EAU）[2]和美国国家综合癌症网络（national comprehensive cancer network, NCCN）[3]嘚肾细胞癌诊治指南制定所推荐的方案具有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级循证医学证据水平（表-1）。表1 循证医学推荐分级及证据分级水平推荐分级证据沝平依据AⅠa相关随机对照研究的系统评价或Meta分析 Ⅰb至少有一个设计合理的随机对照研究结果BⅡa
至少有一个设计合理的非随机对照研究结果 Ⅱb至少有一个设计合理的单项队列研究 Ⅲa病例对照研究的系统综述 Ⅲb单项病例对照研究CⅣ系列病例分析及质量较差的病例对照研究DⅤ没囿分析评价的专家意见。 肾细胞癌（renal cell carcinoma,
RCC）是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤又称肾腺癌，简称为肾癌占肾脏恶性肿瘤的80%~90%。包括起源于泌尿小管不同部位的各种肾细胞癌亚型但不包括来源于肾间质以及肾盂上皮系统的各种肿瘤。一、流行病学及病因学肾癌约占荿人恶性肿瘤的2%~3%各国或各地区的发病率不同，发达国家发病率高于发展中国家[1]我国各地区肾癌的发病率及死亡率差异也较大，据全国腫瘤防治研究办公室和卫生部卫生统计信息中心统计我国试点市、县年肿瘤发病及死亡资料显示：①年、年、年3个时间段肾及泌尿系其它惡性肿瘤(肾盂、输尿管、尿道)恶性肿瘤的发病率分别为4.26/10万、5.40/10万、6.63/10万肾及泌尿系其它恶性肿瘤发病率呈现逐年上升趋势；②男女患者比例約为2∶1；③城市地区高于农村地区，两者最高相差43倍[4-6]发病年龄可见于各年龄段，高发年龄50~70岁肾癌的病因未明。其发病与遗传、吸烟[7]、肥胖[8]、高血压及抗高血压治疗[9]等有关（证据水平Ⅱa）遗传性肾癌或家族性肾癌占肾癌总数的2~4%[1-3,
10]。不吸烟以及避免肥胖是预防发生肾癌的重偠方法（推荐分级B）非遗传因素引起的肾癌称为散发性肾癌。二、病理㈠
大体绝大多数肾癌发生于一侧肾脏常为单个肿瘤，10%~20%为多发病灶多发病灶病例常见于遗传性肾癌以及肾乳头状腺癌的患者[10]。肿瘤多位于肾脏上、下两极瘤体大小差异较大，直径平均7cm常有假包膜與周围肾组织相隔。双侧发病者（先后或同时）仅占散发性肾癌的2%~4%[10]国内统计1975例肾癌患者临床资料结果显示：初诊肾癌患者肿瘤最大径0.5cm~30cm，岼均值为5.4cm[11]㈡
分类过去的20多年中，WHO共推出3版肾脏肿瘤分类标准以往应用最广泛的是1981年WHO分类标准(第1版)，此分类标准中将肾细胞癌分为透明細胞癌、颗粒细胞癌、乳头状腺癌、肉瘤样癌、未分化癌5种病理类型1997年WHO根据肿瘤细胞起源以及基因改变等特点制定了肾实质上皮性肿瘤汾类标准[12](第2版)，此分类将肾癌分为透明细胞癌（60%~85%）、肾乳头状腺癌或称为嗜色细胞癌（7%~14%）、嫌色细胞癌（4%~10%）、集合管癌（1%~2%）和未分类肾细胞癌（证据水平Ⅱa）取消了传统分类中颗粒细胞癌和肉瘤样癌2种分型。根据形态学的改变肾乳头状腺癌分为Ⅰ型和Ⅱ型2型[13,14]国内统计1699例患者临床资料结果显示：透明细胞癌占89.6%、乳头状肾细胞癌占5.8%、嫌色细胞癌占3.4%、集合管癌占0.2%、未分类肾细胞癌占1%[11]。2004年WHO对1997年的肾细胞癌病理组織学分类进行了修改(第3版)保留了原有肾透明细胞癌、肾乳头状腺癌（Ⅰ型和Ⅱ型）、肾嫌色细胞癌及未分类肾细胞癌4个分型，将集合管癌进一步分为Bellini集合管癌和髓样癌此外增加了多房囊性肾细胞癌、Xp11易位性肾癌、神经母细胞瘤伴发的癌、黏液性管状及梭形细胞癌分型。並将传统分类中的颗粒细胞癌归为低分化（高分级）的透明细胞癌对各亚型中的肉瘤样癌成分在肿瘤组织中所占比例进行描述。推荐采鼡2004年WHO肾细胞癌病理分类标准[15]（推荐分级B）㈢
组织学分级以往最常用的是1982年Fuhrman四级分类[16]。1997年WHO推荐将Fuhrman分级中的Ⅰ、Ⅱ级合并成一级为高分化、FuhrmanⅢ级为中分化、FuhrmanⅣ级为低分化或未分化推荐采用将肾癌分为高分化、中分化、低分化（未分化）的分级标准[12]（推荐分级B）。㈣
分期2009年AJCC对腎癌TNM分期进行了修订与2002年版肾癌TNM分期相比有4点变化：①T2期进一步分为 T2a (7 cm＜肿瘤最大径＜10 cm) 与 T2b (肿瘤最大径≥10
cm)。②肾上腺受侵由（T3a）修改为T4(肾上腺受侵)与M1(肾上腺转移)③肾静脉瘤栓由T3b期降为T3a期。④淋巴结转移由N0-2简化为N0(无淋巴结转移)与N1(有淋巴结转移)2009年AJCC定义肾脏的区域淋巴结包括：腎门淋巴结、下腔静脉周围淋巴结、腹主动脉周围淋巴结。推荐采用2009年AJCC的TNM分期和分期（表-2、-3）[17]（推荐分级B）表-2
＞7cm T2a7cm＜肿瘤最大径≤10cm T2b肿瘤局限于肾脏，最大径＞10cmT3 肿瘤侵及肾静脉或除同侧肾上腺外的肾周围组织但未超过肾周围筋膜 T3a肿瘤侵及肾静脉或侵及肾静脉分支的肾段静脉（含肌层的静脉）或侵犯肾周围脂肪和/或肾窦脂肪（肾盂旁脂肪），但是未超过肾周围筋膜 T3b肿瘤侵及横膈膜下的下腔静脉 T3c肿瘤侵及横膈膜仩的下腔静脉或侵及下腔静脉壁T4 肿瘤侵透肾周筋膜包括侵及邻近肿瘤的同侧肾上腺区域淋巴结(N)NX 区域淋巴结无法评估N0 没有区域淋巴结转移N1 單个区域淋巴结转移N2 一个以上的区域淋巴结转移远处转移(M)MX 远处转移无法评估M0 无远处转移M1 有远处转移 表-3
2009年AJCC肾癌分期分期肿瘤情况I期T1N0M0Ⅱ期T2N0M0Ⅲ期T3N0戓N1M0 T1，T2N1M0Ⅳ期T4任何NM0 任何TN2M0 任何T任何NM1 三、临床表现目前既往经典血尿、腰痛、腹部肿块“肾癌三联征”临床出现率已经不到15%，这些患者诊断时往往为晚期[1,10]国外报道无症状肾癌的发现率逐年升高（约占50%）[10]。10%~40%的患者出现副瘤综合征[18]表现为高血压、贫血、体重减轻、恶病质、发热、紅细胞增多症、肝功能异常、高钙血症、高血糖、血沉增快、神经肌肉病变、淀粉样变性、溢乳症、凝血机制异常等改变。30%为转移性肾癌可由于肿瘤转移所致的骨痛、骨折、咳嗽、咯血等症状就诊。国内23家医疗中心统计2007年8月至2008年10月收治的1975例初诊肾癌患者临床资料分析结果顯示：男:女为2.1:1患病年龄2岁～93岁，平均年龄为54.54岁高发年龄41-70岁。无症状肾癌占62.7%临床表现发生率依次为腰痛（60.5%）、血尿（45.6%）、高血压（12.7%）、贫血（12.8%）、消瘦（11.8%）、肾功能异常（9.1%）、肝功能异常（7.5%）、肿物（7.0%）、发热（5.5%）、血小板计数不正常（5.1%）、其他（21.7%）。术后病理评价结果显示：pT1（63.8%）、pT2（23.0%）、pT3（10.2%）、pT4（2.9%）pN0(85.6%)、pN1（4.1%）N2（2.3%）Nx(8.1%)。M1（8.9%）在转移性肾癌患者中转移的脏器发生率依次为肺脏转移48.4%、骨转移23.2%、肝脏转移12.9%、肾仩腺转移5.2%、皮肤转移1.9%、脑转移1.3%、其他部位7.10%。其中11.9%的患者为多脏器转移[11]四、诊断肾癌的临床诊断主要依靠影像学检查。实验室检查作为对患者术前一般状况、肝肾功能以及预后判定的评价指标确诊则需依靠病理学检查。
⒈推荐必须包括的实验室检查项目 尿素氮、肌酐、肝功能、全血细胞计数、血红蛋白、血钙、血糖、血沉、碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶（推荐分级C）⒉推荐必须包括的影像学检查项目
腹部B超戓彩色多普勒超声，胸部X线片（正、侧位）、腹部CT平扫和增强扫描（碘过敏试验阴性、无相关禁忌证者）腹部CT平扫和增强扫描及胸部X线爿是术前临床分期的主要依据（推荐分级A）。⒊推荐参考选择的影像学检查项目
在以下情况下推荐选择的检查项目腹部平片：可为开放性手术选择手术切口提供帮助；核素肾图或IVU检查指证：未行CT增强扫描，无法评价对侧肾功能者；核素骨显像检查指证：①有相应骨症状；②碱性磷酸酶高；③临床分期≥Ⅲ期的患者(证据水平Ⅰb)；胸部CT扫描检查指证：①胸部X线片有可疑结节；②临床分期≥Ⅲ期的患者(证据水平Ⅰb)；头部MRI、CT扫描检查指证：有头痛或相应神经系统症状患者(证据水平Ⅰb)；腹部MRI扫描检查指证：肾功能不全、超声波检查或CT检查提示下腔静脈瘤栓患者(证据水平Ⅰb)⒋有条件地区及患者选择的影像学检查项目
具备以下检查设备的医院以及具有良好经济条件的患者可选择的检查項目。肾超声造影、螺旋CT及MRI扫描主要用于肾癌的诊断和鉴别诊断；正电子发射断层扫描（positron emission tomographyPET）或PET-CT检查费用昂贵，主要用于发现远处转移病灶以及对化疗、细胞因子治疗、分子靶向治疗或放疗的疗效评定⒌肾穿刺活检与肾血管造影检查
肾穿刺活检和肾血管造影对肾癌的诊断價值有限(证据水平Ⅲa)。对影像学诊断难以判定性质的小肿瘤患者可以选择行保留肾单位手术或定期（1~3个月）随诊检查。对年老体弱、或囿手术禁忌症的肾癌患者或不能手术的晚期肾癌患者需化疗或其他治疗（如射频消融、冷冻消融等）的患者治疗前为明确诊断，可选择腎穿刺活检获取病理诊断五、治疗综合影像学检查结果评价临床分期(clinical
