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【求助】takara t4连接酶
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我最近用takara t4连接酶连接我的载体和质粒，双酶切后的载体和质粒4℃连接转化后长不出菌来，想请问一下大家是什么原因？载体长度有3.8kb
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首先，你的表述有问题，载体和质粒相连？载体不就是质粒么，应该是目的片段和载体相连。第一，你要确定你的目的片段和载体都没有问题而且已经酶切好了，建议把目的片段在连接前先送测序。第二，建议你把连接的温度改为16度过夜，4度有些低。第三，确定你有热激吗？第四，建议热激后涂板前先用不含抗生素的soc培养基（LB也行）摇1小时左右再涂板，这样克隆数可能会多一些。
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不好意思，谢谢您纠正我的错误，之前有把目的片段送去过测序，是没有什么问题的。因为目的片段也有点太长，有将近3.7kb，我试试用16度过夜看看能不能连上。您好，我还想问问我们使用DH5α感受态细胞可以吗?
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上海吐露港生物科技在分子生物学领域积累了丰富的工作经验，可根据已有载体进行各种改造方案的设计：（1）从头拼接/构建质粒；（2）对现有质粒上功能元件进行改造；（3）或应客户要求进行各种亚克隆操作等。我们的承诺是：做不出来，不收费。详见：/service_detail.php?id=110
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关于丁香园关注今日：28 | 主题：231578
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【求助】T4DNA连接酶到底反应多长时间最佳？非常急！！！
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这个帖子发布于9年零248天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我最近在做载体构建，但老是不成功。现在正在仔细分析每个实验细节。发现T4DNA连接酶的说明书上总是说连接过夜，不知道过夜到底多少个小时最佳。特此请教！非常感谢！！！
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我来就Ｔ４连接载体谈谈自己的经验，希望能给楼主一点帮助．１.首先楼主要搞清楚自己的两段的酶切位点是什么？估计肯定是粘端切口，但是有的粘端切口的连接是要平端的连接条件，比如Xhol I就是产生粘端切口，但是推荐使用平端连接条件．我用过３种Ｔ４连接酶，只有ferment的说明书上有平端连接的反映体系，promega and takara都没有．所谓粘端连接条件也就是加入ＰＥＧ４０００，这个东西很便宜，３０块钱一大瓶．我做过对照,加入PEG4000的长出的克隆个数可能是没有加入的5倍多.2.楼主连接的片段有多长?越长肯定越难连接,我有一个形象的比喻,DNA片段就是好比一个毛线,越长的毛线缠绕成的毛线团就越大,也就越难找到它的两头,是不是?我把一个4000多BP的序列连接到载体上,开始也是很难连接上，后来我用平端连接条件,4度连接48小时多,期间去弹刮混匀数次,结果做出来克隆了.我们实验室其他一个同学的长片段连接也是采用超长连接时间而最后做成功了.如果楼主是长片段连接,我强烈建议长时间的4度反应.3.载体和目的片段的比例问题,不知道楼主是怎么估计他们各自的浓度的?我们这里发现测OD值不是很准.需要电泳和相应的MARKER比较亮度才是比较准确的,你可以看看自己的DL2000跑出的条带,100BP的那条带很微弱而2000BP的很亮,但是TAKARA的说明上是每条带浓度都是10ng/ul．所以根据自己的目的条带和载体的大小，选择相应的ＭＡＲＫＥＲ进行电泳来估测浓度．４．保证所有使用的试剂都是自己很清楚没有问题的．保证酶切后的质粒和目的基因回收都是正确的．５．楼主一定要清楚，装载体是一个非常非常常规的分子生物学实验内容，所以做不好大部分原因是自己的．除了你做的片段的确很长很短或是很特别．祝你好运！也祝我好运能得分！
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楼主不能心浮气燥啊，我也遇到过同样的问题，半年才构建成功一个质粒，情形和你很相似，有几个小建议。1 把你的感受态铺一下板子，看看能否生长，长势如何。2 配板子时，有没有注意加抗生素时的温度。可以多加点。3 涂扳子时，可以少加点菌液，试试50ul如何啊。抚育的时间不要太长，不要等卫星菌落出现再挑，用氨苄抗性很容易出现这种情况的。4 做好对照啊。5 另外BstE II 的反应温度是60度，有没有注意这个问题。要不就把假阳性克隆提个质粒看看，是不是载体自连很严重啊。
