&& 查看话题
HPLC 流动相比例差别较大，但出峰的保留时间却不变，是怎么回事？
在做HPLC 时遇到一个非常棘手的问题：改变流动相醇水的比例，当甲醇比例分别为20%，40%，60%，80%时，保留时间基本一致，都在2.85min左右出峰，我想让我的化合物在10分钟左右出峰该怎么做？以前从来没有出现过这种情况，还请高手帮忙解决一下，非常感谢。
如此大比例改变甲醇浓度都没有改变保留时间，有可能你的2.85min是死时间，如果不是的话，检查比例阀或者电磁阀。 支持二楼回答。三分钟之内可能是死体积区域。这种情况一般继续减少有机相比例或者降低流速。同时要看看化合物性质，选择合适的色谱体系。比如，物质是酸性的，应该选择酸性流动相，抑制电离，如果碱性过强可以考虑离子对体系。具体情况还得看化合物的性质和你目前的具体条件 首先你要确定3min这个峰是你要的主峰,可以从进样量,样品浓度入手,成倍增大或缩小,看峰面积变化.
很有可能你的样品出峰时间太晚吧,或者在这个体系不出峰...需要调整流动相,添加缓冲盐改善出峰时间. 2.8min有可能跟本就没有被保留，直接流出，所以无乱怎么改流动性比例都是一样，或者说这个体系不太适合。 : Originally posted by wyy080214 at
如此大比例改变甲醇浓度都没有改变保留时间，有可能你的2.85min是死时间，如果不是的话，检查比例阀或者电磁阀。 我不是学分析的，所以不太明白什么是死时间，因为我进样的化合物含有0.1%的DMSO，所以今早进了一针0.1%的DMSO的缓冲液，发现出峰时间与昨天一系列洗脱剂出来的基本一致，吸收强度也很高，所以我怀疑可能我的东西还没有出来，不知道我的化合物的浓度是1微摩尔，HPLC是否能检测出来？ : Originally posted by tianxia119wo at
首先你要确定3min这个峰是你要的主峰,可以从进样量,样品浓度入手,成倍增大或缩小,看峰面积变化.
很有可能你的样品出峰时间太晚吧,或者在这个体系不出峰...需要调整流动相,添加缓冲盐改善出峰时间. 3min是主要峰，吸收强度达到了4000,但好像是样品里的DMSO，不知道1微摩尔的样品能被检测出来吗？ 可以考虑下特殊的色谱柱之类的，有的时候效果很好的说 : Originally posted by YOUNG11 at
3min是主要峰，吸收强度达到了4000,但好像是样品里的DMSO，不知道1微摩尔的样品能被检测出来吗？... 你的目标物&&254nm下有吸收不？如果有的话 可以开双波长检测器 220nm和254nm, DMSO 在254nm下基本没什么吸收，如果254下有吸收那很可能就是根本没保留，需要降低有机相的比例，如果254下没吸收那就直接100%有机相冲柱子，还是没有的话，那就是吸附了，可以考虑在水相或有机相里加些TFA再冲洗柱子 应该是没有保留，降低甲醇浓度，如果还不保留，只能根据化合物的性质再采取别的方法了，如离子对，混合柱等 DMSO用C18柱基本是没有保留的 我做多肽的时候会用到 10%的甲醇基本就洗脱了 lz应该做的是降低有机相比例 比如起始用100%的水 :hand: : Originally posted by swallow13 at
DMSO用C18柱基本是没有保留的 我做多肽的时候会用到 10%的甲醇基本就洗脱了 lz应该做的是降低有机相比例 比如起始用100%的水 :hand: 我做的不是多肽，就是普通的小分子，溶在含有0.1%的DMSO的PBS缓冲液中，C18柱可以用100%的水冲吗？压力会不会太大？没有保留是什么意思？是直接被冲出来，没有出峰吗？ 现在的C18柱基本都可以用纯水冲 压力没有问题 如果担心的话 可以用5%甲醇水 没有保留的意思就是DMSO没有办法挂柱 直接随流动相一起走出来了 但是只要物质有吸收就会有峰 只是出峰很快 应该是死体积、、、、 你的化合物极性过大，不适合用这个分离，可以降低甲醇比例至5%。也可以用HILIC分离，加酸碱都可以尝试下啊 谢谢各位的解答，我的问题已经解决了，问题出在我的化合物配的浓度太低，根本就没有检测到，我一直把3min出来的峰当成了我的东西，其实那是DMSO的峰。很低级的错误，写出来希望对其他人有所帮助，尤其是像我一样的菜鸟。