黄红艳（ 靖江市人民医院柏木分院检验科 江苏泰州 2 1 4 5 0 0 ）
【摘要】线粒体一直被认为是细胞能量生产和代谢工厂，正常的线粒体功能是维持器官的正常功能和细胞稳定的重要因素之一，对于需要高能量代谢的骨骼肌和心肌尤为重要。线粒体相关疾病的形成及其分子生物学诊断需要临床和实验室的检测。线粒体疾病的基因双重性，多器官系统特征以及广泛的可识别表型是目前临床诊断所面临的挑战。为了克服这些临床诊断障碍，实验室对线粒体多方面的评价可以提供相对充足的证据，包括血液学，组织化学分析手段，神经影像分析，刺激实验检测，组织和细胞的酶学分析以及DNA检测(Mancuso M., 2009)。本文就线粒体的功能性评价方法作以下综述，为临床线粒体相关疾病的诊断提供可行的方法学手段。
【关键词】线粒体 呼吸链 功能 评价
【中图分类号】R329 【文献标识码】A 【文章编号】（0-02
&&&&&&& 1.活性氧族(Reactive Oxygen Species)的产生在细胞内，线粒体是超氧离子（O2-）和其他活性氧族的主要来源，病理情况下，通过异常的氧化反应，线粒体产生约85%的超氧离子(Boveris and Chance, 1973; Dr?ge, 2002). 在线粒体复合体间的电子转运过程中，约2-5%的离子逃逸并释放O2，导致了O2-在复合体I到复合体I I I中的产生，由于线粒体活性增强或呼吸链的抑制作用，氧离子会显著的增加导致了氧化损伤，这可能是脑神经退行性病变发病的机理之一。活性氧族ROS的生理功能与脑神经元的代谢活性息息相关，过多的ROS会导致线粒体功能异常及神经损伤。例如，在脑缺血和再灌注过程中，细胞间液中过多的ROS会产生氧化应激，氧化平衡被打破，从而导致细胞性的直接或间接的损伤(L e i e t a l.,1998)。因此，检测ROS的产生和分布可以从一方面评价线粒体的功能。
&&&&&&& 目前有很多R O S 的标记物， 如广泛应用的二氢氯荧光素dichlorodihydrofluorescein (LeBel et al.,1992)，及其各种衍生物如二氢溴乙非啶（Het）(Gallop et al., 1984)，和二氢罗丹明dihydrorhodamine(Duganet al., 1995)。细胞膜渗透型二氢二氯荧光素（H2DCFDA）可通过被动转运进入细胞内，一旦其醋酸基团被细胞内酯分解，就可被氧化成具有荧光的二氯荧光素。二氯荧光素对周围环境氧的水平十分敏感，可进一步被氧化而呈现可见光。其羧化类似物H2D C F能够延长在活细胞内的停留时间(Hempel et al.,1999)。而其另一种具有硫醇反应活性的氯甲基团衍生物能够绑定细胞内的硫醇残基而延长在细胞内的停留时间(Kirkland and Franklin,2001)。这些R O S标记物的不足之处是缺乏对R O S的特异性。目前，一种对氧化还原敏感的重组体绿色荧光素已经被应用，它具有两种不同的最大吸收波长，并且这两种吸收波长彼此间互不干扰(Hanson et al., 2004)，以保证对R OS具有更广更稳定的动力学反应性，并可用于实时监测细胞内的氧化还原状态(Cannon and Remington, 2006)。这些重组荧光蛋白的另一个优点是，它们可以被选择性地针对各种细胞器或结构，如线粒体，细胞核和质膜(Dooley et al., 2004)。
&&&&&&& 2.线粒体膜电位的检测
&&&&&&& 线粒体膜电位的产生依赖于线粒体复合物Ⅰ，Ⅲ，和I V呼吸链所产生的线粒体内膜质子梯度。各种各样的荧光团可用于监测线粒体膜电位，最常用的是R h123及其衍生物T M R M. 当R h123能聚集在线粒体内时，能使529n m激发光淬灭，当R h123从线粒体释放进入胞液的时候，能使激发荧光增强(Bahar et al., 2000; Duchen, 1999; Emaus et al., 1986)。 因此，当线粒体膜电位下降的时候，被标记细胞的细胞液荧光将会显著增强。T M R M荧光同样能随着线粒体膜电位的改变而改变。目前的实验表明，R h123的衍生物JC-1对于线粒体膜电位的改变更为敏感,并且在标记JC-1的同时细胞组织的完整性不会被破坏，这也使得JC-1能够应用于免疫组化。值得注意的是，这些细胞膜渗透性染料能够通过所有的脂质体膜，并不仅仅穿过线粒体膜或其他组织，还能穿过质膜，最终染料将大量堆积在线粒体基质(K e r r D S. 2010)。这些淬灭模式检测线粒体的荧光是一种非线性的，因此无法准确量化单个细胞中线粒体膜电位的变化，很难比较线粒体膜电位变化的绝对值，但在组织水平，可以准确测定线粒体膜电位的动力学改变(Scandurra FM, 2010)。因此，染料和线粒体模型的选择取决于实验的目的，例如选择单细胞或离体线粒体。
&&&&&&& 3.NADH和黄素蛋白的自体荧光
