cell signaling technology(CST)常见问题回答_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
cell signaling technology(CST)常见问题回答
上传于||暂无简介
阅读已结束，如果下载本文需要使用0下载券
想免费下载更多文档？
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
酶免疫细胞化学染色操作指南
酶免疫细胞化学染色操作指南
来源：互联网
点击次数：1726
一、材料和试剂1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。4、0.01M
PBS5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20）6、AEC底物（1）底物缓冲液（20X） PH 4.6醋酸（分子量60.6）
30.6mlTriton X-100醋酸钠 3H2O（分子量136.1）66.68克加蒸馏水到960ml，调pH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml。（2）AEC（20X）AEC
15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73.10中）（3）0.6% H2O2（20X）临用时，（1）（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。7、DAB（即DAB-4HCL）（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）（2）1M Tris（20X），用HCl调PH到7.4（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。溶解后（可加热到50℃），加水合氯醛50克（水合氯醛Chloral Hyclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或400C保存。8、苏木素复染液苏木素
1000ml9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。10、3% H2O2：30% H2O21份，加9份双蒸水，临用时配。11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板12、封片液：1克明胶，溶于30ml 35℃水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断）1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或37℃ 10-15分钟，使恢复温度。2、加3% H2O2，细胞片20ul/孔，培养板100ul/孔，使充分覆盖住细胞。3、室温10分钟后，甩掉 H2O2，用PBS轻轻淋洗2分钟。用滤纸吸干细胞周围水份，96孔在滤水纸上扣干，但注意保持细胞湿润。三、封闭细胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），细胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔，置37℃孵育30分钟后甩掉封闭液，不洗。四、免疫化学染色1、分别加一抗和所有对照一抗，细胞法10-20ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分覆盖细胞。37℃1小时或4℃冰箱过夜；2、弃去一抗，如为细胞涂片用PBST轻轻简单淋洗1次后，浸于100 mL含PBST洗杯，漂洗（最好在慢速摇床上）3-5分钟，转入第二杯PBS（100 ml），如上法漂洗3-5分钟。擦干细胞片周围水分，96孔板则倒掉一抗后，每孔加满PBST在摇床上摇洗3-5分钟后倒掉，在滤纸上扣干，但保持细胞湿润，反复3-4次；3、加SP试剂（SP法，即放大法）（1）加已优选好的浓度的Biotin标记二抗，细胞片10ul/孔，细胞板50ul/孔，使充分复盖细胞。37℃孵育30分钟；（2）按免疫化学染色“2”所述方法洗涤和擦干；（3）加已优选好浓度的SP试剂，用量同“（1）”，37℃孵育30分钟后按免疫化学染色“2”法洗涤及擦干；4、间接法加二抗（不放大法）方法同SP法，但不用Biotin标记二抗，而改用HRP直接标记二抗。并省略（3）步骤；5、加底物显色（1）加足量的AEC显色液，充分覆盖细胞层，细胞玻片20ul/孔，细胞培养板50ul/孔，置于37℃恒温箱孵育5-10分钟，一般在显微镜下根据结果颜色的呈现情况掌握染色时间，以得到满意的结果（阳性对照显色程度为“+++” ），用自来水即可终止反应；（2）复染：苏木素染液（使用时间最好不超过两个月）加苏木素复染液1-2滴，1分钟左右，在自来水龙头下轻轻冲洗掉苏木素，再浸于PBS中约30秒钟返蓝，最后在蒸馏水中漂洗。6、封片洗后细胞片擦去周围水分，滴加1滴甘油—明胶封片液，加盖玻片，除去气泡，用指甲油或树胶封固玻片。五、结果判断阳性——诱导细胞有10%-30%显红色，强度不一，未诱导阳性细胞（1-30%）；阴性——诱导和未诱导BCBL-1细胞完全不显色（排除边缘效应）六、注意事项1、一抗、二抗的稀释采用1% BSA/PBS，Sterptavidin-HRP的稀释采用PBS；2、整个反应过程在湿盒中进行（细胞片）；3、洗涤时应使用染色缸（细胞片）；4、对照系统，必须要做的对照系统：阳性对照：标准一抗，阳性血清，阳性上清；阴性对照：（1）阴性一抗对照：小鼠免疫前血清、测上清时用原克隆上清液；（2）阴性抗原细胞对照：未感染病毒的细胞，每个待测及对照均须做阴性细胞对照：空白对照：不加一抗，用1%BSA替代；无关对照：与本项目无的第一抗体。
