指纹图谱技术的峰上怎么标记数字

利用SSR分子标记构建水稻品种DNA指纹图谱的研究进展--《中国稻米》2011年01期
利用SSR分子标记构建水稻品种DNA指纹图谱的研究进展
【摘要】:SSR分子标记具有数量丰富、共显性遗传、操作简单、结果稳定等优点,已成为水稻品种指纹图谱构建的理想标记。本文综述了水稻品种DNA指纹图谱构建原理、技术要点、发展趋势及其在水稻科研和生产中的重要作用,并就SSR分子标记构建水稻指纹图谱的发展前景进行了分析。
【作者单位】:
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【分类号】:S511【正文快照】:
我国是水稻生产大国,通过多年努力已成功培育出许多适合不同气候条件、具有不同生育期、拥有各种抗性的水稻品种。据统计,年,参加我国南方稻区水稻国家区域试验的水稻品种共有723个,从1998年的82个增加到2005年的229个,增幅达169.5%[1]。虽然我国在品种选育方面取
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玉米DNA指纹图谱库的分析与设计[专业:计算机应用技术]
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中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后,采用一定的分析手段,得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。 中药指纹图谱是一种综合的,可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。类&&&&别教育开&&&&本16
以指纹图谱作为中药(天然药物)提取物及其制剂的质量控制方法,已成为目前国际共识,各种符合中药(天然药物)特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立。美国食品药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱;世界卫生组织(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定,如果草药的活性成分不明确,可以提中药指纹图谱倡导者谢培山教授供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致;欧共体在草药质量指南中亦称,单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的,因为草药及其制剂是以整体为活性物质。色谱指纹图谱尤其是薄层色谱的鲜明的指纹图谱是很有用的。国外指纹图谱的应用,目的在于解决成分复杂,有效成分不明确的植物药质量检测和产品批次间质量差异的问题。其中德国研制的银杏叶提取物制剂是一个突出的例子。他们应用指纹图谱制定了相应的标准,该图谱体现了制剂所含的33个化学成分(主要为黄酮类和内酯类)和各自的含量。经化学成分和药效相关性研究,发现约24%银杏黄酮和约6%银杏内酯组成的提取物具有最佳疗效。此外,采用“混批勾兑”法,可使最终产品质量稳定,指纹图谱重现性良好,含量浮动范围为5%左右。
20世纪70年代我国已有学者尝试使用TLCS对中成药进行分析,因主客观条件的限制,技术和时机的不成熟,没有得到公认;20世纪90年代《中国药典》增设了中药化学对照品和对照药材,为中药指纹图谱的研究奠定了基础。随着色谱技术的迅速发展和检测能力的显著增强,为指纹图谱的研究和应用提供了良好的技术保证。目前我国已对中药注射剂做出了必须用指纹图谱进行检测的规定,同时提出了具体的技术要求;在中药材规范化生产实施过程中指纹图谱亦有较广泛的应用。