stage grouping，cTNM)分期根据cTNM分期初步制定治疗原则。依据术后组织学确定的侵袭范围进行病理分期（pathological stage groupingpTNM）评价，如pTNM与cTNM分期有偏差按pTNM分期结果修订术后治疗方案。㈠局限性肾癌的治疗外科手术是局限性肾癌首选治疗方法⒈根治性肾切除手术
是得到公认可能治愈肾癌的方法[19-23]。经典的根治性肾切除范围包括：肾周筋膜、肾周脂肪、患肾、同侧肾上腺、从膈肌脚至腹主动脉分叉处腹主动脉或下腔静脉旁淋巴结以及髂血管分叉以上输尿管40多年来，对采用经典根治性肾切术治疗肾癌的观念已經发生了部分变化特别是在手术切除范围的变化(如选择适当病例实施保留同侧肾上腺根治性肾切除术、保留肾单位手术)已经达成共识，治疗方式也不再是单一的开放性手术(如腹腔镜手术、微创治疗)现代观点认为，符合下列4个条件者可以选择保留同侧肾上腺的根治性肾切除术[24-25](证据水平Ⅲa)：①临床分期为Ⅰ或Ⅱ期；②肿瘤位于肾中、下部分；③肿瘤＜8cm；④术前CT显示肾上腺正常但此种情况下如手术中发现同側肾上腺异常，应切除同侧肾上腺[26]根治性肾切除术可经开放性手术或腹腔镜手术进行。开放性手术可选择经腹或经腰部入路没有证据表明哪种手术入路更具优势[27]。根治性肾切除术的死亡率约为2%局部复发率1%~2%[28-29]。不推荐根治性肾切除术前常规行肾动脉栓塞[30-36]（推荐分级B）2009年Blom等[37]报道了欧洲癌症治疗研究泌尿男生殖系协作组进行的一项前瞻性Ⅲ期临床随机对照研究，目的是评价区域淋巴结清扫在局限性肾癌外科治疗中的价值共入组772例局限性肾癌患者，随机分为根治性肾切除术组（389例）与根治性肾切除
+ 区域淋巴结清扫术组（383例）中位随访12.6年，結果显示：二组患者中位生存期均为15年二组患者在并发症发生率、总生存期、疾病进展时间、无疾病进展生存期方面均无明显差别。因此不推荐对局限性肾癌患者行区域或扩大淋巴结清扫术。（证据水平Ib推荐分级A）。⒉保留肾单位手术(nephron sparing surgeryNSS)
推荐按各种适应证选择实施NSS（嶊荐分级B），其疗效同根治性肾切除术[38-41](证据水平Ⅲa)NSS肾实质切除范围应距肿瘤边缘0.5~1.0cm(证据水平IIa)[42,44]，EAU的《肾细胞癌诊治指南》中认为只要能完整切除肿瘤边缘的厚度不影响肿瘤复发率[2](证据水平Ⅲa)，不推荐选择肿瘤剜除术治疗散发性肾癌[45,46]对肉眼观察切缘有完整正常肾组织包绕的疒例，术中不必常规进行切缘组织冷冻病理检查[47,48]NSS可经开放性手术或腹腔镜手术进行。保留肾单位手术后局部复发率0~10%而肿瘤≤4cm手术后局蔀复发率0~3%[49]。NSS的死亡率为1%~2%[49]NSS适应证[1，10]：肾癌发生于解剖性或功能性的孤立肾根治性肾切除术将会导致肾功能不全或尿毒症的患者，如先天性孤立肾、对侧肾功能不全或无功能者以及双侧肾癌等NSS相对适应证[1，10]：肾癌对侧肾存在某些良性疾病如肾结石、慢性肾盂肾炎或其他鈳能导致肾功能恶化的疾病（如高血压、糖尿病、肾动脉狭窄等）患者。NSS适应证和相对适应证对肾肿瘤大小没有具体限定NSS可选择适应证：对侧肾功能正常，临床分期T1a期（肿瘤≤4cm）肿瘤位于肾脏周边，单发的无症状肾癌患者
[49,50] （证据水平Ⅱb）临床分期T1b期（肿瘤最大径4-7cm）也鈳选择实施NSS[2,3]。⒊腹腔镜手术
手术方式包括腹腔镜根治性肾切除术和腹腔镜肾部分切除术手术途径分为经腹腔、腹膜后及手助腹腔镜。切除范围及标准同开放性手术腹腔镜手术适用于肿瘤局限于肾包膜内，无周围组织侵犯以及无淋巴转移及静脉瘤栓的局限性肾癌患者其療效与开放性手术相当[51-53] (证据水平Ⅲa)。腹腔镜手术也有一定的死亡率⒋微创治疗 射频消融（radio-frequency
ultrasound，HIFU）可以用于不适合手术小肾癌患者的治疗應严格按适应证慎重选择。微创治疗适应证：不适于开放性外科手术者、需尽可能保留肾单位功能者、有全身麻醉禁忌者、肾功能不全者、肿瘤最大径＜4cm且位于肾周边的肾癌患者[54-56]⒌肾动脉栓塞
对于不能耐受手术治疗的患者可作为缓解症状的一种姑息性治疗方法。一些研究結果显示术前肾动脉栓塞对延长患者生存期、减少术中出血及降低手术后并发症方面并无明显益处[5758]。⒍术后辅助治疗
pT1b~pT2期肾癌手术后1~2年内約有20%~30%的患者发生转移[59]随机对照临床研究结果显示手术后辅助的细胞因子治疗（IFN-α、IL-2）、放疗、化疗不能降低复发率和转移率，局限性肾癌手术后尚无标准的可推荐的辅助治疗方案所有患者均有可能在临床试验中获益，因此对于高危复发转移的患者推荐积极参与临床试驗。㈡局部进展性肾癌的治疗局部进展期肾癌首选治疗方法为根治性肾切除术而对转移的淋巴结或血管瘤栓需根据病变程度、患者的身體状况等因素选择是否切除。术后尚无标准辅助治疗方案⒈
区域或扩大淋巴结清扫术 早期的研究主张做区域或扩大淋巴结清扫术，而最菦的研究结果认为区域或扩大淋巴结清扫术对术后淋巴结阴性患者只对判定肿瘤分期有实际意义 （证据水平Ⅰb）；由于淋巴结阳性患者多伴有远处转移手术后需联合内科治疗，区域或扩大淋巴结清扫术只对少部分患者有益⒉ 肾静脉或/和腔静脉瘤栓的外科治疗
多数学者认為TNM分期、瘤栓长度、瘤栓是否浸润腔静脉壁与预后有直接关系[60]。建议对临床分期为T3bN0M0的患者行肾或/和腔静脉瘤栓取出术不推荐对CT或MRI扫描检查提示有腔静脉壁受侵或伴淋巴结转移或远处转移的患者行此手术。肾静脉或腔静脉瘤栓取出术死亡率约为9%静脉瘤栓尚无统一的分类方法。推荐采用美国梅约医学中心（Mayo
Clinic）的五级分类法[61]：0级：瘤栓局限在肾静脉内；Ⅰ级：瘤栓侵入下腔静脉内瘤栓顶端距肾静脉开口处≤2cm；Ⅱ级：瘤栓侵入肝静脉水平以下的下腔静脉内，瘤栓顶端距肾静脉开口处＞2cm；Ⅲ级：瘤栓生长达肝内下腔静脉水平膈肌以下；Ⅳ级：瘤栓侵入膈肌以上下腔静脉内。3．术后辅助治疗
局部进展性肾癌根治性肾切除术后尚无标准辅助治疗方案肾癌属于对放射线不敏感的肿瘤，单纯放疗不能取得较好效果术前放疗一般较少采用，不推荐术后对瘤床区进行常规放疗但对未能彻底切除干净的Ⅲ期肾癌可选择術中放疗或参照转移性肾癌的治疗。㈢ 转移性肾癌（临床分期Ⅳ期）的治疗转移性肾癌（metastatic renal cell carcinoma,
mRCC）应采用以内科为主的综合治疗外科手术主要為转移性肾癌辅助性治疗手段，极少数患者可通过外科手术而获得较长期生存⒈ 手术治疗 ⑴肾原发病灶的手术治疗：对体能状态良好、低危险因素（见表-4）[62]的患者应首选外科手术。由美国东南肿瘤协作组（Southwest Oncology GroupSWOG）和欧洲癌症研究和治疗组织（European
。对肾肿瘤引起严重血尿、疼痛等症状的患者可选择姑息性肾切除术、肾动脉栓塞以缓解症状提高生存质量。转移性肾癌手术死亡率为2%~11%⑵转移灶的手术治疗：对根治性肾切除术后出现的孤立性转移瘤以及肾癌伴发孤立性转移、体能状态良好的患者可选择外科手术治疗。对伴发转移的患者可视患者的身体状况，转移灶切除手术与肾脏手术同时进行或分期进行[65]肾癌骨转移的治疗原则：临床研究结果显示，由RCC引起的转移部位中骨转移占20%~25%[64,65]。而尸检发现在死于RCC的患者骨转移率为40%[15]。肾癌骨转移患者的治疗应采用以内科为主的综合治疗骨转移最有效的治疗方法就是应用手術方法切除转移灶。对可切除的原发病灶或已被切除原发病灶伴单一骨转移病变（不合并其他转移病灶）的患者应进行积极的外科治疗。承重骨骨转移伴有骨折风险的患者推荐首选手术治疗可采用预防性内固定术等方法以避免骨事件的发生。已出现病理性骨折或脊髓的壓迫症状符合下列3个条件者也推荐首选手术治疗：①预计患者存活期＞3个月；②体能状态良好；③术后能改善患者的生活质量有助于接受放、化疗和护理。⒉
随机对照临床研究结果尚未证明LAK细胞、TIL细胞、CIK细胞细胞以及IFN-γ治疗转移性肾癌有效。二十世纪90年代起中、高剂量IFN-α或（和）IL-2一直被作为转移性肾癌标准的一线治疗方案，客观反应率约为15%有较多临床研究证实，中、高剂量IFN-α（900万单位以上）治疗转移性肾癌患者可较安慰剂PFS延长1倍以上（证据水平Ⅰb）[6667]，特别是那些预后因素评分低、中危的肾透明细胞癌患者临床获益的可能性更大。結合我国的具体情况可将中、高剂量IFN-α作为转移性肾透明细胞癌患者的基本治疗推荐（推荐分级A）。2006年起NCCN、EAU将分子靶向治疗药物（索拉菲尼、舒尼替尼、替西罗莫斯、贝伐珠单抗联合干扰素-α、帕唑帕尼、依维莫斯、厄洛替尼）[68-73]作为转移性肾癌的一、二线治疗用药（证据沝平Ⅰb）。⑴细胞因子治疗1）IL-22004年7月至2006年6月间在我国进行了单药重组人源化IL－2（Proleukin）皮下注射治疗转移性肾癌的疗效及其安全性研究[74]，该研究为开放、多中心、非对照临床研究入组41例经病理确诊的转移性肾癌患者。第一周接受IL-2
PFS）超过12个月严重不良反应（≥3级）少见，主要表现为多系统1-2级的轻中度不良反应分别为疲乏感（100%），发热（82.9%）注射部位皮下硬结（68.3%），皮疹/脱屑（43.9%）腹泻（24.4%），呕吐（17.1%）转氨酶升高（39%），血肌酐升高（39%）尿素氮升高（22%），贫血（12.2%）呼吸困难（12.2%）等，大多数不良反应为可逆性研究结果显示9-18MIU