:):pig: 改变甲醇这么多都在2.多分钟，真的可能是溶剂峰，主峰很有可能还没出来，你需要耐心等待。 同问！我用hplc反相柱分析，60%，55%，50%，40%分析，出峰时间有推迟，但是改变的很小，都平均延长0。7分钟，但是，我想要拖到7分钟，想要制备，但是，以前的师兄师姐没有做过极性这么大的，大概会是什么类型，以及我该用多少的甲醇水？我是做珊瑚分离提取的研一，求支援丁香客App是丁香园社区的官方应用，聚合了丁香园论坛和丁香客的精彩内容。医生可通过丁香客App浏览论坛，也可以在这个医生群集的关系网络中分享和互动，建立更广泛的学术圈子。
扫描二维码下载
今日：80 | 主题：269513
每发1个新帖可以获得0.5个丁当奖励
【讨论】流动相缓冲盐VS水
【讨论】流动相缓冲盐VS水
分享到哪里？
这个帖子发布于4年零85天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近注意到这样一个现象，各国药典中经常喜欢用缓冲盐做流动相，可是有的时候，用水代替缓冲盐，一样能出峰，而且峰形并不差。 这是为什么？ 我现在做方法开发就遇到这样的问题，EP，USP上都是以PH3.2的磷酸缓冲盐为流动相，我一开始也照做了，偶然的机会，我用水代替了缓冲盐，发现不但理论塔板数提高了，峰形变好了，而且其他如保留时间，峰面积啥的都没变。 这种情况下，我应该可以用水代替缓冲盐吧？
回复：【讨论】流动相缓冲盐VS水
分享到哪里？
你是不是认为他们有点多此一举？而感觉自己英明神武？建议多做做实验吧
回复：【讨论】流动相缓冲盐VS水
分享到哪里？
如果水能替代缓冲盐的话，当然水好。一个好的方法不仅是峰型好理论板数高……水的pH值范围较宽，色谱重现性方面较缓冲盐差，既然是缓冲盐，有一定的缓冲能力，对抗外界的变化还是较纯水强的。你这种情况，建议不要进行修改，毕竟起草药典保准的人也不傻，所以需要的是深挖改变带来的差异，不要局限与峰型好理论板数等，例如考虑杂质的检出情况等。
回复：【讨论】流动相缓冲盐VS水
分享到哪里？
作为药典标准，考虑的不仅仅是能不能检测的问题，还要考虑到该方法的普适性，经济性等。用纯水做流动相，对柱子要求较盐要高，经济成本上有压力个人观点！
回复：【讨论】流动相缓冲盐VS水
分享到哪里？
leonardo_yy 作为药典标准，考虑的不仅仅是能不能检测的问题，还要考虑到该方法的普适性，经济性等。用纯水做流动相，对柱子要求较盐要高，经济成本上有压力个人观点！真有你的楼主的意思是说水相部分是不是不用缓冲盐，而用纯水代替如果某方法的流动性只有水相，我以为纯水的成本要低点，盐不要钱啊？但是问题不在这里啊，朋友
回复：【讨论】流动相缓冲盐VS水
分享到哪里？
做有关物质时用水这个方法如何
关于丁香园&& 查看话题
HPLC测含量摸索流动相的问题
求助：HPLC同时测定复方中两种成分，分别是碱性物质和酸性物质，用过甲醇/乙腈-酸水、乙腈-磷酸盐流动相，但分离效果不好，请问流动相我接下来该采用什么思路摸索，哪位大神给建议，万分感激！
乙腈-磷酸盐流动相，加点磷酸调一下pH试试看。酸性、碱性物质，调pH是比较好的选择，不行再试试梯度。 你用的这两种物质是不是极性特别大啊，如果是的话就得在色谱柱上下功夫了，换个氨基柱估计会好点，方法上估计没什么突破，一般也就是缓冲盐-甲醇梯度洗脱 首先，楼主的酸性物质和碱性物质极性相差有多大？
极性大，可考虑氨基柱；
不大，可直接用磷酸盐缓冲液（PH4.0至6.5)-乙腈。 如果你用的是常规色谱柱的话，可能要好好摸索一下流动相的pH值，这个对酸碱物质的保留时间有影响。你可以结合物质的pKa，先调节pH保证一个呈分析态走一个试试，还可以试试梯度。 可以考虑用下离子对试剂，对碱性化合物的保留有帮助
不过离子对试剂对柱子伤害比较大，最好专柱专用 : Originally posted by 顾莫柔 at
首先，楼主的酸性物质和碱性物质极性相差有多大？
极性大，可考虑氨基柱；
不大，可直接用磷酸盐缓冲液（PH4.0至6.5)-乙腈。 太感谢了，一个pKa5，另一个是11，极性不大吧，生物碱和苷类，再次请求指点 : Originally posted by 星海慧儿 at
