肺炎链球菌免疫PCR试剂盒_百度文库
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肺炎链球菌免疫PCR试剂盒
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你可能喜欢肺炎链球菌疫苗的接种反应及禁忌_百度知道百度拇指医生
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验证码输入错误，请重新输入优秀研究生学位论文题录展示肺炎链球菌蛋白疫苗ClpP免疫保护效果的实验研究专　业: 临床检验诊断学关键词: 肺炎链球菌 蛋白疫苗 ClpP 免疫保护分类号: R563.1　
R378.12形　态: 共 69 页　约 45,195 个字　约 2.162 M内容阅　读: 内容摘要目的：
肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae，S.pn）是肺炎、脑膜炎和中耳炎的主要病因，也是引起全世界范围内婴幼儿、老年人和免疫缺陷个体疾病的主要病原菌。随着耐药菌株的不断发现，疫苗在其感染防治中的作用越来越重要。目前，所用的主要是23价肺炎多糖疫苗和7价结合疫苗，前者覆盖的血清型有限而且不是T细胞依赖性的，对免疫系统发育不完善的2岁以下小孩和老年人的保护性弱；后者存在荚膜血清型转换和载体携带的荚膜多糖血清型数量有限以及在肺炎高发人群中的保护作用小等问题，并且生产成本很高，不适合在发展中国家大量使用。
S.pn根据荚膜分为90多个血清型，开发对所有血清型S.pn都起抵抗作用的高保守性蛋白疫苗是目前Spn疫苗的发展方向。近年来发现的S.pn蛋白质侯选疫苗ClpP（caseinolytic protease P，ClpP）是ATP依赖的丝氨酸蛋白水解酶，其在S.pn的生存、致病和入血过程中起着重要的作用，针对其靶点的疫苗或抗生素越来越显示出其潜在的价值。本研究旨在探讨ClpP在不同S.pn菌株中的基因序列保守性、在不同血清型S.pn中表达情况，并进一步验证含有ClpP活性成分的疫苗能否抵抗不同型别的肺炎链球菌的侵袭性感染，以明确ClpP蛋白疫苗的保护范围，为自主开发S.pn蛋白疫苗奠定基础。
1.检测12株S.pn细菌中的ClpP基因以TIGR4型S.pn的ClpP基因序列设计引物，分别以12株不同血清型Spn的基因组DNA为模板，对ClpP基因进行聚合酶链反应（PCR）扩增、胶回收产物与PMD-18克隆载体连接后进行测序，利用DNAssist软件，将12个重组克隆质粒双向测序的结果及预测的氨基酸序列与Gene Bank数据库对已公布的TIGR4肺炎链球菌全基因组序列进行相似性分析。
2.Western Blot检测ClpP蛋白的表达将12株S.pn从C+Y培养基中收获后，用PBS洗3次，用1×上样buffer处理，再于100℃水浴5 min。全菌裂解物经SDS-PAGE电泳分离后转膜。以anti-ClpP多克隆抗体为一抗（1：400），羊抗鼠HRP-IgG为二抗（1：5000），DAB为显色底物，Western Blot检测菌体中ClpP蛋白的表达。与此同时，以金黄色葡萄球菌作为对照。
3.主动免疫保护实验将含有重组质粒pET32a（+）\ClpP工程菌BL21（DE3）经IPTG诱导后表达ClpP蛋白，经纯化后与铝佐剂混合后经腹腔注射免疫小鼠，而对照小鼠则用PBS与铝佐剂混合后进行免疫。免疫程序：分别于0天、14天、28天将重组蛋白与铝佐剂（Inject Alum购于Pierce）1:1混合后经腹腔注射免疫组小鼠；同时用PBS与铝佐剂1:1混合后经腹腔注射对照组小鼠，每只200μl。初次免疫5周后用ELISA法测小鼠针对ClpP蛋白的抗体免疫应答水平，末次免疫2周后用12个型别S.pn攻击，监测其生存时间。