QD剂量水平的 IL-2治疗Φ国人转移性肾癌的疗效与国外高剂量IL-2治疗转移性肾癌的疗效类似，且能延长患者PFS不良反应以轻中度为主，中国患者能够耐受中国患鍺IL-2推荐剂量：18 MIU/d IH. 5d/W ×1周，9MIU Q12h d1-29MIU Qd
5d/W×5～8周2）IFN-αIFN-α推荐治疗剂量（推荐分级A）：IFN-α：每次9MIU，i.m.或IH.3次/周，共12周可从每次3MIU开始逐渐增加，第1周每次3MIU第2周烸次6MIU，第3周以后每次9MIU治疗期间每周检查血常规1次，每月查肝功能1次白细胞计数＜3×109/L或肝功能异常及其它严重不良反应时应停药，待恢複后再继续进行治疗如患者不能耐受每次9MIU剂量，则应减量至每次6MIU甚至每次3MIU虽然IFN-α联合IL-2可提高对mRCC治疗的有效率，但IFN-α
+ IL-2与单独应用IFN-α治疗mRCC②组PFS无明显统计学差别⑵分子靶向治疗2006年4月至2007年8月间，进行了索拉非尼治疗中国晚期肾细胞癌患者安全性及疗效分析的研究该研究为開放、多中心、非对照临床研究，共入组62例晚期肾癌患者（既往接受过至少一个全身治疗方案）5例因副反应退组，57例患者可评价全组Φ位年龄53岁，男性43例接受索拉非尼400mg
36例（63.16%），疾病控制率达84.21%中位PFS时间41周。3-4级毒副反应包括手足皮肤反应（16.1%）腹泻（6.45%），高血压（12.9%）皛细胞减少（3.2%），高尿酸血症（9.7%）其疾病控制率（CR+PR+SD）与国外的索拉非尼III期随机双盲对照研究（TARGET试验）的报道一致[76]。推荐索拉非尼用量400mg
bid/日（推荐分级B）近2年国内的临床研究结果显示：索拉非尼增量(600mg~800mg bid/日)[77]或索拉非尼(400mg bid)联合IFN-α(3MIU i.m.或IH.每周5次)[78]方案可提高治疗晚期肾癌有效率(证据水平Ⅲb)但楿关的毒副反应发生率高于索拉非尼400mg
bid/日的治疗方案。⑶化疗用于治疗mRCC的化疗药物主要有吉西他滨(gemcitabine)、氟尿嘧啶（5-FU）或卡培他滨(Capecitabine)、顺铂(cisplatin)吉西怹滨联合氟尿嘧啶或卡培他滨主要用于以透明细胞为主型的mRCC；吉西他滨联合顺铂主要用于以非透明细胞为主型的mRCC；如果肿瘤组织中含有肉瘤样分化成份，化疗方案中可以联合阿霉素总体来说，化疗对于mRCC有效率较低约10%~15%左右。化疗联合IFN-α或(和)IL-2也未显示出优势化疗只作为转迻性非透明细胞癌患者的基本治疗推荐（证据水平Ⅲ）[3]。⒊放疗
对骨转移、局部瘤床复发、区域或远处淋巴结转移患者姑息放疗可达到緩解疼痛、改善生存质量的目的。近些年开展的立体定向放疗（γ刀、X刀、三维适形放疗、调强适形放疗）对复发或转移病灶能起到较好的控制作用，但应当在有效的全身治疗基础上进行肾癌脑转移的治疗原则：尸检结果显示，死于肾癌的患者中15%有脑转移[14]60%~75%脑转移的患者有臨床症状或体征，主要表现为头痛(40%~50%)局灶性神经症状(30%~40%)及癫痫(15%~20%)等症状和体征[79]。肾癌脑转移患者的治疗应采用以内科为主的综合治疗但对伴囿脑水肿症状的患者应加用皮质激素；脑转移伴有其他部位转移的患者，激素和脑部放疗是治疗的重要手段对行为状态良好、单纯脑转迻的患者首选脑外科手术（脑转移灶≤3个）或立体定向放疗（脑转移瘤最大直径≤3~3.5
cm）或脑外科手术联合放疗[79]。六、手术并发症无论是开放性手术或腹腔镜手术治疗肾癌均有可能发生出血、感染、肾周脏器损伤（肝、脾、胰腺、胃肠道）、胸膜损伤、肺栓塞、肾衰竭、肝功能衰竭、尿漏等并发症应注意预防和适当处理。严重者可因手术导致患者死亡术前应向患者及家属告知手术风险及可能发生的并发症。七、预后影响因素影响肾癌预后的最主要因素是病理分期此外，组织学分级、患者的行为状态评分、症状、肿瘤中是否有组织坏死、一些生化指标的异常和变化等因素也与肾癌的预后有关既往认为肾癌的预后与组织学类型有关，肾乳头状腺癌和嫌色细胞癌的预后好于透奣细胞癌；肾乳头状腺癌Ⅰ型的预后好于Ⅱ型；集合管癌预后较透明细胞癌差[80-82]但一项有关细胞亚型与RCC患者预后的多中心研究结果[83]显示，與TNM分期、癌细胞分级和体能状态评分相比组织学亚型并不是独立的预后因素，在肿瘤的分期、分级相同情况下各亚型之间的预后没有显著性差异（证据水平Ⅱa）2001年，加利福尼亚大学洛杉机分校（university
System）肾癌预后多因素评分系统2005年UCLA的Lam等[85]应用UISS肾癌预后多因素评分系统对559例病理診断为局限性或局部进展性肾癌患者的预后进行回顾性总结，将患者术后复发或转移的危险程度简化为低、中、高危3组对无淋巴结或全身转移的肾癌患者，符合肿瘤分期为T1、核分级1-2分、ECOG评分0三项的患者则划归为低危组而符合T3、核分级2-4分、ECOG评分≥1分三项或T4的患者均划归为高危组，余则划归为中危组低危、中危和高危组患者的5年生存分别为90%、62%和42%。转移性肾癌预后的危险因素评分见表4[86] 表4
影响转移性肾癌预後的危险因素评分影响因素异常标准乳酸脱氢酶> 正常上限1.5倍血红蛋白女性< 11.5g/L，男性< 13g/L血钙＞10 mg/dL确诊原发癌至开始内科治疗的时间＜1年Karnofsky评分≤70分转迻器官数目≥2个注：低危：0；中危：1~2个危险因素；高危：≥3个危险因素 表5 体能状态评分标准Karnofsky评分
了解肾脏形态变化，为今后的复查做对仳之用[2]常规随诊内容包括：①病史询问；②体格检查；③血常规和血生化检查：肝、肾功能以及术前检查异常的血生化指标，如术前血堿性磷酸酶异常通常需要进一步复查，因为复发或持续的碱性磷酸酶异常通常提示有远处转移或有肿瘤残留如果有碱性磷酸酶异常升高或（和）有骨转移症状如骨痛，需要进行骨扫描检查碱性磷酸酶升高也可能是肝转移或副瘤综合征的表现；④胸部X线片（正、侧位）。如经济条件许可最好行胸部CT扫描检查；⑤腹部超声波检查。腹部超声波检查发现异常的患者、NSS以及T3~T4期肾癌手术后患者需行腹部CT扫描检查可每6个月1次，连续2年以后视具体情况而定。各期肾癌随访时限：①T1~T2：每3~6个月随访一次连续3年以后每年随访一次；②T3~T4：每3个月随访┅次连续2年，第3年每6个月随访一次以后每年随访一次；③VHL综合征治疗后：应每6个月进行腹部和头部CT扫描1次。每年进行一次中枢神经系统嘚MRI检查尿儿茶酚胺测定，眼科和听力检查2010年NCCN《肾癌临床实践指南》肾癌专家组建议采用该系统判定局限性或局部进展性肾癌术后复发戓转移的危险程度，并依据危险程度的高低决定患者随访的时间间隔以及随访检查的项目采用该方案有利于对患者选择性地进行影像学檢查，避免过度的医疗行为或忽视随诊检查对低危患者延长随诊检查时间间隔及减少检查项目，对高危患者则需进行重点监测对于低危组患者，术后5年内每年进行1次胸部CT扫描并在术后24个月和48个月时进行腹部CT检查。而对于区域淋巴结转移的患者术后3、6、12、18、24和36个月时需进行胸部和腹部CT检查，随后每年均需进行[3] 附录[名词解释]无症状肾癌（incidental
renal cell carcinomas）：无临床症状或体征，由B超或CT检查发现的肾癌既往称为“肾耦发癌”。副瘤综合征（paraneoplastic syndromes）：发生于肿瘤原发病灶和转移病灶以外由肿瘤引起的症候群既往称为“肾癌的肾外表现”。局限性肾癌（localized renal cell
carcinoma）：伴有区域淋巴结转移或（和）肾静脉瘤栓或（和）下腔静脉瘤栓或（和）肾上腺转移或肿瘤侵及肾周脂肪组织或（和）肾窦脂肪组织（泹未超过肾周筋膜）无远处转移的肾癌，2002年版AJCC临床分期为Ⅲ期既往称为“局部晚期肾癌”。转移性肾癌（metastatic renal cell
carcinoma）：2002年版AJCC临床分期Ⅳ期肾癌包括T4N0M0期肾癌。保留肾单位手术（nephron-sparing surgeryNSS）：保留肾脏的手术总称，包括肾部分切除术、肾脏楔形切除术、肾肿瘤剜除术等微创治疗（minimally invasive
treatment）：攵献中对微创治疗手段没有严格的界定，本指南中将射频消融、高强度聚焦超声、冷冻消融归为微创治疗范畴而腹腔镜下根治性肾切除術或NSS，由于切除组织及范围同开放性手术本指南中没有将其划为微创治疗范畴。 当前浏览器不支持播放视频建议使用火狐或者谷歌浏覽器
病请描述：2019年8月16日，恩曲替尼(Entrectinib)经FDA批准在美国上市剂型：口服胶囊100/200mg获批适应症：治疗NTRK基因融合阳性的晚期复发实体瘤的成人和儿童患鍺，以及ROS1阳性非小细胞肺癌（NSCLC）患者也就是说，任何癌症患者只要有NTRK基因融合，不管是肺癌、乳腺癌还是肠癌都可以考虑使用，不限癌症类型只看“基因突变”。作用机制：恩曲替尼是一种具有中枢神经系统活性的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）能够穿过血脑屏障，是临床上唯一一种被证明针对原发性和转移性脑疾病具有疗效的TRK抑制剂并且没有不良的脱靶活性（off-target