但是作为一项新技术,中药指纹图谱在实际应用中还面临许多问题,只有进一步加强中药材种植加工和中成药生产贮存的规范化;中药化学成分和中药药理研究的系统化和标准化;以及技术上多学科的渗透,才能保证中药质量的稳定,进而保证中药指纹图谱的建立.中药及其制剂均为多组分复杂体系,因此评价其质量应采用与之相适应的,能提供丰富鉴别信息的检测方法,但现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法都不足以解决这一问题,建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量,进而对药品质量进行整体描述和评价。这也正好符合中医药整体学说。在此基础上,如果进一步开展谱效学研究,可使中药质量与其药效真正结合起来,有助于阐明中药作用机理。总之,中药指纹图谱的研究和建立,对于提高中药质量,促进具有重要意义。中药指纹图谱是一种综合的,可量化的鉴定手段,它是建立在中药化学成分中药指纹图谱相关书册系统研究的基础上,主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“模糊性”为其显著特点。
中药指纹图谱(fingerprinting)是借用发展而来。最先发展起来的是中药化学成分色谱指纹图谱,特别是(HPLC)指纹图谱。HPLC具有很高的分离度,可把复杂的化学成分进行分离而形成高低不同的峰组成一张色谱图,这些色谱峰的高度和峰面积分别代表了各种不同化学成分和其含量。由此可见,中药指纹图谱比DNA指纹图谱更进一步的发展在于:不但有特征的体现(各种化学成分的个数和相对位置——保留时间)可作定性鉴别使用,还体现了量的概念。峰的高度和峰面积表示了某个化学成分的含量,而各峰的峰高(或峰面积)的比值体现了各种化学成分间的相对含量;量的概念的引入、定性和定量的结合赋予中药指纹图谱更大的功效;中药指纹图谱不仅可以进行个体、某物种的“唯一性”的鉴定,还可以将其“量”的特征和其他体系挂钩。
因此,中药指纹图谱不仅是一种中药质量控制模式和技术,更可以发展成为一种采用各种指纹图语来进行中药理论(复杂系统)和新药开发的研究体系和研究模式。狭义的中药指纹图谱是指中药化学(成分)指纹图谱,广义的中药指纹图谱则可按应用对象、测定手段进行不同的分类。中药指纹图谱可用于中药制剂研究、生产过程的各个阶段,按应用对象来分类,可分为中药材(原料药材)指纹图谱、中药原料药(包括饮片、配伍颗粒)指纹图谱和中药制剂指纹图谱。如分得更细,还可包括用于工艺生产过程中间产物的指纹图谱。值得注意的是建立中药材化学指纹图谱必须考虑诸多因素的影响。中药品种混杂,历史上形成的同名异物、异名同物,以及同一物种受产地环境、不同有效部位所含成分的波动大等因素,给质量控制带来了很多困扰。因此对于某一种中药材的指纹图谱,需要有大量的数据积累,才能制定合理的相似性标准。中药指纹图谱按测定手段可分为中药化学(成分)指纹图谱和中药生物指纹图谱。中药生物指纹图谱主要是测定各种中药材的DNA图谱,由于每个物种基因的唯一性和遗传性,中药材DNA指纹图谱可用于对中药材的种属鉴定、植物分类研究和品质研究。它对中药材基地建设、中药材种植规范()、选择优良种质资源和药材性研究极为有用。
中药化学(成分)指纹图谱是指测定中药材所含各种化学成分(产物)而建立的指纹图谱。虽然化学成分是次生代谢产物,受生物环境和生长年限的影响而产生个体间较为明显的差异,但植物的代谢具有,作为同一物种的个体在化学成分上也具有(similarity),可以用化学成分的谱图来建立指纹图谱。中药化学(成分)指纹图谱主要有和:如(UV)、(IR)、(MS)、谱(NMR),(TLC)、(GC)、高效液相色谱(HPLC)、(CE),以及各种联用技术。中药材化学指纹图谱对控制中药材质量具有更直接、更重要的意义。指纹图谱应该具备指纹性,即:(1)专属性强。指所制订的指纹图谱应该是该LT—II型全自动薄层成像系统药材所独有的、能与其它药材相区别的,其反映的化学信息是具有高度的选择性的;(2)稳定性好。即中药材的指纹图谱应该是从某中药材的多批次中归纳出的共性,图谱中的共有峰或特征峰应相对稳定;(3)重现性好。所制订的指纹图谱在规定条件下应能再现指纹特征(如共有峰数目、大小、位置等),其误差应在允许的范围内。只有这样,所制订的指纹图谱才具有实用价值。中药指纹图谱是借助于波谱或色谱技术获得的中药(主要是植物药)次生代谢化学成分的光谱图或色谱图。