4.抗体被动免疫保护实验在攻击BALB\c小鼠之前，兔抗体被纯化。12株肺炎链球菌在C+Y培养基中培养至对数生长期，每一株细菌菌液各2ml分别与anti-ClpP特异抗体和非特异血清混合，于4℃过夜。次日两种血清处理的10μl菌液置于玻片上用显微镜下观察。剩下的菌液分别攻击经过随机分组的小鼠，各12只，每只小鼠经腹腔接受100μl的菌液，连续检测小鼠的生存状态至第7天，各组小鼠的半数生存时间用Mann-Whitney U进行统计学分析，各组小鼠的生存率用Fisher精确统计学方法进行分析；
1.以12个血清型Spn DNA为模板用编码ClpP蛋白基因的特异性引物进行PCR扩增，结果12个PCR产物电泳后出现大小一致，单一的条带。将这些PCR产物与PMD-18T进行亚克隆后，经双向测序不同株的ClpP基因编码区大小与TIGR4菌株中ClpP基因一样，均为591 bp，基因序列一致性超过99%。由于遗传密码子的简并性，预测的氨基酸序列一致性则为99.5%以上。
2.利用Western Blot方法检测12株不同血清型S.pn的ClpP蛋白的表达。S.pn全菌裂解物经电泳分离后，与制备的anti-ClpP血清反应，12型Spn全菌裂解物均在约21kD的位置出现特异性反应条带，而阴性对照未见反应条带出现。该结果提示了12个型别Spn中均有ClpP蛋白抗原的表达。
3.Trx-ClpP融合蛋白经腹腔免疫BALB\c小鼠产生高滴度的抗体后，末次免疫2周后，12个型别S.pn经腹腔感染小鼠后。各组小鼠生存时间和生存率经统计学分析后，免疫组小鼠的中位生存时间与对照组小鼠中位生存时间有统计学意义（P<0.05），免疫组小鼠的中位生存时间明显延长，两者生存率相比也具有显著的统计学意义（P<0.05）。该结果表明ClpP融合蛋白免疫小鼠后可产生针对多个血清型S.pn的保护性免疫。另外，我们以免疫后14天的间隔时间取小鼠血用ELISA法测定anti-ClpP的效价，抗体效价至少维持了98天。
4.12株S.pn能与anti-ClpP混合后能出现凝集，与非特异血清混合无凝集现象出现。用anti-ClpP特异抗体处理的S.pn攻击小鼠，与非特异血清处理的同株S.pn攻击小鼠的生存时间相比较，中位生存时间明显延长，观察期末小鼠的生存率也明显提高，具有显著的统计学意义。
1.不同血清型肺炎链球菌的ClpP的DNA序列和蛋白序列高度保守。
2.不同血清型肺炎链球菌ClpP基因编码的蛋白均有表达。
3.用含有ClpP活性成分的疫苗免疫小鼠后，小鼠产生了高滴度的抗体，并且小鼠能抵抗不同型别的S.pn的侵袭性感染，进一步验证了ClpP蛋白疫苗的保护范围不受血清型限制的。而且小鼠体内anti-ClpP抗体滴度水平维持时间长。
4.抗ClpP的多克隆血清能够与完整的S.pn进行结合，并且能够保护BALB\C小鼠抵抗12株S.pn的致死剂量的攻击。免疫保护全文目录文摘英文文摘论文说明：英汉缩略语名词对照前言第一部分
12株肺炎链球菌ClpP的基因序列分析和表达鉴定1实验材料1.1主要试剂和引物1.2菌种和质粒1.3主要仪器1.4溶液的制备2实验方法2.1
12株肺炎链球菌基因组DNA的提取2.2构建TA克隆质粒2.3 肺炎链球菌全菌裂解液的准备:2.4免疫斑点试验(ELISA BLOT)2.5肺炎链球菌的菌体蛋白免疫印迹实验(Western-blot)3实验结果3.1
目的基因PCR产物3.2TA克隆载体的构建与鉴定3.3测序结果与序列比对3.4肺炎链球菌Western Blot4讨论小结第二部分
重组蛋白的诱导表达及重组蛋白的主动免疫保护实验研究1实验材料1.1实验动物1.2抗原和菌株1.3主要试剂及溶液的配置1.4主要仪器2实验方法2.1重组质粒pET32a(+)/ClpP测序:2.2重组ClpP蛋白(rClpP)在体外的大量表达2.3 rClpP的纯化(整个过程低温操作)2.4 rClpP的定量(Bradford检测法):2.5 rClpP抗原液的制备2.6 rClpP免疫BALB/c 小鼠2.7免疫小鼠血清的采集2.8免疫小鼠血清中特异性抗体的检测(ELISA法)2.9免疫攻毒保护实验2.10观察rClpP诱导小鼠所产生的抗体效价变化2.11统计学分析3实验结果3.1