&&&&&&& 在线粒体电子链中，NA D+和N A DH是氢离子的载体并与氧化还原反应密切相关。N A D H是细胞质和线粒体氧化还原状态的一个指示剂，而黄素蛋白是酶的辅助因子，也与氧化/还原反应相关(Ma y e v s k y A, 2009)。NADH与FAD的荧光吸收强度与线粒体呼吸链相关(Chance and Williams,1955)。NADH荧光常用于体外特定条件的测定，如扩散性抑制和缺血。最近的报道显示，NADH荧光在脑皮层中动脉的影像可通过CCD镜头捕获(Stronget al., 2000)。目前有很多量化NADH和黄素蛋白的方法，双波长光谱测定法常用于离体线粒体的测定。另外，氧化还原荧光测定法通过摄谱仪的二极管线性分析也被广泛应用于缺血低氧状态下NADH的测定(Gerich et al.,2006; Hepp et al., 2005)。
&&&&&&& 4.线粒体代谢的光测定法
&&&&&&& 线粒体呼吸链的某些元件根据其氧化状态可以吸收不同能量的光，因此量化吸收带光的强度并比较他们的非敏感波长可以监测单个呼吸链复合体的相对活力。与以上的染料测定法相比，这种方法的优点是不存在染料测定时的染料上样量，染料区分，图像漂白等问题，并且这种方法可以直接评价单个呼吸链复合体的功能(Mills and J?bsis, 1972; Streller et al., 2002)，。例如，细胞色素C的光吸收可用于测定组织在不同生理调件下的氧利用率，且光吸收的误差比染料指示剂测定法低很多，从而提高了精准度。
&&&&&&& 5.ATP含量测定
&&&&&&& 线粒体呼吸链为细胞提供了绝大部分的AT P，因此细胞A T P的水平能反映线粒体功能状态。细胞A T P含量的测定有多种光学测定方法，例如基于荧光或吸收测定的核磁共振或高效液相色谱。荧光素或荧光酶AT P检测是最常用也是最灵敏的技术。AT P所依赖的荧光素氧化酶伴随着光子的激发，激发出的光子依靠自身的化学反应发光，而AT P是其限制因子，因此检测生物发光强度可以衡量ATP的含量(Bowers et al., 1993)。另一种ATP检测方法是通过测定己糖激酶与葡萄糖磷酸脱氢酶反应中NA D P的减少量。但是这种检测方法需要组织匀浆，不能动态连续的监测细胞内的AT P水平。第三种光学检测是同过检测细胞内与AT P绑定的Mg2+的浓度。当AT P水解成AD P时，这种绑定会解离，所以M g2+的增加意味着细胞溶质中A T P含量的降低(Dumont M,2011)。以上这些检测方法的应用能使我们进一步了解神经元代谢过程中的质子反应过程。
&&&&&&& 6.线粒体Ca2+的检测
&&&&&&& 线粒体中Ca2+的水平对线粒体的代谢活性和细胞内钙离子平衡的调节起着至关重要的作用。钙离子的动态可以用光学影像来评价，并能反映线粒体的功能。生理情况下，线粒体内维持着低钙水平，尽管线粒体内膜不能自由渗透离子，但钙离子可通过Na+/C a2+交换运出细胞并对抗增加强的电化学梯度。
&&&&&&& 线粒体对钙离子的摄入发挥多种生物学功能。例如，生理条件下的钙离子水平的波动能调节AT P的产量以及激活柠檬酸循环。当线粒体内钙浓度增加时，钙离子的摄入会干扰线粒体功能，激活mPT和细胞死亡信号通路，如细胞凋亡或坏死。钙离子的在线粒体内的堆积同时能导致ROS的生成，线粒体膜电位去极化等(Bindokas et al., 1998; Carriedo et al., 2000)。
&&&&&&& 另外，线粒体钙离子还可通过图像测定。细胞可渗透型罗丹明（R h o d-2）目前是监测线粒体内钙离子浓度最好的标记物。但是选择性装载Rhod-2需要特定的装载条件，因为残留在细胞溶质中的Rhod-2会干扰钙离子水平的监测。此外，还可以用R h o d-2与细胞溶质钙离子的指示剂，如fluo-1,indo-1等组合成双染。双染的优点是细胞溶质中的染料将限制在细胞液中，而不会进入线粒体或内质网，残留的R h o d-2就能从细胞中去除从而降低了检测过程中的干扰。
&&&&&&& 总结
&&&&&&& 线粒体功能的准确评价是保证临床线粒体相关疾病准确诊断的重要途径。
准确的诊断能够最大限度地降低医疗成本，并提供准确的预后和复发的辅助咨询。线粒体的评价方法很多，除了本文所述，还可从P O2，线粒体D NA以及骨骼肌，心肌等不同的器官和细胞水平进行多方位评价。并且，目前有很多线粒体疾病的动物模型，如缺血再灌注模型，早衰小鼠，链霉素诱导的心肌线粒体障碍，Mclk1_/_小鼠等(Grattagliano I.,2011)，可以从这些动物模型中探究线粒体发病机理和更多可靠的检测方法。对于线粒体功能性评价，本文从线粒体膜电位，钙离子水平等六个方面做一些总结。光学的应用和药理学工具能够为线粒体功能的测定提供更多的空间分布和动态信息，多参数方法评价线粒体功能和功能障碍能够实时监测线粒体功能的动态，为临床线粒体疾病提供可行的治疗和干预措施。
[1]Boveris A, Chance B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. Generalproperties and effect of hyperbaric oxygen. Biochem J &16.
[2]Dr?ge W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev&95.
