pcr未成功的成功的外界因素有哪些些

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-03-25 09:41 标签： 成功的因素有哪些
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影响pcr反应效率的因素有哪些
刺客联盟0234
模板纯度,有较多蛋白或其他杂质时,会一定程度影响PCR效率；模板量,过高的模板量反而会降低pcr效率和特异性；引物,引物的长度需要再效率和特异性间获得优化,其次要控制引物GC含量；聚合酶,要考虑酶的保真率和速度；Mg离子浓度,Mg离子浓度过高会降低特异性,浓度过低会降低效率；退火温度：退火温度低,效率会高,但特异性降低；退火温度高,效率降低,但特异性会提高；需优化.我理解的就这么多,欢迎大家补充,纯属手打,
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你可能喜欢PCR的产量主要有哪些因素决定的?(退火温度,特异性,模板量,引物) - PCR实验 - 生物秀
标题: PCR的产量主要有哪些因素决定的?(退火温度,特异性,模板量,引物)
摘要: [PCR的产量主要有哪些因素决定的?(退火温度,特异性,模板量,引物)] PCR的产量有许多因素决定他们的主次关系是什么,各因素又是怎么调节的 我知道循环的次数,延伸时间,模板量,引物 dntp浓度,taq酶的活性,等都有关,退火温度是不是也有关?不是说退火温度只决定特异性吗,为什么提高温度后有的结果也降低
若不同的目的基因进行比较是不是只要在平台期前使其循环次数一样就行 当然pcr体系是一样,退火温度可不同
望大家多多提供宝贵意见!!! 关键词:[退火温度 引物 模板量 特异性 平台期 循环次数 温度]……
PCR的产量有许多因素决定他们的主次关系是什么,各因素又是怎么调节的.我知道循环的次数,延伸时间,模板量,引物 dntp浓度,taq酶的活性,等都有关,退火温度是不是也有关?不是说退火温度只决定特异性吗,为什么提高温度后有的结果也降低.
若不同的目的基因进行比较是不是只要在平台期前使其循环次数一样就行.当然pcr体系是一样,退火温度可不同.
望大家多多提供宝贵意见!!!
回复①退火步骤的严格性：提高退火温度可以减少不匹配的杂交，从而提高特异性。②减短退火时间及延伸时间可以减少错误引发及错误延伸。③引物二聚体是最常见的副产品，降低引物及酶的浓度也可以减少错误引发，尤其是引物的二聚化。④改变MgCl2(有时KCl)浓度可以改进特异性，这可能是提高反应严格性或者对Taq酶的直接作用。⑤模板中如果存在次级结构，例如待扩增的片段易自行形成发夹结构时，可在PCR混合物中的4×dNTPs中加入7-脱氮-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸（7-deaza-2’-deoxyguanosine-5’-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP与dGTP比例为3：1的混合物（150μmol/l de7GTP +50μmol/L dGTP）代替200μmol/l dGTP，则可阻非特异性产物的生成。回复造成PCR进入平坡的原因有：引物和dNTP等消耗完毕、Taq酶失活，这几中因素在标准反应中均不会出现。此外，还有几种可能：　　1．底物过剩　　因DNA合成量多于反应液中存在的Taq酶，在100μl反应液中含2.5Utaq酶而DNA合成量达1μg（3nmol脱氧核苷酸）时，开始变为底物过剩。延长延伸时间或添加Taq酶，可以克服之。但不实用，因每进行下一循环就要延长延伸时间一倍及多加一倍Taq酶，才能继续保持指数增长。　　2．非特异性扩增产物的竞争　　与上述情况密切相关，此时不需要的DNA片段与需要的片段同时竞争，要克服这一情况是要提高反应特异性，使不需要片段不能大量积聚。　　3．退火时产物的单链自己缔合　　两条单链的片段在退火时除了与引物缔合外，也可以自行缔合，这也会阻止产品增多。当产物浓度到达10pmol/100μl时即可发生此现象，除稀释外无法克服。　　4．变性在高浓度产物条件下，产物解链不完全，以及最终产物的阻化作用（焦磷酸化，双链）。　　总而言之，PCR的条件是随系统的而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后稍稍改变各参数，可以达到优化，以取得优良的特异性和产率。
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在基因进行PCR扩增过程中涉及到哪些要素?其中哪些因素决定了PCR的效率?
预变性模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟.变性步骤循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可 缩短该步骤时间变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败.引物退火退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度.然后在此次实验基础上做出预估.引物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）.循环数大多数PCR含25-35循环.最后延伸在最后一个循环后,反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸完全,并使单链产物退火成双链.——————————————————————————————————————————如果进行PCR首先确定的是底物的纯度,苯酚有报道称会印象PCR过程.引物就不多说了,退火温度对PCR的特异性有较大影响.延伸时间要看扩增片段长短,循环数不能太多要不非特异性扩增太多.
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