目前,中药已涉及众多方法,包括薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和高效毛细管电泳法(HPCE)等色谱法以及紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、质谱法(MS)、核磁共振法(NMR)和X—射线衍射法等光谱法。其中色谱方法为主流方法,尤其是HPLC、TLCS和GC已成为公认的三种常规分析手段。由于HPLC具有分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快、应用范围广等特点;中药成分绝大多数可在高效液相色谱仪上进行分析检测,且积累较丰富的应用经验。因此高效液相色谱法已成为中药指纹图谱技术的首选方法。随着HPLC— MS和GC—MS等联用技术的应用,中药指纹图谱技术更趋完善。
1 薄层色谱法(TLC) 薄层色谱具有选用范围广,重现性好等优点,常用于中药各种成分的鉴别。用固定波长对薄层展开的各斑点作薄层扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确,因而具有更好的指纹鉴别意义。但由于受薄层板的质量和开放式层析系统等外界因素的影响,易引起一定的实验误差。
2 气相色谱法 (GC) 气相色谱是封闭性色谱,受外界影响较少,具有高性能、高选择性、高灵敏度等优点,适合于药材及制剂中挥发性成分指纹图谱的研究。一般使用质量型检测器-氢火焰离子化检测器(FID)。钱浩泉等[5]用气相色谱法建立了高良姜及其边缘植物挥发油成分的指纹图谱。具体应用中多与质谱联用,不仅具有 GC 的高分离效能,而且兼备了质谱鉴定的高灵敏度和准确性。
3 高效液相色谱法 (HPLC) 高效液相色谱具有分离效率高,分析速度快,定量精密度高,检测器种类多,稳定性好等特点。不受样品挥发度和热稳定性的限制,比气相色谱法应用范围更广,样品中大多数成分均可在高效液相色谱仪上进行分析检测,是构建指纹图谱的主要方法之一。由于中药成分的复杂性,构建指纹图谱一般采用梯度洗脱,因为逐步提高流动相洗脱能力可获得较多色谱峰,提供更多指纹信息。在考察条件时,要对指标成分和非指标成分都予以考虑,由于药材中各种成分的吸收波长及对不同检测器的响应不同,在构建指纹图谱时也需要加以考虑。实际应用中多使用多种联用技术,五味子水煎物指纹图谱共有指纹峰相对峰面积充分利用各检测器的互补性,从不同角度反映药材及制剂的全貌,从各种图谱中得到结构信息。
4 高速逆流色谱法 (HSCCC) 它是目前国际上较新型的液-液分配色谱技术,利用相对移动的两种互不相溶溶剂,在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的组分分离。已有报道[6]将 HSCCC应用于生物碱、黄酮、木脂素、蒽醌等天然产物的分离分析。具有分离效率高,溶剂用量少,无吸附,样品回收率高,重现性好和适用范围广等优点。
5 高效毛细管电泳法 (HPCE) 高效毛细管电泳技术是以高压电场为驱动,毛细管为分离通道,依据样品中各组分淌度和分配行为上的差异而实现高效快速分离的新型电泳技术。毛细管电泳的广泛应用取决于其多变的分离模式,几乎涉及分析化学中所有的分离对象,小到无机离子,大到蛋白质和高分子聚合物,也能够分析不带电荷的中性物质[7]。具有所需样品少、溶剂消耗少、抗污染能力强、可直接分析水溶液等优点。其中毛细管区带电泳 (CZE) 和胶束电动毛细管电泳色谱 (MECC) 是中草药分析中最常见的两种模式。但该方法的重现性有待提高。
紫外可见光谱 (UV) 紫外可见光谱反映不同化学物质的电子共扼体系特征,具有加和性,对于混合物的鉴别专属性差,分辨率低,故紫外光谱很少用于指纹图谱的构建。
红外光谱和近红外光谱 (IR) 红外光谱是由分子的振动-转动能级跃迁产生的光谱,红外光谱具有高度的特征性。近红外光谱法在中药质量控制方面有较好的应用前景。
核磁共振法 (NMR)
从纯有机化合物的核磁共振氢谱上可获得结构信息,包括各类质子的化学位移、数量核偶合关系。核磁共振谱具有高度的重现性和特征性,易于解析和进一步研究,可评价药材和中成药质量的均一性和稳定性。