[3]Chan PH. Mitochondria and neuronal death/survival signaling pathways in cerebral ischemia.Neurochem Res 3&9.
[4]Klingenberg M, Echtay KS. Uncoupling proteins: the issues from a biochemist point ofview. Biochim Biophys Acta 8&43.
[5]LeBel CP, Ischiropoulos H, Bondy SC. Evaluation of the probe 2',7'-dichlorofluorescinas an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress. Chem Res Toxicol&31.
[6]Lei B, Adachi N, Arai T. Measurement of the extracellular H2O2 in the brain bymicrodialysis. Brain Res Brain Res Protoc &6.
[7]Li Y, Trush MA. Diphenyleneiodonium, an NAD(P)H oxidase inhibitor, also potentlyinhibits mitochondrial reactive oxygen species production. Biochem Biophys Res Commun&9.
[8]Gallop PM, Paz MA, Henson E, Latt SA. Dynamic approaches to the delivery ofreporter reagents into living cells. BioTechniques &36.
[9]Dugan LL, Sensi SL, Canzoniero LM, Handran SD, Rothman SM, Lin TS, GoldbergMP, Choi DW. Mitochondrial production of reactive oxygen species in cortical neuronsfollowing exposure to Nmethyl- D-aspartate. J Neurosci 7&88.
[10]Emaus RK, Grunwald R, Lemasters JJ. Rhodamine 123 as a probe of transmembranepotential in isolated rat-liver mitochondria: spectral and metabolic properties. Biochim BiophysActa &48.
[11]Bahar S, Fayuk D, Somjen GG, Aitken PG, Turner DA. Mitochondrial and intrinsicoptical signals imaged during hypoxia and spreading depression in rat hippocampal slices. JNeurophysiol &24.
[12]Chance B, Williams GR. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. II. Differencespectra. J Biol Chem &407.
[13]Mills E, J?bsis FF. Mitochondrial respiratory chain of carotid body and chemoreceptorresponse to changes in oxygen tension. J Neurophysiol &28.
[14]Strong AJ, Smith SE, Whittington DJ, Meldrum BS, Parsons AA, Krupinski J, HunterAJ, Patel S, Robertson C. Factors influencing the frequency of fluorescence transients asmarkers of peri-infarct depolarizations in focal cerebral ischemia. Stroke &22.
[15]Gerich FJ, Hepp S, Probst I, M&ller M. Mitochondrial inhibition prior to oxygenwithdrawalfacilitates the occurrence of hypoxia-induced spreading depression in rathippocampal slices. J Neurophysiol &504.