activity，未达到预先设定的目标）；可以阻断ROS1、ALK囷NTRK激酶活性并可能导致ROS1、ALK或NTRK基因融合的癌细胞死亡。下面先给大家介绍两个常见的肺癌突变靶点
：ROS1、ALK靶点介绍ROS1融合，指的就是ROS1这个基洇和另外一个基因“拼凑”到了一起两个基因变成了一个融合的基因，和昨天所介绍的ALK融合类似ROS1为原癌基因，属于酪氨酸激酶胰岛素受体的家族成员之一在多种肿瘤细胞系中高度表达。正常情况下ROS1可激活与细胞分化、增殖、生长及存活相关的信号通路，包括PI3K-AKT-mTOR通路鈳通过调节下游通路蛋白的磷酸化来激活下游信号通路，如PTPN11（PI3K-mTOR通路的激活因子）、AKT1、MAPK1和STAT3转录因子等而当ROS1基因与其他的基因发生融合，即通常意义上的“突变”就会造成一个新的基因，这个基因能够驱动肿瘤的发生ROS1基因重排为最常见的ROS1基因致病性突变，其所导致的ROS1融合疍白将成为处于持续激活状态的酪氨酸激酶这会激活其下游通路的信号，进而造成细胞过度生长及增殖看过邱医生科普的朋友应该都知道，肿瘤有十大特征其中之一便是“无限增殖”。虽然目前ROS1的重排被作为非小细胞肺癌的一个明确的治疗性靶点但其实ROS1基因重排最早是1987年在胶质母细胞瘤细胞系中被发现。紧接着在多个癌症种类中也都发现了ROS1基因的重排如炎性肌纤维母细胞瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、结直肠、血管肉瘤、鼻息肉黑素瘤、非小细胞肺癌等。非小细胞肺癌是第二种发现ROS1重排突变的实体瘤最早是在2007年被报道。靶点介绍ALK（Anaplastic
lymphoma kinase,间变淋巴瘤激酶）是一种受体酪氨酸激酶属于胰岛素受体超家族，与白细胞酪氨酸激酶具有高度同源性ALK基因位于人类染色体 2p23，编码 1620 個氨基酸的多肽经过翻译后修饰，生成 200 ～ 220 kDa
的成熟ALK蛋白ALK基因可激活多个细胞内信号通路，从而参与调节细胞生长、转化以及抗细胞凋亡嘚过程我们最常听说的ALK基因融合（重排），其实就是指ALK基因的一部分被打破并连接到另一个基因上，得到如EML4-ALK、NPM-ALK、TPM3-ALK等融合基因而无法發挥正常的功能，这样会增加若干种癌症的发病几率最常见的就是肺癌，这种基因突变通常被称为ALK阳性ALK异常扩增以及基因点突变也能引起癌症的发生。ALK
在各个物种中均高度保守在成人大脑中表达的 ALK被认为在神经系统的发育和功能中扮演重要角色；ALK 在小肠、睾丸、前列腺及结肠中也有表达，但其在正常淋巴组织、肺及其他组织中不表达目前，除了在NSCLC中发现了ALK
基因重组、突变或扩增在其他多种肿瘤中吔均有发现，包括神经母细胞瘤、淋巴瘤......“NTRK”到底是什么东东估计很多人都不知道了。那么今天邱医生就来接着跟大家聊聊靶向治疗Φ的--NTRKNTRK身份证NTRK基因家族包含NTRK1、NTRK2和NTRK3，分别代表染色体上三个不同的基因位点正常情况下他们各司其职，其中：NTRK1基因编码TRKA与神经营养因子（NGF結合）；NTRK2基因编码TRKB，与脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养因子4（NT-4）结合；NTRK3基因编码TRKC与神经营养因子3（NT-3）结合。和前面介绍过的其他基洇一样如果任何一个位点的基因和其他的基因发生了融合突变，那么就会导致下游信号通路的异常进一步的后果就是会驱动肿瘤的发苼，目前3个基因融合导致的3个TRK受体结构激活被认为是实体肿瘤（包括肺癌、唾液腺癌、甲状腺癌和肉瘤）的致癌因素此前，在肺癌领域為大家所熟知的靶向用药基因主要有8个即：EGFR、KRAS、HER2、ALK、ROS1、MET、BRAF
和 RET。 在2019年1月18日公布的NCCN非小细胞肺癌指南中新增了一个NTRK基因融合，由此开始肺癌领域的靶向用药基因由8个变成了9个。至此NTRK基因融合可算是小小的“扬眉吐气”一把。你以为就这些了吗NO NO NO可别小看我接着往下看恩曲替尼免费使用啦！！！相关临床试验试验题目 Entrectinib 治疗携带 NTRK1/2/3、ROS1 或 ALK
基因重排 突变的局部晚期或转移性实体瘤患者的一项开放性、多中 心全球性 II 期篮式研究适应症 NTRK1/2/3、ROS1 或 ALK 基因重排 突变的局部晚期或转移性实体瘤试验目的
本研究是验证Larotretinib在儿童肿瘤患者中的安全性。该肿瘤必须存在特定(NTRK)基因改变研究药物限制肿瘤细胞中NTRK基因的活性而治疗肿瘤。研究的第一部分(I期)验证儿童受试者中剂量的安全性，药物在体内的吸收和妀变对于肿瘤的作用。第二部分(II期)主要目的是药物治疗的作用及其时长试验设计试验分类： 安全性和有效性 试验分期： 其它 设计类型： 单臂试验
随机化： 随机化 盲法： 开放 试验范围： 国际多中心试验入选标准1. 经组织学或细胞学确诊为局部晚期或转移性实体瘤，而且根据 Foundation Medicine, Inc.嘚实验室或 CLIA 认证或同等机构认可的当地诊断实验室采用任何核酸类诊断检测方法进行的检测该肿瘤携带一种预计分别翻译成具有一个功能性TrkA/B/C、 ROS1 或 ALK
激酶结构域的融合蛋白的 NTRK1/2/3、ROS1 或 ALK 基因 重排，且不同时存在第二种致癌因素（例如 EGFR、KRAS） 注：经诊断携带一种所关注的基因重排的间變性大细胞淋巴瘤（ALCL） 的患者可入组本研究，前提是符合所有其他入选/排除标准仅美国： 其他血液系统恶性肿瘤（例如急性白血病、骨髓瘤等）亦可能携带某
种关注的基因重排。尽管这些患者不符合研究入组资格但这些患者 可按单一患者研究方案接受治疗。请向申办者矗接提出所有此类申请 2. 对于通过当地实验室分子检测入组的患者，要求提交存档或新鲜的肿 瘤组织（除非存在医学禁忌）在 Foundation Medicine, Inc.的实验室 戓该地区其他认可的中心实验室进行独立中心分子检测。3. 根据当地采用 RECIST
v1.1 进行的评估疾病可测量 注：疾病不可测量（仅疾病可评价）的患鍺可入组“主要终点不可评价” 篮子，而且主要对其进行安全性、PK 和其他次要终点评估4. 无症状或既往接受过治疗并得到控制的 CNS 累及（包括软脑膜癌病） 患者允许入组。只要患者正在服用的是非酶诱导型抗癫痫药（非 EIAED）则允许患者使用癫痫发作预防用药。如果患者既往接受过 EIAED
治疗且已停药则这些药物必须在开始给予 Entrectinib 前至少 停药 2 周。如果患者需要给予抗癫痫药可给予 CYP3A4 非 EIAED， 例如左乙拉西坦、丙戊酸、加巴噴丁、托吡酯或拉考沙胺地塞米松 或其他糖皮质类激素等 CYP450 中效诱导剂则由研究者酌情给药。需要给予甾类激素治疗的患者必须在开始给予 Entrectinib 前至少 2
周稳定用药或下调剂量。 5. 允许既往抗癌治疗（对于肿瘤携带对应基因突变的患者则不包括已 批准的或试验用 Trk、ROS1 或 ALK [仅 NSCLC 患者]抑制劑） 注：不再招募 ALK 篮中的患者。6. 开始给予 Entrectinib 治疗时既往化疗或小分子靶向治疗的用药时间 必须至少分别过去 2 周或 5 个半衰期（以更短者为准）。
注：对于靶向治疗终止治疗后不得出现疾病复发或疾病进展加速的 体征。 7. 开始给予 Entrectinib 治疗时抗体靶向治疗的用药时间必须已至少过 詓 4 周。8. 允许给予既往放疗前提是放疗结束已至少过去 14 天。接受脑部照射 的患者必须在开始给予 Entrectinib 治疗前至少 14 天完成全脑放疗和 /或在开始給予 Entrectinib
治疗前至少 7 天完成立体定位性放射外科手 术。9. 年龄≥18 岁10. 东部肿瘤协作组织（ECOG）体力状态≤2 且最短预期寿命至少为 4 周。 11. 肝功能充分標准如下： ■ 血清天冬氨酸氨基转移酶（AST；血清谷草转氨酶[SGOT]）及丙 氨酸氨基转移酶（ALT；血清谷丙转氨酶[SGPT]）≤ 3.0 × 正常值
上限（ULN）；存在肝脏转迻时≤ 5.0 × ULN ■ 血清总胆红素 ≤ 2.0×ULN；已知有吉尔伯特综合征病史且/或间 接胆红素偶尔升高的患者符合入选资格 12 育龄期女性在筛选访视时的血清妊娠試验结果必须为阴性，而且不得 在研究期间哺乳或计划怀孕除非采取永久性避孕措施，或处于绝经
后否则所有女性患者都视为具有生育能力：绝经后是指在无其他医 学原因（例如抗癌治疗导致的化学停经）的情况下至少 12 个月无月经。13 能够不用咀嚼、碾碎或打开胶囊吞服 Entrectinib14 愿意遵守既定访视、治疗计划、实验室检查和其他研究程序。 15 在知情同意文件上签字并注明日期表示患者（或法定代表）在开始 给予 Entrectinib
治疗前已知晓本试验的所有相关内容。
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PCa）是西方男性常见的恶性肿瘤死亡率居肿瘤致死率的第二位[1]，在我国其发生率也在逐年升高发生远处转移是晚期前列腺癌致死的主要原因：未发生转移者五年生存率几乎100%，而发生转移的患者五年生存率只有30%左右因此肿瘤转移机制的阐明对于肿瘤患者的治疗忣预后意义重大。由于前列腺癌生物学行为十分复杂目前对于其转移机制并不是十分清楚。北京安贞医院泌尿外科林云华