9 质谱法 (MS) 将中药提取液置质谱仪中进行电子轰击电离,可获得提取液中化学成分的质谱指纹谱,不同中药提取液所含成分不同,所得质谱图显示的分子离子峰及进一步,裂解碎片峰不一致,可供鉴别。
X射线衍射法 物质被X射线照射可产生不同程度的衍射现象,只要某一混合物的组成是恒定的,其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。该法具有图谱指纹专属性强,信息量大,所需样品量小等诸多优点,X射线衍射法在动物类药材鉴定与辨别中有独特的优势[8]。
分子生物学法 (DNA) 利用聚合酶链反应从不同生物样品中人工合成 DNA片断,而这种 DNA片断的大小、数目可因不同的生物而异,故称之为 DNA指纹图谱。该技术具有重复性好、灵敏度高的优点。限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)是最常用的构建 DNA指纹图谱的方法,但该法费时费力,应用受到限制。随机扩增多态 DNA(RAPD)标记,可以在特异 DNA序列尚不清楚的情况下,检测DNA的多态性,这是构建中药指纹图谱的新方法,具有极好的应用前景。 罗志勇等[9]采用 RFLP技术,分析了人参、西洋参基因 DNA指纹图谱。[1]随着分离分析技术的发展,中药质量研究也由过去“四大鉴别”(基元鉴别、性状鉴别、、理化鉴别)发展到反映中药材全貌的指纹体系,即反映中药材的多元化学组成特性的化学指纹图谱和反映生物体 (除矿物、树脂类外) 特性的基因指纹图谱,从有效成分和遗传物质两方面实现对中药材的质量控制,为中药材以及中成药提供综合的和可量化的质量评价方法。中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础,最早可以追溯到20世纪60正在进行中药指纹图谱研究年代,如采用薄层色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征,这是早期的原始的指纹图谱,具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用,基于的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展,高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用,为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景。
紫外光谱指纹图谱
紫外光谱法是1995年以前指纹图谱常用的方法。由于不同中药所含的不饱和程度有差异,因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异,以此达到鉴别效果。常用导数光谱及结合各种数学分析法来消除样品中的一些无关吸收,排除原图谱中的某些干扰。
红外光谱(IR )指纹图谱
红外光谱又称分子振动转动光谱,是一种分子吸收光谱。当样品受到频率连续变化的红外光照射时,分子吸收了某些的,并由其振动或转动运动引起偶极矩的净变化,产生分子振动和转动能级从到的跃迁,使相应于这些吸收区域的透射光强度减弱。记录红外光的百分透射与或关系的曲线,就得到红外光谱。一般的红外光谱是对整个化合物分子的鉴别,比单纯的的化学定性鉴别专一性更强。而中药材的红外光谱在本质上与纯化合物红外光谱不同,它是混合物中各个组分红外光谱的叠加。中药材各种化学成分只要在质和量的方面相对稳定,并且样品处理方法按同一要求进行,则其红外光谱也是应该相对稳定的。因此这样得到的混合物红外光谱应该是具有一定的客观性和可重复性。利用上述原理,不同混合物的红外光谱各主要吸收峰归属,只要在cm,范围内比较光谱差异即可。这种差异可以表现在三个方面:一是在某一波数处鉴别双方只有一方有明显差异;二是在某一波数内,鉴别双方的光谱中,吸收峰的形状和强度都有明显差异;三是“指纹区”,面貌不同。