如果你用的是常规色谱柱的话，可能要好好摸索一下流动相的pH值，这个对酸碱物质的保留时间有影响。你可以结合物质的pKa，先调节pH保证一个呈分析态走一个试试，还可以试试梯度。 常规的反相C18，谢谢赐教，呵呵 : Originally posted by 头头 at
可以考虑用下离子对试剂，对碱性化合物的保留有帮助
不过离子对试剂对柱子伤害比较大，最好专柱专用 那相对于梯度洗脱呢？哪个对柱子伤害更大些？谢谢亲 : Originally posted by helious at
你用的这两种物质是不是极性特别大啊，如果是的话就得在色谱柱上下功夫了，换个氨基柱估计会好点，方法上估计没什么突破，一般也就是缓冲盐-甲醇梯度洗脱 生物碱和苷类，极性不大吧 : Originally posted by 痴夷子皮 at
乙腈-磷酸盐流动相，加点磷酸调一下pH试试看。酸性、碱性物质，调pH是比较好的选择，不行再试试梯度。 好的，受教了，谢谢 : Originally posted by helious at
你用的这两种物质是不是极性特别大啊，如果是的话就得在色谱柱上下功夫了，换个氨基柱估计会好点，方法上估计没什么突破，一般也就是缓冲盐-甲醇梯度洗脱 还想请教个问题，是甲醇-磷酸盐和乙腈-磷酸盐作为流动相什么不同，常见是用后者，为什么呢？ 选择秘诀1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。秘诀2： 三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。 秘诀3： 粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
1.流动相的性质要求
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选择流动相时应考虑以下几个方面：
①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
④粘度要低(应&2cp)。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。
2.流动相的pH值
采用反相色谱法分离弱酸(3≤pKa≤7)或弱碱(7≤pKa≤8)样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在;对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液;分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
]注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺(如三乙胺)又称为减尾剂或除尾剂。
(三乙胺triethylamine 氨分子中的氢原子被3个乙基取代的产物。分子式(CH3CH2)3N。易挥发的无色液体，有氨的气味。熔点-114.7℃，沸点89.3℃，相对密度 0.℃)。溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂。三乙胺有碱性，与无机酸能生成易溶于水的盐类。可由N，N- 二乙基乙酰氨与氢化铝锂反应制取，也可用乙醇胺进行气相烷基化反应合成。用于制橡胶硫化促进剂、润湿剂和杀菌剂等，也可用作溶剂和用于合成四级铵化合物。)
在选择缓冲液PH值之前，应先了解被分析物的Pka，高于或低于Pka两个PH值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰，从HH公式：PH=Pka+log(/)得知，溶液PH值高于或低于Pka两个单位，化合物中99%以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰。显示的是它的离子形式和中性化合物的转变，苯甲酸的Pka等于4.2，理论上由HH公示得知，当溶液PH值等于 2.2时，99%的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等于6.2时99%的苯甲酸以离子形式存在，所以当缓冲液PH值等于2.2时，中性化合物以羧酸形式保留于反相柱，表1列出了一般缓冲液和他们的缓冲范围。从表1知磷酸盐和柠檬酸盐缓冲液能用于PH值等于2.2。