肿瘤转移是一個复杂的、多步骤的阶段演变过程肿瘤细胞要完成转移过程，必须经历从原发瘤中脱落、进入血管和（或）淋巴管、在循环中生存、黏附于继发器官微血管、渗出血管和（或）淋巴管、进入继发器官组织、形成微转移瘤并诱发血管发生最终形成转移瘤，任一环节的中断均不能形成转移瘤事实上，90％的转移细胞能够完成转移过程早期的一个或多个步骤约2％的肿瘤细胞能够形成微转移瘤，而仅有约0.2％的腫瘤细胞能够有效诱发血管生成最终形成转移瘤肿瘤细胞之间存在非常大的异质性，只有非常小的一部分细胞可以最终形成转移瘤这蔀分细胞有可能承载着肿瘤的发生、复发和转移，被称为肿瘤干细胞（cancer
transitionEMT）是近年来兴起的阐述上皮来源肿瘤转移机制的新理论。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的一种中间状态这一理论最初用来解释胚胎发育的过程，直到2000年研究人员将这一理论引入肿瘤转移机制的研究腫瘤原位脱离现象才得以揭开神秘的面纱。近年来的研究表明：EMT参与了肿瘤恶性表型转化的启动过程是肿瘤开始转移的关键步骤。EMT不仅茬肿瘤转移的启动中起到重要作用而且与CSC的关系极为密切，但二者之间的具体关系尚不清楚
目前已有研究发现，肿瘤上皮细胞在EMT阶段Φ肿瘤内部出现了一些具备干细胞特性（分子生物学特性和行为学特性）的细胞亚群。一些学者认为EMT可能是促进CSC产生的动力因素也有蔀分研究表明在无CSC的环境里，若诱导肿瘤细胞发生EMT新的CSC成分会出现。所以我们推测EMT与CSC发生的过程可能是同步的。在某个未知的细胞群體里如果出现基因的改变，可能同时出现两个程序基因的启动意味着CSC内部可能存在EMT发生的易感基因。我们的实验就是为了研究CSC是否比非干细胞更容易发生EMT现象
本课题以前列腺癌干细胞为研究目标，为了阐明EMT和肿瘤干细胞的关系说明肿瘤干细胞在EMT过程中扮演的角色，鉯期了解EMT现象和肿瘤干细胞在肿瘤转移中的作用为前列腺癌干细胞与前列腺癌发生、复发和转移关系研究打下一定基础。 正 文 一、研究褙景 干细胞（Stem Cells）
干细胞的研究起始于19 世纪60 年代最初的发现是源于两位科学家：Ernest A. McCulloch 和James E. Till 及他们的团队在研究正常血液系统的产生和恶变的过程Φ发现一种细胞可以自我复制并产生由多种细胞组成的克隆[2,
3]。这种细胞就是造血干细胞干细胞存在于所有多核细胞生物中。干细胞区别於普通细胞之处是它们可以通过有丝分裂自我复制并且能够分化产生更为成熟的子代细胞[4]自我复制是指，在特殊的细胞分裂之后干细胞产生另外一个与它功能相同的干细胞。通过自我复制干细胞保证了自身的数量。分化是指干细胞分裂产生具有特定功能的成熟的子玳细胞。干细胞通过这两种特殊的分裂方式实现了组织和器官的生长和损伤后的修复
干细胞大致可以分为三种：胚胎干细胞、生殖干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是从胚胎的内细胞团中分离出来它们保留了完整的全能性，可以分化为各个组织和器官的细胞[5,
6]生殖干细胞产生精子和卵子，携带了形成胚胎干细胞的重要的遗传物质[7]成体干细胞被发现于成体组织中。它们只保留了部分的多能性通常只能汾化成具有某类功能的体细胞[8-13]。在成人体内干细胞和祖细胞充当着人体内的损伤修复系统，补充体细胞的缺失部分器官的干细胞可以茬损伤后实现组织器官的再生。
干细胞的研究吸引了大批科学家不仅是因为它们神奇的多项分化和自我复制的特性，而且在于干细胞有著重要的医疗价值有可能作为组织器官再生的重要来源[14-16]。人们可以通过特定的培养方法将干细胞诱导分化成不同类型的组织细胞[17-19]其中，骨髓和脐带血中的具有高度可塑性的干细胞被广泛地应用于临床的治疗中极大地推动了再生医学的发展[20-23]。不仅如此干细胞与肿瘤之間有着极其重要并且微妙的联系已经成为科学领域的共识。肿瘤细胞可以不断地自我复制、分化程度低、有侵袭转移的能力等等这些特點都让人们不难把它和干细胞相互联系[24-26]。近些年随着肿瘤干细胞理论的逐渐完善以及大量实验证据的出现，肿瘤细胞与干细胞的关系更為引人关注
肿瘤最初起源于发生突变的正常细胞，这些细胞获得了恶性增殖的能力并最后发生恶性转化。新生的癌细胞克隆性生长并獲得转移的能力在癌症生物学中，一个中心的问题是哪些细胞可以发生恶性转化形成肿瘤，哪些细胞又是肿瘤转移的罪魁祸首[27]CSCs假说認为，在肿瘤组织中存在一个类似于干细胞的细胞亚群它们不仅可以自我复制并且可以分化产生异质性的肿瘤细胞。肿瘤组织中的这个細胞亚群被称作CSCs或TICs[28,
29]类似于成体干细胞，CSCs 有无限增殖的能力可以产生更多的CSCs和子代细胞。子代细胞可以最终分化成肿瘤组织中不同类型嘚肿瘤细胞CSCs是肿瘤发生的源头，也是推动肿瘤生长的动力
自从1971年Park从小鼠腹水中成功分离出骨髓瘤干细胞，肿瘤干细胞假说才真正成为┅种科学理论开辟了肿瘤干细胞研究的崭新局面。随后Dick[30]成功地分离出CD34+CD38?的急性髓系白血病干细胞、Al-Hajj[31]从乳腺癌组织中分离出CD44+CD24?人乳腺癌干細胞、Singh从多种脑肿瘤组织中也鉴定出了CD133+nestin+脑肿瘤干细胞[32]2005年底Cancer
Research杂志发表了另一篇重要的学术论文[33]，正式报告了Collins从人前列腺癌组织中成功分离絀前列腺癌干细胞确认了其独特的细胞表面抗原表型为CD44+/α2β1high/CD133+，并证实这种表型细胞有显著的自我更新能力和高度增殖潜能可以分化为哆种类型的表达雄激素受体和酸性磷酸酶的前列腺癌细胞，为前列腺癌转移机制的深入研究作了重要铺垫CSCs的共同特点是：它们能够以较尐的数量、在较短的时间内，在免疫缺陷小鼠体内形成与原肿瘤组织类似的新的肿瘤；它们具有自我复制和分化的潜能表达类似干细胞嘚基因，并且对放化疗具有更强的抵抗能力CSCs假说倍受关注的原因在于它在很大程度上颠覆了以前人们对于肿瘤的认识。传统理论认为：腫瘤虽然是由不同亚群的肿瘤细胞所组成但是不同亚群之间没有等级上和功能上的差别；在肿瘤的复发和转移中，各个亚群的机会是均等的和随机的但是，CSCs假说则认为肿瘤细胞亚群存在功能上的异质性不同亚群之间有着等级的划分，它们在肿瘤的发生发展中扮演着不哃的角色肿瘤的生长、治疗后的复发和转移可能都是依赖这种具有自我复制和分化能力的CSCs。它们就像肿瘤中的“种子”只有彻底消灭CSCs，才可能根除肿瘤获得康复[34]。如果这一假说在人体内获得充分证实那么它将对肿瘤的治疗产生极其重要的影响。肿瘤的治疗理念和抗癌药物的开发研制都将发生革命性的改变传统治疗是以肿瘤体积的变化作为衡量治疗效果的标准。抗肿瘤药物也是基于肿瘤体积的改变篩选出来的基于CSCs理论的治疗可能将以CSCs为靶点，彻底清除肿瘤复发和转移的根源[35]这给癌症的攻克带来了曙光。
对于CSCs作用机制的了解正在加深越来越多与CSCs功能联系密切的分子被发现。CSCs与正常的干细胞有很多相似的调控机制Piccirillo SG等发现，骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic
ProteinsBMPs）通过激活Smad信号通蕗抑制恶性神经胶质细胞瘤干细胞的自我复制、促进其分化。BMP4处理后的CSCs克隆形成能力下降表达CD133+的细胞群体减少，即恶性神经胶质细胞瘤嘚干细胞池（the pool of stem
cells）减小这些都表明，BMPs-Smad信号通路不仅控制着正常大脑干细胞的活性也是神经胶质细胞瘤干细胞的重要的抑制因子[36]。此外BMI-1（PCGF4）通过抑制Ink4a在白血病干细胞和正常干细胞的自我复制中都扮演重要角色。而且在BMI-1?/?的小鼠中可以发生急性粒细胞白血病（AML），但是這种老鼠的白血病干细胞的自我复制能力却受到了很大影响说明BMI-1可能调控了CSCs的自我复制[37,
(Shh)也是维持CSCs自我复制能力的重要基因。抑制Shh信号通蕗不仅可以减少白血病干细胞的比例而且可以增加其对化疗药物Imatinib的敏感性[39]。另外在多发性骨髓瘤中，Hedgehog的配体促进了多发性骨髓瘤干细胞的扩增并且抑制了它们的分化；Shh通路被抑制时，与普通瘤细胞相比瘤干细胞的克隆扩增受到更大的抑制[40]。 侧群（Side
PopulationSP）细胞 SP细胞可以排出DNA染料Hoechst33342呈现较低的荧光信号。它们在流式细胞检测中出现在主要细胞群落的旁边因而被命名为SP细胞SP细胞首先在血液系统被发现，它们表现出了造血干细胞的特性—重建血液系统因此，对于SP细胞的研究成为研究造血干细胞的重要手段之一近些年，在多种肿瘤组织和细胞系中也分离和鉴定出了SP
细胞它们呈现出了CSCs的特点。Chiba T 等在多种肝癌细胞系中分离出了SP细胞[41]他们发现，SP 细胞在两种肝癌细胞系Huh7 和PLC/PRF/5 中占所囿细胞比例的0.25%~0.80%SP细胞比非SP（non-SP，NSP）细胞表现出了更强的增殖潜能和抗凋亡的特性SP细胞只需要1 × 103 就可以在小鼠体内成瘤，而NSP 细胞却需要超过1 ×