相关实验方法
本网站所有注明“来源：丁香园”的文字、图片和音视频资料，版权均属于丁香园所有，非经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，授权转载时须注明“来源：丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系，我们将立即进行删除处理。
试剂（盒）
丁香通采购热线：400-
Copyright (C)
DXY All Rights Reserved.关于Brdu标记细胞增殖实验(细胞增殖,单克隆抗体,实验步骤,细胞免疫荧光) - 免疫实验 - 生物秀
标题: 关于Brdu标记细胞增殖实验(细胞增殖,单克隆抗体,实验步骤,细胞免疫荧光)
摘要: [关于Brdu标记细胞增殖实验(细胞增殖,单克隆抗体,实验步骤,细胞免疫荧光)] 各位大侠： 小弟最近才开始做用brdu标记检测细胞增殖的实验，买的是CST的抗brdu的单克隆抗体，所有的操作都按照CST官方网站提供的细胞免疫荧光实验步骤。可是我做出来的结果却是基本上每个细胞都着色了（brdu标记2小时），理论上这是不可能的呀，不知道是怎么回事，非常纠结，请各位高手指点啊！多谢！ 下图是我做的结果。 关键词:[细胞增殖 单克隆抗体 细胞免疫荧光 实验步骤]……
各位大侠： 小弟最近才开始做用brdu标记检测细胞增殖的实验，买的是CST的抗brdu的单克隆，所有的操作都按照CST官方网站提供的细胞免疫荧光实验步骤。可是我做出来的结果却是基本上每个细胞都着色了（brdu标记2小时），理论上这是不可能的呀，不知道是怎么回事，非常纠结，请各位高手指点啊！多谢！ 下图是我做的结果。
回复LZ是染的cell line吗？单从这张图片应该不能说明每个细胞都染上了啊。建议和核染图片merge，用共定位才好确认BrdU/total 的 ％。如果是cell line的话，个人认为高的增殖率理论上是可以解释的。回复同意“thanks4share”朋友观点。回复看了楼上的回复，茅塞顿开！多谢！回复1、建议核染，确认染色成功；2、测试对照，即不加BrdU，只加一抗，的结果；3、更换EdU方法试一试，确认BrdU方法有效性。从你的结果来看，确认像特异性染色，不过还是证实一下比较好。要像下图这样，才能说明增殖。B1: B2: /sitecn/Product.aspx?id=92回复发重复了回复这是我用DAPI染的图片，能帮忙分析一下吗？回复有同一视野标记荧光和DAPI两个通道的荧光照片吗？两张照片重叠了才能比较回复这是重叠图片，劳驾分析一下，谢谢~回复我觉得 95%可能是背景
非特异性染色回复这是重叠图片，劳驾分析一下，谢谢~回复这是我染的图片，大家有兴趣的帮忙看一下~回复这个图
好像还好，有深有浅，但仔细一看
全染色了难道全增殖了？这个需要你说明一下？
相关热词：
..........
生物秀是目前国内最具影响力的生物医药门户网站之一，致力于IT技术和BT的跨界融合以及生物医药领域前沿技术和成功商业模式的传播。为生物医药领域研究人员和企业提供最具价值的行业资讯、专业技术、学术交流平台、会议会展、电子商务和求职招聘等一站式服务。
官方微信号：shengwuxiu
电话：021-细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
　原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法
　原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法
来源：互联网
点击次数：110
第四节　原位杂交组织化学与免疫细胞化学结合法
原位杂交组化（ISHH）与免疫组织化学（IHC）结合法是先后用ISHH和IHC在同一切片或两个相邻切片进行染色，这样就可以同一细胞中显示出某种mRNA和相应的蛋白、多肽或其它抗原，从而可更好地了解某一基因的转录和蛋白、多肽合成的动力学。ISHH与IHC结合法可以在相邻切片上分别进行ISHH和IHC染色，也可先后在同一切片上进行ISHH和IHC染色。前者可使ISHH和IHC染色都获得理想的结果，易成功，但易产生空间误差和样本误差。在同一切片上进行结合法可克服这些误差，但第一次染色总要或多或少地影响第二次染色，使第二次染色不十分理想。由于m RNA易被染色过程中污染有少量RNase的液体所降解，因而在实践中往往首先进行原位杂交组化染色，这种次序使结合法易成功。但在操作方法中应注意减少生物活性肽或蛋白的丢失，如在杂交后冲洗中适当减低漂洗温度。
一、同位素原位杂交组化与免疫组化PAP法的联合程序
（1）切片入PBS冲洗5min，最好是将切片漂洗于灭菌器皿中。
（2）0.1mol/L 甘氨酸PBs 5min。
（3）0.4%Triton X-100 PBS 15min。
（4）1μg/ml蛋白酶K，37℃保温30min。
（5）4%多聚甲醛PBS固定5min 。
（6）PBS冲洗2×3min。
（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L 三乙醇胺配）10min。
（8）2×SSC冲洗10min。
　　（9）杂交：如是cDNA探针用前需进行变性处理，载片法时将切片在空气中晾干，加含探针的杂交液10μl于切片上，盖上22×22mm的硅化盖片或相当大小看蜡膜，
H标记探针每10μl杂交液含1×10
S标记探针每10μl杂交液含5×10
cpm探针；如是漂浮切片，则用灭菌吸水纸将切片水份尽量吸干，然后入杂交液，探针浓度和载片法一样。入杂交液后43℃保温12～16h。
（10）4×SSc 37℃冲洗10～30min。
（11）2×SSC（如为RNA探针则含20μg/ml RNase）37℃冲洗30min。
（12）1×SSC和0.1×SSc 37℃分别冲洗30min。