近红外光谱法(NIRS)是一种用于鉴定有机物质十分有用的技术,是中红外光谱中C-H, N-H,O-H和S-H的共振吸收,具有高信息量。波长范围为780nm-2500nm,而且该光谱取决于粒子大小、多晶型、残留溶剂、湿度等等因素。因此待测物光谱的鉴定不可能直接与参比物质光谱比较后确定,需要通过一系列样本的检测(必须预先知道样本中相关成分的含量或样本的定性归属),运用化学计算学手段,建立样本与信息之间的数学模型。运用该模型即可以对未知样本(例如新近购进的原药材或新生产的成品等)进行辨别分析(给出结果:合格与否、含量多少等)。该方法为非破坏性方法,可实现产品的无损检测,具有检测速度快,操作简单,所需样品少,适宜于液体、固体、粘稠流体的分析及过程控制等优点。但是在进行定性定量分析中必须采用一定的数据处理,需要掌握一定的化学计量知识。
中药注射剂常含荧光性物质,但因不同注射剂所含具体荧光性物质不同,同种注射剂又因厂家的具体配方的差异或制备工艺条件的波动,均会使其特征的荧光激发、发射光谱不同或其强度呈现差异;根据注射剂的荧光图谱的差异达到快速鉴别、认定和控制配方、工艺的目的。
荧光光谱不像红外光谱那样具有明显的指纹特征,但具有高灵敏度的显著优势,且差异更为一目了然,易于判断,因此,可以作为红外光谱指纹技术的一种补充,用于中药注射液的鉴别和认定,以及生产工艺的控制和成药热稳定性研究等。色谱指纹图谱最实用、应用也是最广泛。中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段,是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一。色谱指纹图谱最大的优点是具有分离的功能。
薄层色谱(TLC)指纹图谱
TLC为传统的定性、半定量分析方法,在中国“七五”、&十一五”及“中药九五”公关课题中有大量采用薄层色谱法进行地道药材的定性鉴别。该法操作简单、分析速度快速、一次分析样品多,提供信息量大,用固定波长对薄层展开的各个斑点进行扫描,所得扫描图谱比目测的层析图谱更加客观准确,因此具有较好的指纹鉴别意义。其最大的缺点是重现性以及精密度差,所以在指纹图谱应用中受到限制,但可以作为中药指纹图谱研究的借鉴和补充。
气相色谱(GC)指纹图谱
中药指纹图谱技术
GC最适合于各种主含易挥发性成分药材及其制剂的分析,尤其是毛细管气相色谱法,分辨率很高,往往一个色谱可以分出百个成分。该法灵敏度高、分离度好,分析速度快,但是分析范围只是局限于低沸点成分,是指纹图谱研究的主要方法之一。
高效液相色谱(HPLC)指纹图谱
HPLC适用于成分复杂而不易分离的分析对象,具有分离效能高,灵敏度高,分析速度快,不需要气化,检测手段多等优点,是目前指纹图谱技术中用途最广泛的一种方法。
(HSCCC)指纹图谱
HSCCC是当前国际流行的新型的液-液分配技术。应用动态液一液分配原理,利用相对移动互不混溶的两相溶剂,在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品组分离。其特点是不用固相载体作固定相,克服了样品吸附、损失、峰形拖尾问题。操作更为简便,容易掌握。对样品的预处理要求低,仅需一般粗提物即可。该技术的回收率高,能实现梯度操作,亦能重复进样,在中药质量分析控制研究中,尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。
(CE)指纹图谱
毛细管电泳(CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE),以弹性毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的电泳分离分析方法,是近年发展起来的一种新的分离技术,是电泳技术和层析技术结合的产物,兼有高压电泳的高速高分辨率及HPLC的高效率等特点,其选择性与高效液相有很大的互补性。因此在指纹图谱研究方面的应用越来越广泛。