rClpP蛋白的诱导表达与纯化3.2 ELISA测抗体效价3.3
rClpP蛋白主动免疫保护作用的评价3.4小鼠体内抗rClpP抗体效价的变化趋势4讨论小结第三部分
重组蛋白ClpP多克隆抗体的制备及抗体的被动免疫保护效果的评价1实验材料:2实验方法3实验结果3.1制备兔多克隆血清效价3.2细菌凝集实验结果3.3多克隆抗体血清的被动保护实验结果4 讨论小结全文总结全文参考文献综述：肺炎链球菌ClpP蛋白酶结构特点及在致病方面作用相似论文,83页,R563.1
R392.7,56页,R563.1
R392.7,108页,R563.1,67页,R563.1,57页,R563.1,51页,R563.1,43页,R563.105 R969,53页,R563.1 R366 R-332,80页,R563.1,79页,R563.8,86页,R563 R379 R36,60页,R563.8 R394-33,77页,R563.8 R392.11,52页,R563 R972.4,77页,R563,70页,R563,76页,R378,96页,R378
R446,88页,R378.911 R520.4,61页,R378.11中图分类:
> <font color=@3.1 > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 肺疾病其他分类:
> <font color=@8.12 > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 病原细菌
& 2012 book.免疫系统对动物的生存与健康有何意义
免疫系统目录【解释】【皮肤与粘膜】【血脑屏障】【胎盘屏障】【免疫系统具有以下的功能】【免疫学历史】　　人体内有一个免疫系统,它是人体抵御病原菌侵犯最重要的保卫系统.这个系统由免疫器官（骨髓、胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃体、小肠集合淋巴结、阑尾等）、免疫细胞（淋巴细胞、单核吞噬细胞、中性粒细胞、嗜碱粒细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞、血小板等）,以及免疫分子（补体、免疫球蛋白、干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子等细胞因子等）组成.　　免疫系统是机体防卫病原体入侵最有效的武器,但其功能的亢进会对自身器官或组织产生伤害.在很多由于自身免疫引起的疾病中,CD4+ T细胞起着重要的作用.[编辑本段]【解释】　　免疫系统（immune system）是机体保护自身的防御性结构,主要由淋巴器官（胸腺、淋巴结、脾、扁桃体）、其它器官内的淋巴组织和全身各处的淋巴细胞、抗原呈递细胞等组成；广义上也包括血液中其它白细胞及结缔组织中的浆细胞和肥大细胞.构成免疫系统的核心成分是淋巴细胞,它使免疫系统具备识别能力和记忆能力.淋巴细胞经血液和淋巴周游全身,从一处的淋巴器官或淋巴组织至另一处的淋巴器官或淋巴组织,使分散各处的淋巴器官和淋巴组织连成一个功能整体.免疫系统是生物在长期进化中与各种致病因子的不断斗争中逐渐形成的,在个体发育中也需抗原的刺激才能发育完善.　　机体执行免疫功能的器官、组织、 细胞 和分子的总称.器官包括 胸腺 、法氏囊或囊类同器官、 淋巴结 、脾脏、扁桃体；组织指机体内(特别是消化道、 呼吸道 粘膜内)存在的许多无被膜的淋巴组织；细胞主要指 淋巴细胞 、单核吞噬细胞、粒细胞；分子主要指 免疫球蛋白 、补体、淋巴因子以及特异性和非特异性辅导因子、抑制因子等参与机体免疫应答的物质.免疫系统各组分功能的正常是维持机体免疫功能相对稳定的保证,任何组分的缺陷或功能的亢进都会给机体带来损害.　　