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16:32:28 国外医学分子生物学分册1999年第21卷第5期
摘要 基因转移是基因治疗中一个关键的环节。受体介导的基因转移具有靶向、有效和安全、无毒的特点，且操作简便，因此有望成为一种理想的体内基因转移技术用于基因治疗。
关键词 受体介导；基因转移
受体介导的基因转移是将目的基因与配体连接，通过配体与细胞表面的特异性受体结合，以受体介导的内吞作用将目的基因转入细胞。配体与受体的特异性结合以及受体介导的内吞作用是一种生理过程，因此受体介导的基因转移有靶向、有效和安全、无毒的特点，这使它和其它基因转移技术相比具有独特的优势，尤其是用于体内基因转移。
1 方法和原理
配体与目的基因的连接，一般是通过多聚赖氨酸等多聚阳离子。配体与这些多聚阳离子的连接，是通过加入化学物质，形成共价的化学结合，然后与含目的基因的质粒以适当的比例在室温下混合。带负电荷的质粒DNA与多聚阳离子形成牢固、稳定的非共价电性结合。这种结合方式决定了DNA的表达不受影响。结合后的DNA缩合成致密的杆状或球状，外周覆盖着多聚阳离子和配体，此配体-多聚阳离子-DNA复合物呈可溶性，直径约100nm[1]，通过受体介导的内吞作用进入细胞后形成囊泡状的核内体。最终部分核内体与溶酶体融合，DNA被溶酶体酶降解，部分核内体膜破裂后DNA进入细胞质，再进入细胞核内进行基因表达。也有将配体嵌入包裹目的基因的磷脂双层中[2]，或将目的基因与含配体的融合蛋白连接[3]进行受体介导的靶向性基因转移。
2 受体介导的基因转移类型
2.1 脱唾液酸糖蛋白受体介导的基因转移
脱唾液酸糖蛋白受体是肝细胞表面独有的受体。Wu等以此受体介导，将HBV病毒的反义DNA转入体外培养已感染HBV病毒的人肝癌HepG2细胞，可使HBV病毒复制明显受到抑制，24h后HBV表面抗原及HBV的DNA均较无配体对照组下降约80%，而且6d内无明显上升[4]。用于体内，Wu等给小鼠静脉注射细菌的氯霉素乙酰基转移酶基因（CAT）与脱唾液酸糖蛋白复合物，10min后处死动物，发现32P标记的DNA85%分布在肝脏，5%在血中，并在肝组织检测到酶活性。而单独注射CAT的对照组仅17%在肝脏，46%停留在血中，肝组织未检互酶活性[5]。以此受体介导将低密度脂蛋白受体基因转入缺乏此基因的免疫体内，使高脂血症得到部分纠正[6]。说明脱唾液酸糖蛋白受体介导的体内基因转移具有很高的靶向性和有效性，提示多种与肝脏酶缺陷有关的遗传性疾病有望通过此受体介导达到基因治疗的目的。
2.2 甘露糖受体介导的基因转移
甘露糖受体存在于巨噬细胞表面，此受体介导，将肿瘤坏死因子（TNF-α）反义RNA转入体外与二氧化硅共孵育的巨噬细胞，可阻止巨噬细胞在二氧化硅诱导下分泌TNF多的作用，TNF分泌量仅为无配体对照组的1/5[7]。给小鼠静脉注射含荧光素酶基因的质粒与甘露糖化多聚赖氨酸复合物，在脾、肝、肺均检测到酶活性。其中以脾脏组织酶活性最高[8]，这和巨噬细胞最富集于脾脏相一致，说明甘露糖受体在体内基因转移中也具有器官靶向性。
2.3 胰岛素受体介导的基因转移
胰岛素受体存在于多种组织细胞表面，因此在体内基因转移中往往缺乏专一的器官靶向性。Sobolver等成功地进行了胰岛素受体介导的小鼠和羊乳腺上皮细胞体外基因转移后。采用局部途径给药的方法，经小鼠和羊乳腺导管注射荧光素酶基因与胰岛素复合物，在乳腺组织中检测到酶活性，将人β-乳清蛋白基因与荧光素酶基因连接后以同样方法体内应用，在乳液中也检测到酶活性[9]，说明受体介导的体内基因转移不但能够合成细胞内蛋白，而且还能合成分泌型蛋白。
其他学者还进行了转铁蛋白受体[10]、成纤维生长因子受体[11]、叶酸受体[2]、c-kit[12]受体以及单克隆抗体为配体[1]的受体介导的体外基因转移。
3 提高体外基因转染效率的策略
受体介导的基因转移中，不同细胞、不同受体转移率亦不同。与细胞表面受体密度、配体与受体的亲和力等因素有关。由于在部分外源基因进入细胞后容易被溶酶体酶降解，因此一般来说受体介导的基因转移效率较低，但是通过采取措施可获得较理想的效果：加入双岐性分子氯奎，利用氯奎的弱碱性阻止核内体的酸化，进而阻止其与溶酶体融合。DNA被溶酶体酶降解几率减少，进入核内的量增加，使基因表达增强。在受体介导的体外基因转移中，加入100μmol/L氯奎，能使转染率由0.1%提高到1%[1]。