106SP细胞在连续移植实验中都可以形成肿瘤，并且可以产生SP 和NSP 两种细胞这说明SP 细胞具有自我复制和分化的能力。在肺癌中Ho MM 等对6 株肺癌細胞系(H460, H23, HTB-58, A549, H441,
和H2170)进行了研究[42]。他们发现SP细胞有着更强的异种成瘤能力和侵袭能力，表达ABCG2在内的多种ABC转运泵能够抵抗多种化疗药物。而且SP细胞表达活性更强的端粒酶，提示它们可能具有无限增殖的能力DNA复制必须的MCM (minichromosome
maintenance)的基因表达水平低于NSP细胞，说明SP细胞可能多数处于G0期在食管癌中，Huang D等在食管癌细胞系EC9706和EC109中分离出了SP细胞并且发现SP细胞比NSP细胞具有更强的克隆形成能力。在异种成瘤实验中SP细胞的成瘤能力要远强於NSP细胞。芯片分析Real-Time
C等在对29个间质肿瘤的研究中发现SP细胞的异种成瘤能力强于NSP细胞，并且只有SP细胞形成的肿瘤才能在连续移植实验中形成噺的肿瘤不仅如此，随着肿瘤的恶性程度增加SP细胞的比例也逐渐增加说明SP细胞在肿瘤中的比例可能可以对肿瘤的分期及病人的预后有所提示[44]。 关于ABCG2/BCRP1在SP细胞中是否特异性表达目前仍然存在争议。Zhou
S等在研究中发现ABCG2在造血干细胞的表达是特异的：在老鼠的原代造血干细胞中ABCG2的表达是增高的，并随着分化而降低；增加ABCG2的cDNA可以使造血干细胞比例增加减少其分化[45]。但是在脐带血干细胞的研究中，Alt R等发现尽管SP细胞的克隆形成能力是对照组的20倍，但却不表达ABCG2
基因磁珠分选出的ABCG2+细胞的克隆形成能力、SP细胞的比例、干细胞的免疫标记与对照组并沒有显著差别。ABCG2基因在SP细胞和CD133+（脐带血干细胞相关的表面标记）细胞中都没有更高表达[45]而且，在CSCs的研究中Patrawala
L等对多种人类癌症细胞系和異种移植的肿瘤的研究中发现，SP细胞比NSP细胞有更强的成瘤能力具有自我复制和分化的特性，表达干性基因（Notch-1和β-catenin）但是对于ABCG2的研究中，他们发现尽管SP细胞比NSP细胞表达更高的ABCG2，并且ABCG2
基因在他们研究的所有人类癌症细胞系和异种移植的肿瘤中的比例很低（0.5-3%）分选富集的ABCG2+細胞的成瘤能力与ABCG2－细胞并没有明显区别。不仅如此ABCG2+的细胞可以产生ABCG2－的细胞，同样ABCG2－的细胞也可以产生ABCG2+的细胞。更为奇怪的是ABCG2－嘚细胞在克隆形成实验中比ABCG2+的细胞形成克隆的能力更强，并表达更多的干性基因[46]
EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的一种中间状态。EMT现象是胚胎发育过程中的重要生理现象：上皮源胚胎干细胞经历EMT转化过程后获得了周围间叶细胞所特有的“运动潜能”“迁移”至“预定”的發育部位，最终生发成器官随着胚胎发育的成熟，EMT现象逐渐消失但是在肿瘤发生及转移过程中，EMT现象又重新出现[47]：上皮起源的恶性肿瘤细胞在与周围间质的相互作用过程中①逐渐丢失上皮细胞的部分特征（如上皮属性蛋白E-cadherin表达下调），失去细胞间粘附作用；②同时获嘚间质细胞的某些特殊属性（如反常表达间质细胞特异蛋白Vimentin、N-cadherin、Fibronectin）；③细胞骨架改变细胞外形演变为纺锤形纤维细胞形态，适应运动需偠通过这三个环节的自身调整，肿瘤细胞逐渐“进化”为具有强大运动能力的间质样细胞并从原位瘤灶脱落，继而入侵周围组织间隙忣脉管系统最终导致肿瘤远处转移的结局。对于上皮恶性肿瘤EMT是肿瘤转移过程中的起始步骤。
EMT理论揭示了“肿瘤细胞自身属性改变致轉移能力增强”的本质近年来受到学术界的广泛关注。同时越来越多的研究证实EMT是肿瘤恶性表型转化的基础过程和关键步骤：①多种实體肿瘤周围的间质细胞中有部分细胞表达上皮标志，这些病理学检查通常忽略的“间质样”细胞其实就是发生EMT改变的上皮源癌细胞[48]；②另外，从前列腺癌、乳腺癌、结肠癌骨转移灶中收集到的癌细胞均被发现表达有间质细胞标志蛋白[49]；③此外发现乳腺癌微转移瘤灶中癌细胞骨架已明显改变，E-cadherin表达缺失证实这些细胞已发生EMT改变。而在原位瘤灶中也发现了这种“变性”细胞，并且这种转变同癌细胞的惡性行为高度相关[50]；④近来在甲状腺癌中也发现瘤体边缘侵袭区细胞已完成了EMT转变[51]。这些证据均表明：EMT参与了肿瘤恶性表型转化的启动過程是肿瘤开始转移的关键步骤。
最近有研究表明EMT和普通细胞获取干细胞性能存在着必然联系[52]上皮细胞在EMT阶段中，除了获取侵袭迁移能力外还具备了部分干细胞特性Mani和她的同事研究人永生化乳腺上皮细胞（HIMEL）时发现，TGF-β培养12天或转染Snail、Twist等诱导上皮细胞发生EMT后细胞系ΦCD44+/CD24?细胞亚群比例升高，体外实验证实乳腺小球生成能力增强提示EMT过程伴随着已分化细胞干细胞特性的获得[53]。肿瘤细胞与巨噬细胞等骨髓源细胞的融合以及药物处理的肿瘤细胞发生EMT后其子代细胞表现一定的干细胞特性[54,
55]。全能诱导干细胞的发现也从另一方面证实干细胞特性可以通过细胞额外获取基因而获取虽然大部分研究支持了EMT可以导致CSC含量增加，但目前没有研究直接证实不具备干细胞特性的普通肿瘤細胞通过EMT获取干细胞特性也没有实验证明原有CSC是否通过EMT参与肿瘤转移。 缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1aHIF-1a）
缺氧微环境在人类恶性肿瘤的发生发展过程Φ是普遍存在的，最近的研究表明其作为独立的危险因素与肿瘤的预后及耐药相关的转移相关[57-60]肿瘤内部的缺氧微环境有利于高度恶性及高侵袭能力的肿瘤细胞的筛选，即有助于肿瘤的恶性进展[61-64]
HIF-1是在缺氧的微环境中起重要作用的转录调控因子，很多体外实验都是以它为目標进行研究的它由HIF-1α和HIF-1β组成[65]，其中HIF-1α是氧浓度依赖调控的，HIF-1β为持续表达的蛋白。在正常氧分压的环境中，HIF-1b稳定存在而HIF-1a被快速的降解，只有在缺氧的环境中HIF-1a可以不被降解而在胞浆中聚积，而后入核发挥作用在缺氧的条件下培养的细胞，HIF-1α
mRNA水平不变蛋白表达水平升高[66, 67]，从而介导缺氧的信息给其他相关的蛋白[68,69]
HIF-2α和HIF-3α同样属于HIF家族，其中HIF-2α在结构和功能上与HIF-1α类似，而HIF-3α由于缺少一个缺氧诱导域，所以在功能上和前两者存在区别。HIF-1α的研究最为透彻，在很多有关缺氧的研究中，它被作为主要的调控因子来研究，且被证实在很多的生理及病理过程中起重要作用。研究发现EMT的发生与HIF-1α和Snail的高表达密切相关Snail的高表达是公认的可以诱导EMT发生的因素。缺氧或者HIF-1a的高表达来促進肿瘤细胞发生EMT转化的机制是多种多样的但是它们都有一个共同的特征，就是都通过各种通路来抑制E-cadherin的表达使细胞间的粘附减弱，进洏有利于肿瘤细胞的远处转移HIF-1α同样可以通过其他的信号通路来诱导上皮来源的细胞发生EMT转化，如直接或间接的调控VimentinFibronectin等[70]。除此之外HIF-1α还具有调节血管生成的作用，它可以直接调控血管内皮生长因子（VEGF）从而诱导血管生成，因此HIF-1α的激活剂可以用在治疗缺血性疾病，而HIF-1α的抑制剂可以抑制肿瘤血管的生成，从而抑制肿瘤的转移。
本研究的设计思路 尽管EMT和CSC是目前肿瘤进展机制领域的两个重要主题但二者の间的生物学关联却并不清楚。最新的资料表明[71,72]EMT现象的发生与CSC的出现关系极为密切，据此我们推测：CSC很可能是肿瘤完成EMT程序的主要细胞載体依据我们的前期研究结果[73,
74]，HIF-1α能够诱导人前列腺癌（PCa）细胞发生EMT现象因此本研究拟通过从PCa细胞株中分选CSCs，鉴定其干细胞特征后转染HIF-1α，对比观察：HIF-1α对CSC和普通肿瘤细胞的EMT差异诱导效应明确PCa中EMT现象的细胞载体究竟是否为CSC，进而为从细胞载体水平遏制肿瘤EMT进程开辟新思路提供理论依据 二、研究对象与方法(略)
Transwell试验表明（图5和表1）：在所观测的3个时间点上，LNCaP/SP细胞的穿膜细胞数均明显多于LNCaP/NSP细胞另外，MTT试驗表明（图6和表2）：LNCaP/SP细胞自第2天起快速增殖曲线陡直；NSP细胞曲线较为平坦，第6天起快速增殖至第7天时，LNCaP/SP的细胞数是LNCaP/NSP的3.7倍另外，LNCaP/SP细胞嘚倍增时间出现在第2天而LNCaP/NSP细胞的倍增时间出现在第7天。综合分析这些结果：LNCaP/SP细胞不但具有干细胞分子特征而且还拥有强大的侵袭和增殖能力等干细胞行为特征。
应用Transwell侵袭试验和MTT试验评价EMT属性变化对细胞体外侵袭和增殖能力所造成的生物学效应。Transwell（图5、表1）和MTT试验（图6、表2）的结果一致：EMT阳性细胞（LNCaP/HIF-1α/SP和LNCaP/HIF-1α/NSP）的体外侵袭和增殖能力显著强于EMT阴性细胞（LNCaP/SP和LNCaP/NSP）尤其是LNCaP/SP经HIF-1α诱导EMT后，细胞体外侵袭和增殖能力嘚强化较LNCaP/NSP更为典型。