免疫系统各组分广布全身,错综复杂,特别是免疫细胞和免疫分子在机体内不断地产生、循环和更新.免疫系统具有高度的辨别力,能精确识别自己和非己物质,以维持机体的相对稳定性；同时还能接受、传递、扩大、储存和记忆有关免疫的信息,针对免疫信息发生正和负的应答并不断调整其应答性.因此,免疫系统在功能上与 神经系统 和 内分泌系统 有许多相似之处.然而,免疫系统功能的失调也会对人体极为不利： 人体的识别能力异常容易导致过敏现象的发生（使用某种食物、注射药物出现过敏反应,甚至导致休克）,反之则会引起反复感染；人体的自我稳定能力异常,会使免疫系统对自身的细胞作出反应,引发自身免疫疾病,诸如风湿性关节炎、风湿性心脏病等；人体的免疫监视的功能降低,如同失去了一位“警卫员”,使肿瘤有了可乘之机.由此可见,人体免疫系统对人类的健康起着举足轻重的作用,如果它的功能不稳定,人类很有可能会被病毒、细菌这些病原体侵害、折磨.　　骨髓是主要的造血器官,是各类血细胞的发源地.胚胎期血细胞生成场所最早在卵黄囊,后移至胚肝和胚脾,最后由骨髓替代.成年期造血功能主要发生在胸骨、脊椎、骼骨和肋骨等扁骨的红髓.血细胞的祖先是多能干细胞,继而增殖分化为淋巴系和髓系干细胞,再进一步增殖分化为单能干细胞或前体细胞进入血流.禽类的前体B细胞进入法氏囊成熟,哺乳类包括人类的前体B细胞仍继续留在骨髓内直至成熟.　　胸腺是T细胞分化和成熟的场所,因而T细胞亦称胸腺依赖性T淋巴细胞.骨髓中的T淋巴系前体细胞（前体T细胞）经血循环进入胸腺后,也称胸腺细胞.它们在胸腺激素影响下,最终分化为成熟T细胞,随后释放入血液循环中.　　成熟T细胞和B细胞通过血液循环到达淋巴结、脾脏和扁桃体等组织或器官,它们分别定居在固定的部位,成为机体的常驻警卫部队.若遇到病原体等抗原物质入侵,就能发生特异性免疫应答反应,产生免疫物质与之对抗.我们身体某个部位发生创伤炎症时,该部位附近的淋巴结便会肿大,这就是这些部位增加了“警卫部队”并在和病原体作战.　　在感染过程中,各免疫器官、组织、细胞和分子间互相协作、互相制约、密切配合,共同完成复杂的免疫防御功能.病原体侵入人体后,首先遇到的是天然免疫功能的抵御.一般经7-10天,产生了获得性免疫；然后两者配合,共同杀灭病原体.　　天然免疫是人类在长期的种系发育和进化过程中,逐渐建立起来的防御病原体的一系列功能.其特点是人人生来就有,并能遗传给下一代,而且不同种的生物免疫系统有差异.例如人不会得鸡霍乱也不会被犬瘟病毒感染；同样,动物不会患麻疹.　　天然免疫与人体的组织结构和生理功能有密切联系.[编辑本段]【皮肤与粘膜】　　人体与外界环境接触的表面,覆盖着一层完整的皮肤和粘膜.皮肤由多层扁平细胞组成,能阻挡病原体的穿越,只有当皮肤损伤时,病原体才能侵入.粘膜仅有单层柱状细胞,机械性阻挡作用不如皮肤,但粘膜有多种附件和分泌液.例如呼吸道粘膜上皮细胞的纤毛运动、口腔唾液的吞咽和肠蠕动等,可将停留在粘膜表面的病原体驱赶出体外.当宿主受寒冷空气或有害气体等刺激,上呼吸道粘膜屏障受损伤时,就易患气管炎、支气管炎和肺炎等.　　皮肤和粘膜能分泌多种杀菌灭毒物质.例如皮肤的汗腺能分泌乳酸使汗液呈酸性（pH5.2-5.8）,不利于细菌生长.皮脂腺分泌的脂肪酸,有杀细菌和真菌作用.不同部位的粘膜腺体能分泌溶菌酶、胃酸、蛋白酶等各种杀菌物质.　　人体的正常菌群也有拮抗病原体的作用.例如口腔中的唾液链球菌产生的过氧化氢能杀死脑膜炎奈瑟氏菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌等；咽喉部的甲型链球菌能抑制肺炎链球菌生长等.[编辑本段]【血脑屏障】　　血脑屏障不是一个特殊的解剖学上专有的结构,一般认为由软脑膜、脉络丝、脑血管和星状胶质细胞等组成.育不够完善,所以容易发生脑膜炎、脑炎等疾患.
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