加入膜不稳定剂，促进核内体膜破裂使目的基因进入细胞质，进而进入核内进行基因表达：①加入复制缺陷腺病毒或将复制缺陷腺病毒与目的的基因配体复合物连接，利用腺病毒衣壳蛋白的膜不稳定作用，可使基因转染率提高至近100%。所加病毒数量相同时，将复制缺陷腺病毒连接于目的基因配体复合物效率更高[13]。用脂补骨素或紫外线照射灭活腺病毒核酸，但保留病毒衣壳蛋白功能，能提高基因转移率并可避免病毒核酸进入细胞的危险性[11]。②加入具有膜不稳定作用的肽类或蛋白，如流感病毒HA基因产物融基因肽[14]、短杆菌肽S[15]、白喉毒素及假单胞菌毒素A的跨膜区[3，16]，可使转染效率提高到10%以上，比加入复制缺陷腺病毒提高到100%低许多，但对细胞没有毒性。
4 提高体内基因转移效率的策略
外源基因在体内表达量有限和表达时间短暂是目前基因治疗中急待解决的问题之一，目前的研究包括：根据部分肝切除可刺激肝脏再生，促进肝细胞分裂和DNA合成，从而延长外源基因在体内表达时间的设想，Wu等给小鼠静脉注射外源基因与脱唾液酸糖蛋白复合物，20min后行2/3肝切除术，结果外源基因4h剩余为20%，24h为9%，7d为7%，而对照组4h为8%～12%，24 h为2%～4%，7d时已检测不到外源基因[17]；给小鼠静脉注射人血清白蛋白基因，20min后行2/3肝切除术，2周后小鼠血中人血清白蛋白达34 μg/ml，而且这一水平稳定表达4周[18]。研究发现，部分肝切除延长外源基因表达时间实际上主要是通过破坏细胞的微管系统，阻止核内体与溶酶体融合，使外源基因被溶酶体酶降解减少，从而在体内的表达时间延长。
Chowclhury等利用秋水仙碱破坏细胞微管系统的作用，给小鼠静脉注射秋水仙碱0.75mg/kg，30min后再注射外源基因与配体复合物，也同样达到了延长外源基因在体内表达时间的效果[19]。
也可利用腺病毒衣壳蛋白的膜不稳定作用提高基因转染率，进而增加外源基因表达量，将复制缺陷腺病毒连接于目的基因与配体复合物进行体内基因转移，检测到外源基因量比不加腺病毒组高10倍[10]。
5 独特优势与应用前景
目前的基因转移技术中，显微注射法需每个细胞操作，而磷酸钙共沉淀法、电穿孔法对细胞损害较大，这3种方法均不能在体内应用。病毒介导的基因转移效率较高，但存在病毒复制、癌基因激活风险以及携带外源基因片段长度受限的不足；脂质体介导的基因转移无明显的毒副作用，但静脉注射时易被肝、脾等网状内皮系统吞噬。这两种基因转移技术虽已用于临床，但因缺乏器官细胞靶向性，均需借助手术操作。而受体介导的基因转移安全、无毒，具有靶向性，操作简便，可类似药物体内注射，并且可以携带长达48kb的基因片段[11]，因此具有独特的优势。上述提高受体介导基因转移率和延长基因表达时间的改进措施并非都适用于体内或临床应用，但达到的效果使受体介导的基因转移呈现乐观的应用前景，如果能用一些对人体无害或有益的方法来替代上述措施，寻找到更多的象脱唾液酸糖蛋白受体具有专一性的细胞表面受体，相信受体介导的基因转移不久将能成为基因治疗中理想的基因转移技术。
1 Foster BJ et al.Hum Gene Ther,):719
2 Lee RJ et al.J Biol Chem,):8481
3 Uherek C et al.J Biol Chem,):8835
4 Wu GY et al.J Biol Chem,):12436
5 Wu GY et al.J Biol Chem,):14621
6 Wilson JM et al.J Biol Chem,):963
7 Rojanasakul Y et al.J Biol Chem,):3910
8 Ferkol T et al.Proc Natl Acad Sci USA,):101
9 Sobolver AS et al.J Biol Chem,):7928
10 Cotton M et al.Proc Natl Acad Sci USA,):6094
11 Goldman CK et al.Cancer Res,):1447
12 Schwerzenberger P et al.Blood,):472
13 Cristiano RJ et al.Cancer Gene Ther,):4
14 Kircheis R et al.Gene Ther,):409
15 Hara T et al.Biochim Biophys Acta,):51
16 Uherek C et al.J Biol Chem,):8835
17 Chowclhury NR et al.J Biol Chem,):11265