当化合物只有氨基时，缓冲体系的选择十分简单，大多数氨基化合物在PH值小于9时都被质子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均适合应用，你也许会问水的PH值大约是7，为什么还用缓冲盐，因为缓冲盐有助于增加方法的可靠性，以及色谱峰的尖锐性，PH值的降低有助于氨基化合物保留的减弱，减小化合物与硅胶表面硅羟基的作用，而使峰更尖锐，从表1 可值，任何缓冲液均可应用于氨基化合物的分析，但我们认为PH值等于3的磷酸钾盐最适合用于氨基化合物的分析。
在上面两个例子中，PH=3的磷酸钾盐都能获得良好的应用，在一般情况下，它是含羧基和氨基化合物分析中最好的缓冲液，并且我们认为在氨基化合物分析中钾盐比钠盐更好。
希望对你有用。 楼主啊，方法开发不是在流动相上下功夫，你要在色谱柱上进行筛选。你一个酸性一个碱性，建议你尝试一下HILIC-NH2柱，例如waters XBridge Amide的柱子，不要老想着用反相进行分离或者加啥离子对，搞的太复杂了，调整思路吧！ : Originally posted by 王文静341 at
太感谢了，一个pKa5，另一个是11，极性不大吧，生物碱和苷类，再次请求指点... 一个是弱碱，一个是中强碱。流动相ph 调至2.7试试。 楼主不妨，初步设定一个色谱条件，进行1~7的pH，考察色谱峰的情况。进行pH筛选。&&
采用的溶剂不要降解API，溶剂的强度不要比流动相强---避免溶剂效应。
pH选择好之后，再进行进一步的优化。 也可以先将pH设定为2.0~2.5左右，抑制色谱柱内游离硅羟基导致的次级保留，
常规的流动相就是10mM~50mM的磷酸盐（pH2.5左右）：乙腈，先走梯度确定出峰的流动相强度，可在更改为相似强度的等度洗脱。 前提也是得保证样品在流动相中的稳定性。
含量的方法应该还好弄吧，最头大的是有关物质的方法开发。 我很好奇的问下，你的复方里既有酸性物质又有碱性物质，不会反应么，你这个复方能成么，你要不要先考虑下这个 : Originally posted by 顾莫柔 at
一个是弱碱，一个是中强碱。流动相ph 调至2.7试试。... 我调的pH是3，分开了，只是中强碱有拖尾，不过这个成分特点就是拖尾，正在考虑扫尾，非常感谢 : Originally posted by yi_wang at
选择秘诀1：由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。秘诀2： 三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量 ... 谢谢，很是受用&& 查看话题
HPLC测混标时，两个峰分不开，怎么调整洗脱比例呢？
做混标，分离γ-氨基丁酸和谷氨酸，两个峰分不开，要怎么调整洗脱比例呢？流速是0.7ml/min。求大神指教啊！！！
rotate_temp(2).jpg
相应文献很多，建议多看看文献，比如这个
/link?url=JKezzByD-61k6Oi3GFgzWxCauP2JBrx3dH7a_wP8mAUrVGUrELTg_jFkCmx6yAQ4TEoI5jr-fYEq4Xz0nPmdiQPXo7vwEnq38bsWsUZx3ki 建议提高流速，柱温不要太高，同时放缓梯度！ 你调节下缓冲盐的PH试试？ 调高pH试试。你用的磷酸缓冲液浓度和pH是多少的？ 感觉四氢呋喃没有必要&& 查看话题
流动相中水的比例增大，待检测物质的出峰时间问题
液相色谱中&&流动相中水的比例增大，待检测物质的出峰时间是延迟还是提前？？？
反相柱一般样品出峰会延后。 水含量增加，有机相减少，洗脱能力降低，出峰时间推迟。 反相疏水色谱，增加水比例，出峰推迟；反相亲水色谱，增加水比例，出峰提前 看你待测物质的极性，和柱子是反相柱还是正相柱的。 看LZ自己用的是什么色谱柱以及测物质的极性，一般来说，反相疏水色谱，增加水比例，出峰推迟；反相亲水色谱，增加水比例，出峰提前。