[16]Hepp S, Gerich FJ, M&ller M. Sulfhydryl oxidation reduces hippocampal susceptibilityto hypoxiainduced spreading depression by activating BK-channels. J Neurophysiol1&103.
[17]Bowers KC, Allshire AP, Cobbold PH. Continuous measurements of cytoplasmic ATPin single cardiomyocytes during simulation of the &oxygen paradox&. Cardiovasc Res6&9.
[18]Bindokas VP, Lee CC, Colmers WF, Miller RJ. Changes in mitochondrial functionresulting from synaptic activity in the rat hippocampal slice. J Neurosci 0&87.
[19]Carriedo SG, Sensi SL, Yin HZ, Weiss JH. AMPA exposures induce mitochondrial Ca2+overload and ROS generation in spinal motor neurons in vitro. J Neurosci &50.
[20]Streller T, Huckstorf C, Pfeiffer C, Acker H. Unusual cytochrome a592 with lowPO2 affinity correlates as putative oxygen sensor with rat carotid body chemoreceptordischarge. Faseb J 7&9.
[21]Cannon MB, Remington SJ. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein forimproved response rate. Protein Sci &57.
[22]Dumont M, Beal MF. Neuroprotective strategies involving ROS in Alzheimer disease.2011 Sep 1;51(5):1014-26.
[23]Scandurra FM, Gnaiger E. Cell respiration under hypoxia: facts and artefacts inmitochondrial oxygen kinetics. Adv Exp Med Biol. -25.
[24]Kerr DS. Treatment of mitochondrial electron transport chain disorders: a review ofclinical trials over the past decade. Mol Genet Metab. ):246-55.
[25]GrattaglianoI, Russmann S, Diogo C, Bonfrate L, Oliveira PJ, Wang DQ, Portincasa P.Mitochondria in chronic liver disease. Curr Drug Targets. ):879-93.
[26]Mancuso M, Orsucci D, Copped& F, Nesti C, Choub A, Siciliano G. Diagnosticapproach to mitochondrial disorders: the need for a reliable biomarker. Curr Mol Med. ):.
[27]Mayevsky A, Barbiro-Michaely E. Use of NADH fluorescence to determine mitochondrialfunction in vivo. Int J Biochem Cell Biol. ):1977-88.
您可能感兴趣的其他文章
&&站长推荐
&&期刊推荐
&&原创来稿文章
&&网络读者服务
转寄给朋友
朋友的昵称:
朋友的邮件地址:
您的邮件地址:
写信给编辑
您的邮件地址:君，已阅读到文档的结尾了呢~~
细胞凋亡时线粒体钙离子信号调节因素研究进展
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
细胞凋亡时线粒体钙离子信号调节因素研究进展
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口工具类服务
编辑部专用服务
作者专用服务
线粒体损伤在支气管哮喘发生机制中的作用