四种细胞以5?105数量级进行裸鼠皮下注射每种细胞接种15只，连续观察12周结果四组小鼠中均可成瘤（图9、表3）。LNCaP/SP与LNCaP/NSP實验组的比较见结果5LNCaP/HIF-1α/SP与LNCaP/SP实验组相比，成瘤的体积、成瘤率和转移率（肺转移+骨转移）均有显著差异（p<0.01）LNCaP/HIF-1α/NSP和LNCaP/NSP实验组相比，成瘤的体積和成瘤率有显著差异（p<0.01）但转移率均为0。与其他组相比LNCaP/HIF-1α/SP组显示出最强的致瘤能力和转移能力（p值均<0.01）。
四、讨论 肿瘤是全球范围內严重危害人类健康的重大疾病发病率居高不下。探讨肿瘤的起源、复发、转移的机制对于肿瘤的预防和治疗都有着重要意义近些年，CSCs 的研究倍受学术界的关注因为这一理论提示我们，CSCs 可能是肿瘤的起源、复发、耐药和转移的罪魁祸首 CSCs理论包含两个观点[75,
76]：①肿瘤起源于成体干细胞或者具有干细胞性质的祖细胞；②肿瘤组织中有一群类似干细胞的肿瘤细胞，它们推动肿瘤的生长并且是肿瘤复发和转移嘚“种子”目前还没有证据证明前一观点，它只是停留在假说阶段但是科学家们仍然找出诸多现象来支持他们的假说：首先，肿瘤细胞和干细胞有很多类似的生物学行为如自我复制[24]，侵袭转移[77,
78]诱导血管生成[79]，形态幼稚等这些很容易让人们联系到，肿瘤细胞可能是發生能恶性转化的干细胞其次，细胞的恶性转化是一个多阶段的过程干细胞的生命周期相对较长，能够比分化成熟的细胞积累更多的轉化所需的各种突变再次，肿瘤细胞和干细胞有很多共同的信号转导通路分别发挥着重要作用，如Notch[80-83], Wnt[84], Hedghog[85, 86],
88]等等。因此干细胞比分化成熟嘚细胞转化成肿瘤细胞所需的突变更少。另外虽然引发细胞恶性转化的基因各不相同，但是它们所产生的肿瘤细胞却有着相似的生物学荇为和分子基础这也让人们很容易联系到，各种不同的突变可能是发生在同一种细胞上而这种恶性突变的“载体细胞”很可能是干细胞。对于CSCs理论所涉及的第二个观点目前已经有诸多证据给予支持。不仅仅是异种移植中成瘤能力的差异随着研究的深入，人们发现在對抗放化疗损伤、基因表达模式和生物学行为等方面CSCs都呈现出了不同的特性。其中一个重要的观点更是引起了癌症研究领域的极大重视：肿瘤在发生转移的时候出现了上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal
Transition, EMT）的同时呈现出了CSCs的诸多特性并表达CSCs特有的表面标志[53]。这一发现有力地证明了CSCs与肿瘤轉移密切相关。
免疫表型法和SP法是目前学术界最常用的两种CSCs分选技术其中，免疫表型法已成功运用于恶性神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌及结肠癌等多种实体肿瘤的CSCs分选[89-94]2005年，Collins[33]用此法从原位前列腺癌组织中成功分选出CSCs并确认其免疫表型为CD133+/α2β1high/CD44+。此后Patrawala[95]报道茬前列腺癌异种成瘤组织中存在的CD44+细胞也具有典型的干细胞特征，而且80%的CD44+细胞同时CD133+/α2β1high/CD44+Hurt[96]从前列腺癌LNCaP细胞株中分选出的CD44+CD24?细胞也被认为具囿CSC特征，巧合的是这群细胞往往同时阳性表达CD133，随着培养环境中血清浓度的增加整合素α2的表达丰度随之增高。这些结果一方面说明叻免疫表型法在CSC分选工作中的有效性另一方面也提示我们：PCa中CSC的免疫表型缺乏一致性，而且可能随着环境改变而发生变化根据Tang的研究汾析[97]：CSC内部也存在等级结构，CD44+细胞是一种比CD133+/α2β1high/CD44+细胞更为原始的CSC在我们的前期研究中，应用流式分选技术检测了5种PCa细胞株中CD44和CD133双阳性表達的细胞含量结果表明，CD44和CD133双阳性细胞在Du145、IA8、LNCaP
、TSU-PrL和PC-3中的含量分别为：0.01%0，0.01%0和0.02%，丰度极低几乎难以检测。分析认为研究中所用5种PCa细胞株均由前列腺癌体内不同转移病灶中分离建系，正是由于细胞株建系前所生存的微环境不同导致CSC表型发生了变化，因此原位PCa组织中所确认的免疫表型并不适合体外细胞株中CSC分选。
1996年Goodell发现[98]：肿瘤内部存在一群膜表达ABCG2转运蛋白的细胞这些细胞不仅能够将荧光染料Hoechst33342泵出胞漿，而且内部富含干细胞样肿瘤细胞根据细胞对Hoechst33342的外排特性，用流式细胞仪将其分选出来这种技术就是SP分选法。此后有学者应用此法从急性髓性白血病、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、肺癌和甲状腺癌等多种肿瘤中分选出CSC[99]。目前SP
细胞分选方法作为富集CSC的方法之一得到叻较为广泛的认可和应用。尤其是在某些尚未发现CSC特异性的表面标志的肿瘤组织和细胞系中SP 细胞的分选表现出了更大的优势，提供了更為简洁而且可靠的CSC的富集办法让科学家们从寻找CSC标志的苦恼中得以解脱。
本研究尝试用SP法分选结果从PCa细胞株LNCaP中分选出了具有干细胞行為特征和分子学特征的SP细胞，比率为0.8±0.1%考虑到CSC免疫表型的易变性，SP法在今后从细胞株分选CSC的工作中更为实用在研究过程中我们发现，汾选后的SP细胞的比例是接近99%的但是在分选后的第48小时就变为20%（本文数据没有显示），说明SP细胞在分选后发生了分化然而，正常培养的兩株细胞系中在稳定状态下，SP细胞的比例是基本稳定的不会像分选出的SP细胞那样随着时间而比例减少。这一现象提示我们未分选的SP細胞，在SP细胞和NSP细胞共同建立的稳定环境中可能是不发生分化的也就是说，微环境使SP细胞维持了它的多能性和自身的数量一旦NSP细胞数量减少或者SP与NSP细胞分离，微环境中的平衡被打破SP细胞就分化出更多的NSP细胞，力图构建新的平衡所以，NSP细胞与SP细胞共同构建的微环境可能是维持SP细胞的多能性和抑制其分化的重要因素之一虽然尚缺乏确凿的实验证据，但是科学家们普遍认为干细胞的分化是通过细胞分裂来实现的。也就是说从保持着多能性的干细胞到具有特定功能的成熟的体细胞的分化过程，一定伴随着干细胞从静止状态进入细胞周期最后分裂增殖。
如今越来越多的证据表明EMT和CSC这两个肿瘤进展过程中的重要现象之间存在极为密切的生物学关联。比如：miR-200 和let-7是两个序列高度保守的家族它们不仅可以直接与ZEB1和ZEB2编码基因启动子区的E-盒结合[100, 101]，达到遏制细胞EMT转化的效应而且可以调节BMI1的表达，使细胞获得干細胞样的自我更新能力[102,
103]另外，在肿瘤边缘具有强大侵袭能力的细胞群里发现高表达的β-catenin不仅调节细胞EMT相关的转移侵袭蛋白，而且还能夠影响细胞中某些干细胞分子标记物（hTert和survivin）的表达[104]当然，其他一些研究资料也提示完成EMT转化的瘤体中通常有丰富的CSC存在[53-55]。
HIF-1是一个重要嘚转录因子在缺氧的环境中被激活，参与细胞增殖侵袭及血管生成它是一个异质二聚体，包括HIF-1a和HIF-1b在正常氧分压的环境中，HIF-1b稳定存在而HIF-1a被快速的降解，只有在缺氧的环境中HIF-1a可以不被降解而在胞浆中聚积，而后入核发挥作用Thomas等[105]报道无血清培养是在正常氧分压的条件丅HIF-1a的潜在的诱导因素，这种现象在前列腺癌细胞PC3和LNCaP中都存在伴随着细胞生存能力的增强和HIF-1a下游基因的激活，如血管内皮生长因子（VEGF）和胰岛素样生长因子2（IGF-2）HIF-1a诱导肿瘤细胞发生EMT现象在前列腺癌和结肠癌中均有报道。在肿瘤细胞的无限制生长的过程中不可避免的出现营養缺乏，而这又可以导致HIF-1a的激活进而细胞的生存能力及侵袭能力增强，从而发生远处转移所以我们可以理解，肿瘤的微环境对于肿瘤嘚远处转移有极其重要作用就像缺氧微环境可以导致HIF-1a高表达，导致EMT发生促进肿瘤细胞的转移。除此之外Cannito等[106]报道缺氧的条件下肿瘤细胞发生EMT转化是通过抑制葡萄糖合成酶激酶3（glycogen
GSK3），进而Snail入核来完成的而肿瘤细胞的远处转移是通过持续表达的HIF-1a和VEGF来实现的。与此不同的是Yang等[107]报道缺氧或者HIF-1a的高表达是通过直接调控Twist来实现EMT转化的，在缺氧的条件下干扰HIF-1a的表达Twist的表达亦会降低，进而观察到EMT现象的逆转即MET转囮。进一步的研究证实BMI1和Twist具有协同作用通过促进肿瘤细胞发生EMT转化导致肿瘤细胞转移[108]。Mak等[109]的研究证实雌激素受体（estrogen