18 Wu GY et al.J Biol Chem,):14338
19 Chowclhury NY et al.J Biol Chem,):2341
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【资料】乳腺生物反应器的研究进展
【资料】乳腺生物反应器的研究进展
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乳腺生物反应器的研究进展（原创）常卫华摘 要 ：进入21世纪，伴随着转基因技术的快速发展，转基因动物的研究已经从方法学研究步入了应用性研究阶段。外源基因在转基因动物的特异性表达，尤其是在乳腺的表达，可将转基因动物用作生物反应器进行生物活性蛋白的生产而应用于商业生产，因此成为国内外研究的热点。这里对乳腺生物反应器的研究历史，操作步骤，产业化优势，面临的问题及展望进行了综述。关键词 ：乳腺生物反应器；载体的构建；产业化优势乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，将外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺能够天然、高效合成及分泌蛋白质的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值的蛋白质的转基因动物的总称。1987年美国科学家Gordon等人首次在小鼠的乳汁中表达出人的t一PA蛋白(组织型纤维蛋白溶酶原激活因子)，显示了用动物乳腺生产高附加值产品的可能性。从此，各国进人了对该技术的研发、应用和竞争中。1 乳腺生物反应器的研究历史1.1国外研究进展 动物乳腺生物反应器是20世纪90年代初才出现的一种利用动物乳腺作为生物发酵工厂来大规模生产昂贵的可供人类医疗和保健使用的药用蛋白的生物高技术1991年，Wright等人在羊的乳腺中成功地表达了人抗胰蛋白酶基因(ATT)，人抗胰蛋白酶(一种治疗肺泡纤维化病──肺气肿的高效药用蛋白)在羊奶中的含量高达35g/L。1987年，Simons等人在转基因小鼠乳腺中首次成功地表达了羊乳球蛋白基因，并且小鼠奶样中的蛋白含量高达23 g/L，大约是动物细胞表达蛋白的400倍以上。该技术一经出现就得到迅猛的发展。目前,牛乳白蛋白基因 (Vilotte等,1989)、人组织血纤维蛋白溶酶原激活因子基因(Gordon等，1987)、人生长激素基因(Brem等，1991；Red-dy等，1991)、人体抗胰蛋白酶基因(Archibald等，1990)、人尿激酶基因(Meade等，1990)和人干扰素基因(Stinnake等，1991)等等，都在转基因小鼠乳腺中得到表达【1】。许多著名科学家都认为这将是畜牧业前所未有的***，可能会给社会带来巨大的经济效益。在过去的十几年里，已经有十几家公司开展这方面的研究工作。尤其是随着动物克隆技术的成熟，转基因技术得到了更充分的发展。1.2国内研究进展：我国研究起步较早，20世纪80年代初，施履吉院士就提出乳腺生物反应器的构想，并成功获得了表达HBsAg的转基因兔，为我国通过转基因动物的途径获得珍贵药物奠定了基础。1996年，我国正式投资进行动物乳腺生物反应器的研究，直接将其列入“九五”、“863”计划重大项目。通过近年来的努力，我国乳腺生物反应器的研究和开发工作进入了一个高速发展的时期，并取得了较好的成绩。1996年10月，上海医学遗传研究所与复旦大学合作研制成功能在乳腺中表达人凝血因子Ⅸ的转基因羊；同年扬州大学与中国科学院发育研究所合作，成功研制具有重大商业应用价值的人促红细胞生成素（EPO）转基因山羊；1998年，上海儿童医学遗传研究所曾溢滔、黄淑浈等获得了能表达人血清白蛋白的转基因奶牛；2000年12月，中国农业大学与北京兴绿原生物技术中心合作，成功获得了我国首只转有人α1-抗胰蛋白酶基因的转基羊； 2001年，又成功获得了5只携带鸡法氏囊疫苗基因的羊，其表达水平基本达到了产业化生产标准；2005年，国家“863”计划组利用转基因体细胞克隆技术，分别获得了转人乳铁蛋白、人溶菌酶、转乳清蛋白、转人岩藻糖转移酶等转人基因蛋白；其中人乳铁蛋白和人α-乳清白蛋白是国际上首次利用转基因克隆牛而获得【2～7】。2 乳腺生物反应器的内容2.1乳腺生物反应器的定义：动物乳腺生物反应器属于转基因动物的范畴，是指利用哺乳动物乳腺特异性表达的启动子元件构建转基因动物，指导外源基因在乳腺中表达，并从转基因动物的奶液中获取重组蛋白【8】。