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没加保护碱基应该不行，只有T连，但T载体上是乎没有你要的酶切位点。还是重新设计引物，有时候克隆老做不出来，与其各个地方找原因，还不如重头来过，省时间，省金钱。一个克隆重PCR到酶切鉴定也就不到2天的时间。连接室温放半小时就够了。然后就是感受态细胞，要确保没污染。每次铺皿做个对照就行了，是不是自连也做个对照（不加insert）每次铺皿铺4个板子（什么都不加只有AMP，铺上感受态细胞，铺上只有vector经过连接但没有insert的细菌，铺上连接的细菌），这样的话，一般能发现几乎所有的问题。
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呜呜呜... ...！怎么没前辈指点呢？！！
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呜呜呜... ...
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12个小时以上就行了。
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你也可以参考一下promaga的说明书
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12小时为过夜，不过我都是室温半小时，效果也不错 。
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我感觉载体构建是否成功与载体和片段的连接比关系很大，至于连接时间过夜连接一般指12小时。但是我以前用TaKaRa的T4连接酶，六个小时的连接效率已经比较高了。下边是我的两个经验：1.合适的连接比为载体比片段为1比3——1比10之间，我的经验是载体要相应少一些，而片段要多加一些。这样载体自连的几率会变小。2.片段与载体的酶切一定要彻底，否则连接效率会降低的。
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16 ‘C is OK.&6 hour.
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我一般是16度3个小时就可以了
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好晕啊！刚才看时，又长了满板子的菌落。每次都是这样，但是一个连好的也挑不出来！！！
大家帮我分析一下：我用的酶切位点是BstE II 和Bgl II（我只能用这两个）.我前几次用的是分别酶切3小时左右，但都是转化后长了满板子菌落，就是没有我要的。因为查到前者酶切效率不高，所以这次就给其前者酶切过夜，后者切了5小时左右，可还是不行！唉，疯了我都！！不知大家有何建议？！
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楼主不能心浮气燥啊，我也遇到过同样的问题，半年才构建成功一个质粒，情形和你很相似，有几个小建议。1 把你的感受态铺一下板子，看看能否生长，长势如何。2 配板子时，有没有注意加抗生素时的温度。可以多加点。3 涂扳子时，可以少加点菌液，试试50ul如何啊。抚育的时间不要太长，不要等卫星菌落出现再挑，用氨苄抗性很容易出现这种情况的。4 做好对照啊。5 另外BstE II 的反应温度是60度，有没有注意这个问题。要不就把假阳性克隆提个质粒看看，是不是载体自连很严重啊。
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建议你使用4度冰箱过夜（12－16小时均可），NEB的T4连接酶很好用。
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大家好！我是NEB（北京）技术支持，非常高兴与大家一起讨论分子生物学相关技术问题。构建载体说起来是一个不怎么复杂的实验，但是要做好，有时候还真不那么容易，当然运气有时候也需要，不过最重要当然是实验设计啦。下面说说我在这方面的体会吧。1.设立实验对照非常重要。2.内切酶酶切要彻底，但不能过度酶切，否则一些质量稍差的内切酶可能会因为不够纯而破坏DNA末端，并导致连接失败。3.DNA的量也比较重要，包括载体和片段的比例。我贴了我公司关于T4的FAQ，比较全面，供大家参考。关于blzhang369 的问题，不知道您指的“一个连好的也挑不出来”是自连的呢？还是杂菌落。如果是杂菌落，应该象fantian_dc 说的注意加抗生素的温度。如果是自连，那应该是酶切不彻底，这两个酶，应该先用反应温度低的BglII酶切，然后用BstEII酶切。最好您分别单酶切鉴定一下酶活。至于T4，如果是NEB的，用20ul反应体系，加1ulT4，粘性末端室温10分钟到2小时就足够了。如果您担心连不上，可以用16度过夜，过夜一般指10-16个小时。最后祝好运。
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我想问一下,连接时载体和目的片断的比例最好是1:3-1:10,请问这个比例是摩尔数之比吗?那么通过电泳确定亮度的应该是质量比,要除以分子量才可以得出摩尔比,然后考虑合适的加入量,对吗?
