不同的物质组分与树脂的结合力不同,因此在吸附过程中,与树脂结合力强的先吸附,而结合力弱的后吸附。这样,不同的物质在树脂层中分布在不同的区域,从而达到物质的分离。在洗脱过程中正好相反,与树脂结合力弱的先被洗下来,结合力强的后被洗下来。离子交换树脂含有可电离基团,它们对物质的分离纯化主要是通过离子交换反应实现的。离子交换反应一般是可逆的,反应方向受树脂交换基团的性质、溶液中离子的性质和浓度、溶液pH值、温度等的影响。这也是本研究重点考察的参数。妥布霉素是一种弱碱水溶性化合物,在不同的pH水溶液中可呈不同的电化学状态,这一性质使我们可以通过调节溶液的pH值来控制妥布霉素所带电荷数。根据离子交换选择理论,树脂优先吸附价数高的离子,而对价数低的组分后吸附,遵循这一思路,我们可以通过向溶液中添加酸性物质来提高妥布霉素所带电荷数量,增加其与树脂的结合能力。这样,树脂可以优先吸附妥布霉素,而发酵液中结合能力弱的其它杂质后与树脂吸附。而在用铵盐除杂时正好相反,与树脂结合能力弱的杂质先被洗脱下来,结合能力强的妥布霉素后洗脱下来,从而达到分离提取妥布霉素的目的。离子交换的方式一般分为静态法(反应器法)和动态法(管柱法)两种:静态法是将一定数量的树脂与所处理的溶液混合搅拌,然后用过滤、离心沉降等方法将树脂与溶液分离。因为存在可逆的平衡,这种交换不容易完全。必须经过较长时间,树脂才能达到完全吸附。该法一般只是用来筛选树脂类型,确定树脂的交换容量、交换速度等参数时用到。有时由于某些原因不适宜用柱进行操作时也可采用。动态法中离子交换反应是可逆的平衡反应。为了使平衡向右反应完全必须使交换剂与新鲜的料液接触,交换后的离子必须尽快离开树脂,使平衡向右。所以管柱式操作应用最为广泛。将料液通过装有树脂的柱中,料液在柱中流经树脂层时发生交换。此法的特点是溶液在流动过程中不断与新树脂接触和交换,在一局部位置的交换就如一次静态交换一样,当溶液流到下一局部位置时有相当于一次静态交换。实际上,动态操作基本上是一种复杂的多次间7播放器加载中，请稍候...
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