2.2乳腺生物反应器的原理：是应用重组DNA技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达，再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白【9,10】。2.3 动物乳腺生物反应器的操作流程2.3.1特异性表达载体的构建：选择乳腺组织特异性表达的调控元件，构建含有外源融合基因的乳腺特异性表达载体，是建立动物乳腺生物反应器的关键。外源基因在动物乳腺中高效表达有两个前提，一是选用的调控成分要能指导目的基因在乳腺中高效、特异表达，并且表达产物能分泌到乳汁中；二是整合到动物染色体组中的表达载体要处于活跃转录状态。这两个前提都归结到表达载体的构建【11~15】。要使外源基因在乳腺特异性表达，需要一个乳蛋白基因的启动子和调控区，即引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达。目前，一般采用β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin，BLG）、酸性乳清蛋白（Acid whey protein，WAP）、β-酪蛋白（Casein protein）的启动子及部分内含子进行乳腺特异性表达的调控。采用基因组DNA或小基因替代cDNA，以提高基因表达水平。采用酵母人工染色体（Yeast artifi－cial chromosome，YAC）携带大容量的外源基因和侧翼顺序，消除基因的位置效应【16】。2.3.2外源基因的整合：整合外源基因常用的技术有：①原核显微注射技术：将体外构建的外源目的基因，用毛细管注射到处于原核时期的受精卵的原核中，通过DNA复制整合到动物基因组中；②胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES cells）介导技术：用转基因技术将外源目的基因转移到ES细胞中，通过同源重组或转换的方法，使外源基因整合到ES细胞的基因组中；③胞内精子微注射技术：精子破膜处理，与外源DNA短时间共孵育，然后将目的基因与去污剂和精子微注射入减数分裂Ⅱ期的卵母细胞质中，而达到整合的目的；④反转录病毒感染技术：利用反转录病毒的长末端重复序列区域具有转录启动子活性这一特点，将目的基因连同启动子等序列一同重组到病毒的核酸载体上，再让该病毒感染受精卵或胚胎干细胞，使外源基因整合到宿主染色体上。2.3.3胚胎移植：将经过鉴定和体外培养的转基因胚胎（或受精卵），通过手术或非手术的方法植入正常发育的发情代孕母畜子宫内。移植后的受体在胚胎发育至1~2月龄时，用B超进行妊娠检查，出现孕囊的判定为怀孕，妊娠足月分娩【17】。目前多采用非手术移植法，即使用特制的胚胎移植器，通过阴道和子宫颈，将胚胎注入到子宫角的一定部位【16】。2.3.4子代DNA及乳汁检测：仔动物出生后，提取DNA进行PCR和Southern blot检测，判断是否转入外源基因【17】。将转入外源基因的雌性动物适龄诱导泌乳或饲养至性成熟配种产乳，并检测其乳汁中是否有转基因蛋白表达；将转入外源基因的雄性动物与雌性动物杂交，产生后代进一步检测。2.3.5转基因动物的扩群：通过子代杂交产生纯合的转基因动物来扩大转基因的畜群。2.4 .动物乳腺生物反应器的应用2.4.1生产多肽类药物：应用乳腺生物反应器能够大量生产多肽类药物，如胰岛素、干扰素、促红细胞生成素等。2.4.2生产基因工程疫苗：由于受基因工程载体的容量限制，目前所生产的基因工程疫苗都是以一小段病毒外壳蛋白或细菌膜蛋白作为抗原，其免疫原性不如灭活的全病毒或细菌。使用乳腺生物反应器可以生产病毒的完整外壳蛋白或细菌的免疫决定簇，提高疫苗效果。2.4.3生产抗体：应用乳腺生物反应器能够大量生产抗体，使许多疾病可以用抗体治疗，不会造成体内微生物失衡或因大量使用抗菌素而产生副作用。2.4.4生产营养品：通过改变乳汁的营养成分，提高营养价值。2.4.5生产酶制剂：根据使用酶的纯度要求，可选择适合的动物乳腺生物反应器生产酶制剂，以满足工业用酶和实验用酶的需求【18-21】。3 乳腺生物反应器的产业化优势 利用转基因动物乳腺生物反应器生产基因药物在伦理学及其商品化方面已不存在任何障碍，从乳汁中源源不断地获取具有生物活性的多肽药物和具有特殊营养意义的蛋白质，已成为一个新兴的转基因制药业。它具有以下优越性：3.1 设备简单，无环境污染转基因动物除需养在特别洁净的环境外，并不需要其他特殊设施，基本上是一个畜牧业过程，不会造成环境污染。