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楼主有没试过用蛋白酶K消化PCR产物阿？我刚进实验室，近来一直在构建原核表达载体。之前也遇到相似问题。主要原因是PCR产物很难被切开，因为在PCR引物两端可能聚集了TAq酶，妨碍内切酶作用。所以要用蛋白酶K（100ug/ml）37度，消化2-4小时，并适当延长梅切时间。效果不错啊。试试吧
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请问哪位前辈用过BStE II 和 Bgl II，不知你们摸索的最佳酶切时间是多长时间？我都试了好几个不同时间，感觉还是不好。
还有，上面兄弟说道 “用蛋白酶K（100ug/ml）37度，消化2-4小时，” 请问消化后在酶切之前还要做处理吗？
我们实验室不具备DNA定量设备，我每次连接时加载体和目的片断的比例都是凭感觉，请问还有别的准确一点但又容易操作的办法吗？
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16℃16 hour
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我们实验室是12—16小时，16度。
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我来就Ｔ４连接载体谈谈自己的经验，希望能给楼主一点帮助．１.首先楼主要搞清楚自己的两段的酶切位点是什么？估计肯定是粘端切口，但是有的粘端切口的连接是要平端的连接条件，比如Xhol I就是产生粘端切口，但是推荐使用平端连接条件．我用过３种Ｔ４连接酶，只有ferment的说明书上有平端连接的反映体系，promega and takara都没有．所谓粘端连接条件也就是加入ＰＥＧ４０００，这个东西很便宜，３０块钱一大瓶．我做过对照,加入PEG4000的长出的克隆个数可能是没有加入的5倍多.2.楼主连接的片段有多长?越长肯定越难连接,我有一个形象的比喻,DNA片段就是好比一个毛线,越长的毛线缠绕成的毛线团就越大,也就越难找到它的两头,是不是?我把一个4000多BP的序列连接到载体上,开始也是很难连接上，后来我用平端连接条件,4度连接48小时多,期间去弹刮混匀数次,结果做出来克隆了.我们实验室其他一个同学的长片段连接也是采用超长连接时间而最后做成功了.如果楼主是长片段连接,我强烈建议长时间的4度反应.3.载体和目的片段的比例问题,不知道楼主是怎么估计他们各自的浓度的?我们这里发现测OD值不是很准.需要电泳和相应的MARKER比较亮度才是比较准确的,你可以看看自己的DL2000跑出的条带,100BP的那条带很微弱而2000BP的很亮,但是TAKARA的说明上是每条带浓度都是10ng/ul．所以根据自己的目的条带和载体的大小，选择相应的ＭＡＲＫＥＲ进行电泳来估测浓度．４．保证所有使用的试剂都是自己很清楚没有问题的．保证酶切后的质粒和目的基因回收都是正确的．５．楼主一定要清楚，装载体是一个非常非常常规的分子生物学实验内容，所以做不好大部分原因是自己的．除了你做的片段的确很长很短或是很特别．祝你好运！也祝我好运能得分！
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我也在做载体,我的经验是最好不要超过16小时.