联用技术 由于中药复方制剂成分复杂,现行的各种单一测定方法给出信息少均无法建立较完善的指纹图谱,因而有人提出建立多维指纹谱尝试解决这一问题。所谓多维,即采用多种分析仪器联用的模式来测定指纹图谱,各谱图间相互补充信息,可对复杂供识品有更清晰完整的认识。目前最常用的是高效液相(或气相色谱)/二极管阵列检测器/质谱/质谱联用方式 (HPLC或GC/ DAD/ MS/ MS) 所得的多维指纹图谱。多维谱的建立既能较系统、较完整地解决中药复方制剂质量控制的难题,又为中药研究中缺乏标准品的难题提供了种新的解决途径。除了手性化合物外,从概率上要找出4个或以上图谱信息完全相同的化合物几乎是不可能的。当某一物质进行衍射分析时,该物质被X射线照射而产生不同程度的衍射现象。可分为单晶X衍射法与粉末X衍射法。物质组成、晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定该物质产生特有的衍射图谱。如果该物质是一混合物,X-射线衍射图是各混合物各组分衍射效应的叠加。只要这一混合物的物质组成是恒定的,其衍射图谱可以作为该混合物的特征图谱。X -衍射指纹图谱具有指纹性强,图谱稳定可靠等特点。尤其是X衍射Fourier谱分析法可用于动物类药材的鉴定与伪品识别。核磁共振氢谱(1H-NMR)是鉴定有机化合物结构的重要的方法之一。它中药指纹图谱的相关会议可以获得化合物的包括各类质子的化学位移、数量、偶合关系等多个结构信息。如可以用一定程序获取植物类中药的特征性化学成分(或化学成分组)的总提取物,同时这些特征的化学成分的含量是相对固定的,则在规范的提取分离条件下,植物类中药的1H-NMR图谱与植物品种存在着严格的对应关系,没有混淆的可能性。图谱中的信号强弱反映了混合物中各组分的相对含量。在对特征总提物进一步分离得到单体后,通过结构鉴定和NMR研究,可以对指纹图谱中的各特征谱线进行归属。随着分子生物学技术的迅速发展,DNA分子技术己越来越多的用于中药材品种鉴别的研究。分子生物指纹图谱是指采用分子标记技术得到的某一中药材品种的DNA指纹图谱。如对于、一类中药材的鉴别,用传统的方法(性状、显微、理化等鉴别方法)都显片面性,结果往往很模糊,因而其产地、生长年限、加工方式等因素与其性状和成分不呈很强的相关性,但应用分子生物学技术可以迎韧而解。指纹图谱的特征信息的分析与提取又称作数据挖掘。中药指纹图谱形象地反映了药用植物物种具有遗传特性的次生代谢“共有特征”,又由于次生代谢中地域、生长环境、采收等多种不定因素影响,具有统计学中多元随机分布的“模糊性”。数据挖掘技术就是利用模糊数学、统计学、计算机技术等建立一种同时反映这两种特征的方法,即从中药指纹图谱数据信息库中提取隐含的及有潜在应用价值、最终可理解的模式的过程。它是发现和解析中药指纹图谱潜在信息的有力工具,目的是评价和控制中药质量及研究中药定量组效关系(quantitative composition-activity relationship,QCAR);包含三个过程;
中药指纹图谱指纹图谱信息化包括数据的获取和数字化。主要过程为针对某类样品和要求,确定合适的获得指纹图谱的分析方法(如色谱或光谱等),建立整个分析方法的各种操作条件,进行测试,以获得不同样品的指纹图谱,即数据的获取。对所得指纹图谱进行分析,确定其数字特征。如对红外指纹图谱、可用峰的波数和强度作为其数字特征来表示某个峰。获得信息化后的指纹图谱,需要研究如何来利用这些信息,即实现指纹图谱知识化。指纹图谱知识化包括信息解读、比较和判断,化学信息和药效信息相关性研究和信息的利用,即从大量指纹图谱数据中得到有关规律和知识。采用的方法有、模式判别、关联度分析、等。
(1)聚类分析
聚类分析就是根据一定的规律和要求,对研究的对象进行分类。其基本思路是用“相似度”来衡量样品之间的亲疏程度,并以此来实现分类。通常将相似度大的样本归为一类,GoodSee-20E经济型薄层成像系统相似度小的样本归为不同类。对于不同批次的中药样品其色谱指纹图经计算机快速辨识处理可依据样品批与批之间的相似度,确定中药样品批间的稳定性。
模糊聚类分析的基本步骤如下:
A. 计算样品之间的相似度,并将其构成模糊相似关系R。在由m个己量化的指纹特征组成的m维空间中,可用多种方法定义样品之间的相似度。如:相关系数法、最大最小法、算术平均最小法、几何平均最小法、绝对法、广义夹角法、马氏距离法、欧氏距离法等。
B. 用上述方法建立起来的模糊相似关系矩阵R,只有自反性和对称性,而没有传递性,需要将模糊相似关系矩阵R改造为模糊等价关系矩阵R`,再进行分类。
C. 取一定M值,作等价矩阵的截矩阵,依据取值的不同得到动态聚类谱系图。
(2)模式判别