1头转基因动物即相当于1个制药车间，饲养生产成本低，且转基因动物可无限繁殖，扩大生产规模时更显优势。3.2 产量高，易提纯动物乳房是高效合成蛋白质的器官。1只优良品种的乳牛，在305天的泌乳期中可产奶10吨左右，蛋白质含量占3.2%~3.6%。生产的蛋白质药品为纯生物制品，避免了化学试剂及生物毒素的污染，生物活性与天然蛋白一样，易提纯。3.3 开发周期短目前一种新药从研制开发到上市约需15至20年。如果技术成熟后利用动物乳腺来生产，仅需5年左右。如以转基因动物研制的周期来计算，转基因羊从显微注射到泌乳的周期是18个月，也就是说18个月即可以进入生产阶段。3.4 对动物影响小乳腺是一种外分泌腺，外源蛋白质很少进入循环系统，这可避免大量表达的外源性蛋白对动物健康造成的危害。3.5 生产成本低、经济回报丰厚应用转基因动物乳腺生物反应器来生产基因药物，是一个新型朝阳产业。据测算，用传统的细胞培养生产1克基因药物，平均成本为100美元~1000美元，利用转基因动物乳腺反应器生产仅需10美元~25美元【22】。而美国D&MD公司的最新市场分析报告显示，2025年仅美国的生物药品的需求量就将从现在每年160亿美元增加到每年860亿美元【23】。4 乳腺生物反应器存在的问题4.1 基础理论方面目前人们尚未完全掌握关于乳蛋白基因表达调控的规律，如乳蛋白基因表达的组织特异性以及时序性调控机制的基础理论尚不完善，因此对于导入基因在动物体内的整合位点不能适宜选择，也就无法消除基因表达的位置效应。4.2 实验技术方面在目的基因的分离和改造，乳腺特异表达载体的构建及转基因技术的关键性技术上存在缺陷，无法保证对基因的定点整合，因此转基因动物常会出现繁殖力下降、胚胎早期死亡等各种生理及病理缺陷。4.3 产品加工方面动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体保护系统可对所有外源性物质产生排斥反应，如出现蛋白质水解等问题。此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修饰的多肽都对产品的安全性构成了极大的威胁，所以在分离过程中要去除所有可能引起人类变态反应的蛋白质，同时对含量低的产物加以纯化，才能得到与目的蛋白结构、功能和理化特性相同的产品【24】。4.4转基因动物影响生态平衡的问题转基因动物要回归大自然，当其形成一定的规模时，对生态平衡将会造成一定的影响，很可能人为破坏地球上亿万年进化得到的某些现存物种。5 乳腺生物反应器应用展望尽管利用乳腺生物反应器生产目的蛋白遇到许多困难, 研究还处在初级阶段，但技术路线是可行的。如果将核移植技术与转基因技术相结合，同源重组能获得目标基因的准确插入，以及转基因胚胎的有效筛选等方面有所突破，那么动物乳腺生物反应器的商业化前景更加广阔。参考文献【1】王洪岩,仲跻峰,刘文浩.动物乳腺生物反应器的研究进展,山东农业科学,-77.【2】王庆忠,李国荣,尹昆,等.乳腺生物反应器的研究现状和产业化前景.生命科学,）：76-81.【3】李彦明,莫伟强.动物乳腺生物反应器的研究发展及产业化.畜牧兽医科技信息,-8.【4】周京明,顾沛沛.奶牛乳腺生物反应器及其产业化前景.中国奶牛,2007（6）：31-34.【5】袁建民,***宏,李青旺,等.动物乳腺生物反应器研究进展.中国农学通报,）:20-24.【6】Wei S.Targeting the exogenous htPAm gene on goat somatic cell beta-casein locus for transgenic goat production.Mole Reprod Dev,）:428-434.【7】Zhang XF,Wu GX,Chen JQ,et al.Transfer of an expression YAC into goat fetal fibroblasts by cell fusion for mammary gland bioreactor.Biochem Biophys Res 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changweihua112战友原来是做这个的啊！
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哈哈，谢谢你啊
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