支气管哮喘是一种复杂的炎症疾病,它伴有各种程度的气流受限,气道高反应性和气道炎症。它通常是由环境因素及炎症刺激相互结合引起的。最近人们研究发现线粒体的功能和哮喘的发病机制有着密切的联系,他们发现线粒体的功能紊乱在哮喘的气道炎症中起重要作用。那么在哮喘中线粒体会发生怎样的变化呢?本次研究我们将通过哮喘动物模型及对线粒体超微结构的观察来探讨哮喘中线粒体结构发生了哪些变化及这些变化在哮喘中的作用。线粒体是细胞内的一种重要的细胞器,是细胞内的能量发生器,可以产生机体需要的ATP。同时,线粒体也在其他许多生理过程中都扮演着重要角色,例如在体内葡萄糖的代谢作用以及在细胞水平上影响胞内的钙信号、活性氧(ROS)的生成和细胞凋亡等。那么,线粒体对胞质内钙信号和活性氧会有怎样的调控作用呢?研究已表明生理状态下,线粒体通过释放和摄取的途径对胞浆内钙离子浓度进行调控,而胞浆的钙稳态对维持细胞内的正常生理活动有重要作用,当外界炎症刺激导致线粒体破坏时,细胞内钙稳态会破坏,钙离子浓度会产生波动。本次研究我们通过测定炎症刺激时钙离子浓度的变化来探讨钙离子和炎症的关系。同样,线粒体的破坏也与活性氧的含量呈正相关,外界炎症刺激细胞导致各种自由基的释放,它们会损伤线粒体,导致线粒体超微结构的改变,被破坏的线粒体会通过氧化磷酸化产生过量的活性氧,大量的活性氧会对细胞组织造成损伤,这对气道上皮细胞的纤毛摆动频率会产生怎样的影响呢?本次研究将通过测定不同浓度活性氧模拟物过氧化氢对细胞纤毛摆动频率的影响来反映活性氧与炎症的关系。　　目的：　　本次研究利用卵清蛋白来激发大鼠建立哮喘模型,并对大鼠的气道反应性和各项炎症反应进行检测;通过电镜观察气道线粒体的结构来说明线粒体在支气管哮喘中的变化;通过测定炎症刺激时气道上皮细胞中活性氧及钙离子浓度以及不同浓度活性氧对气道上皮细胞纤毛摆动频率的影响来反映线粒体损伤在支气管哮喘中的机制。　　方法：　　1.用卵清蛋白来激发大鼠建立哮喘模型,利用呼吸机和多导生理信号记录仪来测定大鼠气道反应性,利用共聚焦显微镜测定纤毛摆动频率,用瑞士染色涂片对嗜酸性粒细胞进行计数,用ELISA对血浆中炎症因子进行检测,用HE染色分析分析大鼠的肺组织形态,　　2.用电镜来观察线粒体超微结构,　　3.用IL-4刺激气道上皮细胞并用共聚焦显微镜测定细胞内的ROS及钙离子浓度;用不同浓度的活性氧刺激细胞并测定纤毛摆动频率。　　结果：　　1.与正常组大鼠相比,哮喘大鼠气道反应性明显增高(P<0.05);气道结构发生重构,气管管壁明显增厚(P<0.05),管壁周围有大量炎症细胞浸润;气管上皮纤毛摆动频率降低;肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量明显增多;血浆中IL-8和TNF-a的含量明显增高(p<0.05);这些结果说明哮喘时大鼠机体发生了炎症反应;　　2.与正常组大鼠相比,哮喘组大鼠气道内线粒体的超微结构发生改变,出现明显的肿胀与破坏;说明哮喘时气道内线粒体结构发生破坏,其导致的功能损伤在哮喘的发病机制起重要作用;　　3.与正常组细胞相比,IL-4刺激的气道上皮细胞其活性氧含量与细胞内钙离子浓度明显增高(P<0.05),其纤毛摆动频率明显降低(P<0.05);用不同浓度H2O2刺激细胞时,细胞纤毛摆动频率随浓度的增高而降低,均低于正常组(P<0.05)。　　结论：　　上述结果表明哮喘时线粒体的结构会发生明显的破坏,损伤后的线粒体会导致胞浆内钙离子浓度的升高及大量活性氧的释放,活性氧的释放会导致纤毛摆动频率的降低,使其无法维持正常的呼吸道功能,这将进一步加重炎症,导致哮喘迁延不愈。
学科专业：
授予学位：
学位授予单位：
导师姓名：
学位年度：
R562.250.2
在线出版日期：
本文读者也读过
相关检索词
万方数据知识服务平台--国家科技支撑计划资助项目（编号：2006BAH03B01）(C)北京万方数据股份有限公司
万方数据电子出版社细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
&&线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂盒
线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂盒
&丁香通采购保障计划，让您的采购更放心。
供应商信息
商家诚信度：
成立时间：2003年
入驻丁香通年限：9年
商家等级：金牌客户
产品信息完整度：54%
联系人：赵先生、钱小姐
若您通过QQ未能联系到商家，您可以给商家发送站内信，与其取得联系。
扫一扫微信联系商家
电话：021－
邮件：info@
地址：上海浦东张江哈雷路室
该商家已通过实名认证
数据正在加载，请稍候...
扫一扫微信联系商家
电话: 021－
联系人: 赵先生、钱小姐
（联系我时请说在丁香通看到的）
30秒填写信息，方便商家与您及时沟通
您正在向&&发送关于产品&&的询问
登录丁香园账号即可使用多地址管理，
*&电话和Email请至少填写一项
给商家留言
我对您在丁香通发布的“线粒体内钙离子浓度荧光检测试剂盒” 非常感兴趣。请联系我并提供报价。
点击“立即发送”后，商家将在1个工作日内与您取得联系。
让更多商家看到我的询价
丁香通采购热线：400-
Copyright (C)
DXY All Rights Reserved.