模式判别的基本思路是先建立标准样本模式的色谱指纹图谱,然后对未知模式(待鉴定样品)色谱指纹图谱进行计算机解析,依据其与标准样本模式的“隶属度”、判别未知模式的真伪及优劣。
(3)关联度分析
众所周知,衡量药品质量的终极标准是药效。采用化学分析方法控制药品质量是一种间接的质量控制手段。一般来说,是成分单一的化合物或化学成分明确的混合物,这些化学成分的性质和数量决定了药品的疗效,因此定性和定量地控制这些化学成分就可全面地控制药品的内在质量。但中药与西药不同,中药相当于一个大,其成分多而复杂,大部分中药的化学成分不完全明确,某些已知成分并不能代表中药的全部疗效,因此传统的质量控制模式即单一成分的定性与定量难以控制药品质量。就中药指纹图谱而言,也存在着指纹图谱与药效相脱节的问题。所谓关联度,是指两个系统或两个因素间关联性大小的量度。关联度描述了系统发展过程中因素间相对变化的情况。如果两者在发展过程中相对变化基本一致,则认为两者关联度大;反之,两者关联度小。
(4)人工神经网络
随着模式识别理论的发展,人工神经网络的实践也得到了迅速的提高,在诸多领域都有广泛应用。1990年以来,人工神经网络在中药研究领域逐渐得到了应用。与经典模式识别相比,神经网络法更接近人脑思维过程,具有自组织性和容错性的优点。神经网络的结构和学习算法已有很多种,在中药指纹图谱中用到的主要有BP(反向误差传播),自适应神经网络(ART),自适应线性机(MBL)及模糊神经网络(FANN)。
实现指纹图谱知识化的方法还包括峰重叠法、夹角法、决策树,遗传算法及近邻算法等。近来又出现了几种相似度计算的方法。将从药材、中间体直至最终产品的大量指纹图谱汇集成数据库,采用数学方法比对等,就能确定各个峰之间的相关性,从而做到对整个生产过程实现“全过程质量管理”,而对基础研究和新药开发,则可实现全过程化学成分群的表征。再加上多维信息(HPLC/PDAD/MS/MS)的指纹图谱,对整个研究而言存在大量信息需要处理,建立指纹图谱智能数据库,就能较好的解决此类问题。当前,中药指纹图谱技术在世界已成为一种发展趋势。首先是美国食品与药品管理局(FDA)允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图。(WHO)在1996年草药评价指导原则中也规定:如果草药的活性成份不明,可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致。欧共体也将色谱指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制。中国专业技术人员对中药指纹图谱进行了较早的研究。例如市药品检验所、、、、陕西中医药研究院等科研单位均已从不同角度、不同层面对中药指纹图谱技术作了深入研究,有些技术已在实践中得到了应用。
中药指纹图谱技术是符合及现状的较好的质量控制技术。因为它并不需要详细了解药物的具体活性成份信息,只需要了解个别指标性活性组分信息,以指标性成份峰作为标记,结合非指标成份进行比对,用来综合评价药物质量,既符合中医药理论的整体观点,也满足了对中药质量的可控、保证其疗效的要求。
运用中药指纹图谱和指标成份定量相结合的方式,既可以完善表述中药的整体性特征,又别于西药单一成份定量的质量控制模式,要根据中国的国情,建立自己的中药质量控制体系,评价体系,尽快建立一支高水准、高素质的科研院所和专业技术队伍,使中药指纹图谱技术得以推广和应用。
中药指纹图谱是用多学科交叉、综合技术手段对复杂物质组成体系,质量稳定性进行评价的检测方法。又是分析科学、中药学、分离科学以及化学、生物信息学等二级学科交叉,综合应用研究的结果,是中药现代质量标准体系的核心技术之一,又是解决药品质量控制和监督这一图谱关键问题而采取的一种方法。通过相似性和相关性比对,发展质量变异和缺陷,从而全面特异地把握住中药的质量命脉。又为中药新药研发带来了一种崭新的研究模式,从整体综合的角度把握住了药物多靶点作用及针对性,为新药发现和快速筛选提供了思路和方法。
中药指纹图谱技术主要体现了信息获取、信息处理、信息挖掘三方面的内容。具体的讲,就是从中药物质基础的角度出发,运用现代分离分析科学的手段,获取中药化学指纹图谱。结合药效研究和相关物质成份的分离鉴定,经效谱关系研究,获取中药药效组分指纹图谱,并将已取得的指纹图谱用于中药材,中间体和中药复方制剂的质量控制,以及创新药物研究的实践中,最终解决中药质量评价的科学性和关键问题;解决制约中药发展,走向国际市场的瓶颈问题。