（13）PBS冲洗2×5min。（转录ISHH）
　　（14）0.5%H
PBS室温30min。
（15）1%BSA 37℃，30min 。
（16）第一抗体，4℃孵育16～24h。
（17）PBS冲洗4×5min。
（18）第二抗体37℃，1h。
（19）PBS冲洗3×5min。
（20）兔PAp 37℃，1h 。
（21）PBS冲洗3×5min。
　　（22）DAB显色液5～10min（DAB显色液：0.05%DAB + 0.03% H
PBS液配）。
（23）PBS冲洗3×5min。如是漂浮切片则将其贴于涂有粘附剂的载片上，晾干。
（24）切片入70%，85%，95%和2个100%酒精脱水，空气干燥。
（25）在暗室涂布乳胶（乳胶配制：乳胶原液：0.6mol/L醋酸胺=1：1），晾干，装入自显影暗盒。
　　（26）4℃曝光：
H标记探针4～8周，
S标记探针1～4周，
P标记探针7～10天。
　　（27）D
显影液，20℃显影5～10min。
（28）自来水冲洗数秒。
　　（29）F
坚膜定影液10min。
（30）自来水冲洗15min。
（31）切片温箱烤干，脱水，透明，封片。
结果：蛋白或多肽免疫反应阳性细胞为棕色胞质，而其相应mRNA为黑色银颗粒聚集。
二、非同位素原位杂交组化与免疫组化联合法
非同位素标记物很多例如：生物素（biotin），地高辛（Digoxigenin），汞（mercury），溴（bromine）和碱性磷酸酶等，其中目前应用最多的是生物素和地高辛。将此法与免疫组化PAP法或ABC法联合使用，能成功地显示一些神经肽mRNA和神经肽的共存与共同分布。向正华等发现碱性磷酸酶抗地高辛抗体是经木瓜蛋白酶处理的，只有抗体的Fab段没有Fc段，而免疫细胞化学（Immunocytochemistry,ICC）所应用的抗体既有Fab段，又有Fc段。由于抗体的这一特性可在ISHH和ICC抗体孵育时将检测核酸的抗地高辛抗体Fab段与检测蛋白、多肽的兔抗血清混合在一起，一同孵育切片，这样可明显缩短ISHH和ICC结合法的实验周期，同时还可以减少实验过程中对ICC检测的蛋白、多肽的损害，使结合法易成功。为什么两种抗体可同时混合孵育切片，这是因为抗地高辛抗体只有Fab段，而没有Fc段。我们知道抗体的抗原决定簇在Fc段，因此第二抗体与第一抗体的结合是第二抗体的Fab与第一抗体的Fc，所以第一抗体如果只有Fab段没有Fc段，那么第二抗体就无法与一抗结合。因此实验中将二种抗体混合孵育切片而不会产生交叉结合。以下为此法的原理图（图20-5）。
图20-5　原位杂交细胞化学与免疫细胞化学结合法
此种ISHH与ICC联合法稳定，实验周期短，蓝色与棕色反差强，是目前较好的ISHH与ICC结合法。详细程序如下：
（1）将切片漂浮于能经受高压灭菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2冲洗3×5min。
（2）0.1mol/L甘氨酸PBS冲洗5min。
（3）0.4% Triton X-100 PBS 15min。
（4）1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris ?HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保温30min。
（5）4%多聚甲醛PBs 5min。
（6）PBS冲洗2×min。
（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配）10min。
（8）2×SSC冲洗10min。
（9）将切片用灭菌吸水纸吸干，然后入杂交液。核酸探针浓度为0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠脑冠状切片15μl杂交液足够。43℃保温12～16h。
（10）4×SSc 37℃冲洗30min。
（11）2×SSC（含RNasea 20μg/ml）37℃保温30min。
（12）1×SSC和0.5×SSc 37℃分别冲洗30min。
（13）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（14）0.5%H
PBS室温20min。
（15）0.05mol/l PBS 冲洗2×5min。
（16）碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体（Fab）与抗蛋白或多肽等抗体混合液，前者一般1：1000稀释，后者则因抗体而异。稀释液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。
（17）0.05mol/l PBS冲洗4×5min。
（18）二抗（1：100～1：200）37℃保温1h。
（19）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
（20）PAP（1：200～1：400）37℃保温1h。
（21）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
　　（22）DAB显色液（0.05%DAB + 0.03% H
,0.05mol/L PBS pH7.2配）显色5～10min。
（23）0.05mol/l PBS冲洗3×5min。
相关实验方法
本网站所有注明“来源：丁香园”的文字、图片和音视频资料，版权均属于丁香园所有，非经授权，任何媒体、网站或个人不得转载，授权转载时须注明“来源：丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系，我们将立即进行删除处理。
试剂（盒）
丁香通采购热线：400-
Copyright (C)
DXY All Rights Reserved.如何做好免疫细胞化学实验_百度知道