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我也在做重组,有菌生长,一个板上就是3_7个,卡那抗性,做了酶切,双酶和单酶都做了(ECORI和BAMHI),发现在同一条水平,没有目的条带,(500BP)可能是自连,根据上面各位的讨论,我觉得很有可能是PCR的产物没有酶切完全,我设计PCR引物时两端就直接是ECORI和BAMHI的酶切位点,没有GC保护,这样对酶切影响很大吗?有没有什么补救的方法?用上面QIUQIUOU所提到的蛋白酶K(100UG/ML)消化的方法可以解决吗?
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airforce8128 我想问一下,连接时载体和目的片断的比例最好是1:3-1:10,请问这个比例是摩尔数之比吗?那么通过电泳确定亮度的应该是质量比,要除以分子量才可以得出摩尔比,然后考虑合适的加入量,对吗?您理解的很对。
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yujungoldenfish 我也在做重组,有菌生长,一个板上就是3_7个,卡那抗性,做了酶切,双酶和单酶都做了(ECORI和BAMHI),发现在同一条水平,没有目的条带,(500BP)可能是自连,根据上面各位的讨论,我觉得很有可能是PCR的产物没有酶切完全,我设计PCR引物时两端就直接是ECORI和BAMHI的酶切位点,没有GC保护,这样对酶切影响很大吗?有没有什么补救的方法?用上面QIUQIUOU所提到的蛋白酶K(100UG/ML)消化的方法可以解决吗?没有加保护碱基肯定不行啦。只能与T载体连接然后酶切，否则酶切效率很低。那位用蛋白酶K的兄弟的方法我们还真没有用过，请问蛋白酶K怎么失活呢？是提纯还是加抑制剂，谢谢！
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14-16度，2小时之后即可转化
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NEB 没有加保护碱基肯定不行啦。只能与T载体连接然后酶切，否则酶切效率很低。那位用蛋白酶K的兄弟的方法我们还真没有用过，请问蛋白酶K怎么失活呢？是提纯还是加抑制剂，谢谢！是么?1.如果重新设计引物呢?,加上GC 保护碱基之后的方法与和T载体相连比较而言,那个更便宜和节省时间呢?我们实验室目前没有T载体,要买很贵么?2.我要PCR产生的是一段启动子序列,所以加到T载体上再切下来的话,势必会引入多余的片断,不知会否影响启动子活性呢? 谢谢回复啊,感激不尽呀:I::)
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楼主不要急，实验要一步一步来的，首先一定要加保护碱基的．不然酶切肯定不彻底．．．酶切后作个载体去磷酸化处理．．．我觉得你的问题不在连接．．而是在前面的一些操作．．．你还算好的，不要求转化率，你该偷笑了，真的，你这个东西不算难的，关键是一步步来
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gunzi 没加保护碱基应该不行，只有T连，但T载体上是乎没有你要的酶切位点。还是重新设计引物，有时候克隆老做不出来，与其各个地方找原因，还不如重头来过，省时间，省金钱。一个克隆重PCR到酶切鉴定也就不到2天的时间。连接室温放半小时就够了。然后就是感受态细胞，要确保没污染。每次铺皿做个对照就行了，是不是自连也做个对照（不加insert）每次铺皿铺4个板子（什么都不加只有AMP，铺上感受态细胞，铺上只有vector经过连接但没有insert的细菌，铺上连接的细菌），这样的话，一般能发现几乎所有的问题。多谢指教,受YI非浅还有几个问题,1.重组体转化感受态时,是直接将连接产物加入感受态好一些?还是加入100UL的TE+5UL(一定比例稀)连接产物呢?我看到有这两种不同的做法，为什么呢？有无优劣之分？2.感受态细菌是用100UL每次,可以分成50UL每管作两次话，是不是将连接产物的量减半就可以呢？?前提是不将其反复冻融,且不超过其饱合量３．如果说明书上说50UL的感受态的饱和量是1ng超螺旋DNA,怎么样从载体和目的片段的加入量来从理论上估计连接产物有多少ng?(假设连接反应充分)也就是怎样从摩尔比换算成质量?希望各位大侠不吝赐教，不胜感激呀！！！:):I;)