中药指纹图谱质控技术又与GAP基地建设,SOP质量管理息息相关。中药生产标准化是中药产业现代化发展的基础和关键,而中药指纹图谱技术又是中药现代化建设的主要技术手段之一,对中药“安全、有效和质量可控”,保证物种的延续,遗传的稳定性,品种的地道性和药用价值起着至关重要的作用。在实际应用中,中药指纹图谱还面临许多问题,主要有四点:一是中药来源的混乱无序,指纹图谱研究首先需要解决这个源头问题。中药材作为一种天然产物,受品种、产地、生长环境、种植管理、采收期、炮制加工方法等多种因素影响,难以控制,不同药材其指纹图谱有一定的差异,不利于指纹图谱的应用。因此在制定标准指纹图谱时,所选取的药材来源及成药的工艺应相对稳定,有足够的代表性,同时保证质量,才能保持标准指纹图谱的先进性和代表性;二是新技术的应用还不够前沿,对于中药这样一个复杂体系,需要解决分离与检测两大问题,而采用单一分离模式勉为其难,采用传统的检测手段或单一联用技术也易丢失大量信息;三是由于实验室条件,仪器设备的不同造成指纹图谱差异,从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、规范化程度不够,影响实验室之间的重现性,难以推广。应在实验条件和仪器进行规范的条件下建立“标准图谱”;四是对大量信息的化学计量处理方法还不够完善,指纹图谱的特征性不够明确具体,指纹图谱与药理作用的相关性缺乏研究。在药理方面,隋因等用血清指纹图谱研究红花对豚鼠离体心脏的作用,为研究中药复方有效化学成分与药理学之间的联系,提供了思路。[2]随着现代分析技术的发展,指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式。它能从原药材的栽培、引种,中成药生产工艺的规范与优化,到产品质量标准的制定提供全方位的质量保证。近年来国外对草药产品的质量评价也在提倡指纹图谱[1,2],随着各种分析技术的创新和提高以及计算机应用技术的不断发展,世界各国对天然药物的了解和研究在不断深入,中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势,其研究的方法和技术更趋成熟完善,成为国际公认的控制中药和天然药质量最有效的方法和手段。日本汉方药在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量[3]。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制,美国食品药品管理局允许草药保健品申报资料时提供色谱指纹图。世界卫生组织在 1996 年草药评价指导原则中也规定:如果草药的活性成分不明,可以提供色谱指纹图以证明产品质量的一致性。在英国、印度、加拿大等国家在植物药的研究中,也对指纹图谱十分重视。在许多国家的药典中,色谱指纹图谱已成为主要的分离分析方法。而我国药典的中药部分,这一分析技术还未占主导地位。在医药科技“十五”计划中,重点提出解决中药材质量规范化问题。2000年国家药品监督管理局颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》,要求中药注射剂必须进行指纹图谱的研究,并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究,从而促进了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。而国外许多研究机构对中药指纹图谱的研究主要为建立指纹图谱与药效的相关性研究,是以中药理论和新药开发研究体系为主的模式。我国对中药指纹图谱的研究尚处于初级阶段,与发达国家相比有一定差距。目前主要为使用各种方法建立中药材及制剂的指纹图谱,以及对相应信息进行数字化处理,使其能够评价和控制中药材及制剂的质量。[3]
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