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我说的蛋白酶K消化是在做完PCR后，然后用苯酚氯仿抽提。另外，我不是兄弟，是小妹。各路大侠，请多多指教。;)
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to yujungoldenfish直接将连接产物加入感受态，还是加入100UL的TE+5UL连接产物我认为都可以，无非有可能后者更有利于提高转化效率。但在这里来提高转化效率，远没有你制备高效率的感受态细胞效果明显。100ul分两次用也可以，也正好说明第一个问题，因为你在连接后产物进行转化，这些步骤最多使得转化效率高几倍或低几倍，而制备高效率的感受态细胞有时可以是数量级的关系。做 two-part 连接（一个insert + vector）的关键步骤在于感受态的效率和连接的效率（vector与insert的摩尔比），前者注意低温和操作轻柔，tip吹打，高速离心，振荡都要避免。后者EB染色后，可以观测亮度来进行初步判断，（片段小的insert弱不一定摩尔数少）。可以这么说如果你制备的感受态有10的9次方那么高，后面连接转化只要不态烂总会长些克隆。
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qiuqiuou 我说的蛋白酶K消化是在做完PCR后，然后用苯酚氯仿抽提。另外，我不是兄弟，是小妹。各路大侠，请多多指教。;)呵呵！我也是妹妹啊，只不过看大家都兄弟相称，也就随俗了，抱歉啊！原来您说的DNA纯化时加的蛋白酶K！如果大家用的是NEB的内切酶和PCR系统，可以参考内切酶在PCR反应中的活性，http://www./cn/tech/re/activityPCR.htm，如果是+++，就不用纯化。
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楼主，你好，最近我也刚刚构建了几个载体，开始的时候也是跟你一样转化后长满了菌落，但是提出的质粒都是空白的，后来构出来了，每次基本都是很高的阳性比例，10个转化子中有9个或10个阳性的。给你提点建议。1.我认为你的情况可能不是连接造成的，应该是没有将载体完全酶切的缘故。你可以做个对照，将酶切后的质粒和PCR酶切产物连接后转化，将酶切的质粒也转化作对照，若酶切后的质粒也长出密密麻麻的转化子你就得考虑将酶切时间延长（过夜），质粒量减少（1-2ug）。2.提高目的片断比例，PCR酶切产物分子数：质粒酶切产物分子数＝10:13.连接我一般室温3h左右就够了。希望对你有点帮助
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10-16 hr.use fresh T4 ligase!and clean DNA!
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关于丁香园TAKARA公司的T4连接酶可以室温连接3小时么一定要16度过夜连接么(连接酶) - PCR实验 - 生物秀
标题: TAKARA公司的T4连接酶可以室温连接3小时么一定要16度过夜连接么(连接酶)
摘要: [TAKARA公司的T4连接酶可以室温连接3小时么一定要16度过夜连接么(连接酶)] TAKARA公司的T4连接酶可以室温连接3小时么？一定要16度过夜连接么？ 关键词:[连接酶]……
TAKARA公司的T4可以室温连接3小时么？一定要16度过夜连接么？
回复看情况而定，16度是T4活性发挥的较佳温度，也是常用温度，连接时间8小时以上即可，即连过夜即可如果你的片段和载体是粘端连接的话，可以提高连接温度，室温两三个小时足以，同样降低温度，延长连接反应的时间，但两者的效率可能偏低如果是平端连接，如果不是急着转化的话，还是建议16度连好了
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有关TAKARA T4连接酶
有人用过TAKARA的T4连接酶么？他的反应体系、反应时间、反应温度和一般的T4一样么&&？为什么说明书上什么都没有
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