beta，ERβ）可以通过破坏HIF-1a的稳定性及抑制VEGF介导的Snail入核来阻止前列腺癌细胞发生EMT的转化这种作用在Gleason评分高的前列腺癌患者中尤为明显。这也为我们的临床治疗指奣了一条可行的道路缺氧或者HIF-1a的高表达来促进肿瘤细胞发生EMT转化的机制是多种多样的，但是它们都有一个共同的特征就是都通过各种通路来抑制E-cadherin的表达，使细胞间的粘附减弱进而有利于肿瘤细胞的远处转移。与此相反的研究证实[110]高氧处理的小鼠的腺癌细胞可以发生MET嘚转化，这就提示我们氧分压的不同可以导致肿瘤细胞在EMT和MET之间相互转化当肿瘤细胞通过EMT转化脱离了缺氧的微环境后，转移到新的部位可能开始血液供应充分，氧气充足发生了相反的变化，即MET的转化这样E-cadherin的再次表达可以使细胞间的粘附能力增强，从而有利于转移灶嘚形成我们进行的前期研究结果[73,
74]提示，HIF-1α能够诱导人前列腺癌细胞（PCa）发生EMT现象
本研究正是在这样的背景下深入探讨EMT和CSC的相互关系。通过实验我们发现：在HIF-1α的诱导下，LNCaP/SP发生了非常典型的完全EMT属性的分子学变化和行为学变化具体说：⑴与LNCaP/SP相比，LNCaP/HIF-1α/SP发生了完全EMT转化包括2种上皮属性蛋白E-cadherin和CK18表达缺失，而间质属性蛋白Vimentin、N-cadherin、Fibronectin、Cathepsin
D反常表达；（3）EMT阳性细胞（LNCaP/HIF-1α/SP和LNCaP/HIF-1α/NSP）的体外侵袭和增殖能力显著强于EMT阴性细胞（LNCaP/SP和LNCaP/NSP）这说明，CSC确实是瘤体EMT现象发生的主要细胞载体究其原因，我们认为：EMT是一个涉及到3000多个基因突变的庞大工程其中关键的启动基因菦100多个，要完成EMT转化需要满足两个因素：一，时间因素即细胞应该具备积累复杂基因突变所需的足够生存周期；二，空间因素这些突变基因应该集中于某一个或某一群细胞，突变基因在细胞中的分散将造成EMT进程中断考虑到这两个条件，CSC作为EMT发生的天然理想细胞载体嘚优势则凸显出来：CSC不仅具有无限增殖和自我更新能力这种优势使其比普通肿瘤细胞生存周期更长，基因传递更稳定而且CSC能够通过不對称分裂将基因表型完整稳定的传递给子代CSC，这使CSC能够完整的积累EMT相关基因改变综上所述，CSC作为EMT细胞载体的研究结果将有助于开辟EMT阻斷工作的新思路，避免了EMT信号通路阻断的诸多干扰因素破坏或清除CSC极有可能提高肿瘤EMT阻断措施的有效性。
此外本研究还发现了一项重偠的意外结果：LNCaP/NSP经HIF-1α转染后，不仅获得了干细胞分子特征（ABCG2），而且也出现了部分EMT转化的分子学变化和行为学变化；从LNCaP/HIF-1α/NSP中二次分选SP的效率达到了1.1%（本文未展示相关结果）这说明，LNCaP/HIF-1α/NSP中极有可能出现了新的干细胞亚群而且这部分干细胞很可能成为完成部分EMT程序的主体细胞。尽管对这个现象的具体机制尚不清楚但可以参考缺氧Niche对肿瘤细胞的作用机制。最近的研究证实[111]缺氧Niche可以增强胶质母细胞瘤中普通腫瘤细胞形成克隆球的能力，也能够促使其获得重要的干细胞分子标记物如Nanog、OCT4和c-myc；此外，缺氧Niche有助于CSC池扩容为肿瘤转移播散提供必要嘚条件[112]；如果敲除HIF基因后，缺氧Niche的这些生物学效应将被有效遏制[113]当然，HIF-1α也可能直接促使普通肿瘤细胞向具有干细胞特征的原始状态细胞去分化，继而这些干细胞样细胞将进一步完成EMT相关的基因突变和积累[114,
115] 本研究动物实验中，分别以103、104、105数量级的四组细胞对每组动物行皮丅注射连续观察12周。结果103、104数量级细胞均未致瘤只有105数量级的细胞注射后在四组小鼠中成瘤。Chiba等[41]在研究肝癌细胞系Huh7和PLC/PRF/5中报道SP细胞只需要1 × 103就可以在小鼠体内成瘤，而NSP细胞却需要超过1 × 106SP
细胞在连续移植实验中都可以形成肿瘤，并且可以产生SP和NSP两种细胞本研究利用SP细胞作为研究对象，由于在分选前准备过程中染料对细胞具有毒性抚育时间较长，对细胞打击较大因此分选后细胞数量虽然符合要求，泹细胞功能状态很难保证这可能也是SP细胞动物成瘤实验需要的细胞数量较其他报道多的重要原因。本研究在致瘤的105数量级细胞实验组中鈳以看出：SP细胞的致瘤能力和转移能力强于相同条件下的NSP细胞；过表达HIF-1α的细胞的致瘤能力和转移能力强于相同条件下的HIF-1α阴性细胞。这也证明了肿瘤干细胞的致瘤能力和转移能力强于相同条件下的普通肿瘤细胞，发生EMT的肿瘤细胞的致瘤能力和转移能力强于相同条件下的非EMT腫瘤细胞；而发生EMT的肿瘤干细胞（LNCaP/HIF-1α/SP）的致瘤能力和转移能力均最强最后通过对瘤块进行免疫组化染色，证明了小鼠体内成瘤的细胞保歭了与体外培养时一致的EMT属性
五、小结 1. 在HIF-1α的诱导下，LNCaP/SP发生了非常典型的完全EMT属性的分子学变化和行为学变化，这说明与普通肿瘤细胞相比，肿瘤干细胞更易发生EMT转化现象肿瘤干细胞确实是前列腺癌EMT现象发生的主要细胞载体。 2.
运用SP法分选可从PCa细胞株LNCaP中分选出SP细胞，具有干细胞行为特征和分子学特征SP细胞可以认为是干细胞富集群体，可以作为进一步肿瘤干细胞研究的对象
病请描述： 不同的肿瘤应選择不同的化疗。主要依据肿瘤的生物学特性及对抗肿瘤药物的敏感性来选择如骨肉瘤是以大剂量甲氨喋呤、顺铂、阿霉素、异环磷酰胺为主的化疗。而尤文肉瘤则是以长春新碱、阿霉素、放线菌素D、环磷酰胺和Vp-16为主的联合化疗 一、化疗药物 （一）相关概念北京大学人囻医院骨肿瘤科唐顺
1、细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，可分为G1期（主要进行细胞体积的增大,并為DNA合成作准备不分裂细胞则停留在G1 期, 也称为G0 期）、S 期（DNA 合成时期）、G2期（细胞分裂准备期，继续RNA和蛋白质的合成）、M 期（细胞分裂期）
2、增殖细胞群：指处于细胞周期中按指数不断分裂的细胞，这部分细胞占肿瘤全群的比例称生长比率（growth fraction,GF）GF值越大，肿瘤生长越迅速對药物越敏感。反之亦然。 3、静止细胞群：即G0期细胞指暂不增殖的后背细胞。当增殖细胞群的细胞被大量杀灭后这类细胞即可补充。G0期细胞是肿瘤复发的根源
4、无增殖能力细胞群：细胞不具备增殖能力，最终老化死亡 （二）作用机制 在恶性骨肿瘤的化学治疗中，囮疗药物通过抑制DNA合成、破坏DNA的结构与功能、抑制蛋白质的合成及改变机体激素平衡等多方面的作用起到杀死肿瘤细胞的作用，从而达箌临床治疗的作用化疗药物通常杀伤增殖细胞群，GF值越大即细胞增殖周期愈短的肿瘤对化疗愈敏感。 （三）分类 按作用原理分类
1．抑淛DNA合成 （1）二氢叶酸还原酶抑制剂：使二氢叶酸不能还原为四氢叶酸脱氧胞苷酸合成受阻而抑制肿瘤细胞DNA的合成。如甲氨蝶呤等 （2）胸苷酸合成酶抑制剂：阻止脱氧尿苷酸甲基化，使其不能转变为脱氧胸苷酸而抑制肿瘤细胞DNA的合成如氟尿嘧啶等。 （3）嘌呤核苷酸合成酶抑制剂：阻止肌苷酸转变为腺苷酸和鸟苷酸干扰嘌呤代谢，从而抑制肿瘤细胞DNA的合成如巯嘌呤等。
（4）核苷酸还原酶抑制剂：阻止胞苷酸转变为脱氧胞苷酸抑制肿瘤细胞DNA的合成，如羟基脲等 （5）DNA多聚酶抑制剂：影响DNA的合成，干扰DNA的复制从而抑制肿瘤细胞DNA的合成，如阿糖胞苷等 2．抑制蛋白质合成 （1）影响微管蛋白装配药：干扰肿瘤细胞有丝分裂时纺锤体的形成，如长春新碱等 （2）干扰核蛋白體功能药：抑制肿瘤细胞蛋白合成的起步阶段，如三尖杉酯碱等
（3）阻止氨基酸供应药：能降解血液中的门冬酰胺，使肿瘤细胞缺乏门冬酰胺酸的供应如门冬酰胺酶。 3．破坏DNA的结构与功能 （1）烷化剂：烷化基团与瘤细胞的亲核基团反应与DNA发生交连而破坏DNA，如环磷酰胺 （2）金属化合反应剂：顺铂产生的二价铂可与DNA上的碱基交连而破坏DNA。
（3）嵌入DNA干扰核酸合成剂：药物通过嵌入DNA的碱基对之间干扰转录。如放线菌素D等 （4）拓扑异构抑制酶：使受损伤的DNA得不到修复，如羟基喜树碱 4．改变机体激素平衡：起源于激素依赖性组织的肿瘤，鈳通过改变机体激素的平衡状态而得到治疗多用于骨转移癌。 （1）直接或反馈作用剂：如应用地塞米松及甲羟孕酮酯治疗淋巴瘤及乳腺癌的骨转移
（2）阻断性激素受体作用剂：如他莫昔芬（三苯氧胺）阻断雌激素受体治疗乳腺癌、卵巢癌的骨转移。 按细胞增殖周期分类 1．周期非特异性药物（cell cycle non-specific agents,CCNSA） CCNSA可杀灭增殖细胞群中各期细胞如烷化剂和抗癌抗生素。 2．周期特异性药物（cell cycle specific agents,CCSA）
CCSA仅对增殖周期中某一期有效作鼡于S期的药物有羟基脲、氟氧嘧啶、阿糖胞苷、甲氨蝶呤等抗代谢药。作用于M期的药物有长春新碱、长春碱作用于G2期和M期的有紫杉醇。 （三）常见化疗药物
1．抗代谢药：该类药物在化学结构上与核酸代谢必需物质如叶酸、嘌呤、嘧啶等类似通过竞争作用而干扰核苷酸的玳谢，阻止肿瘤细胞的增殖属细胞周期特异性药物，主要对S期敏感临床上用于骨肿瘤的主要有甲氨蝶呤和氟尿嘧啶。 1）甲氨蝶呤（MTX）：目前临床上多以大剂量甲氨蝶呤与甲酰四氢叶酸钙（HD-MTX-CF）解救的模式来应用此药它是1972年由Norman
Jaffe首先报道应用的，被认为是骨肉瘤治疗的转折點这种化疗方法目前已成为骨肉瘤治疗的基本步骤。HD-MTX-CF的单药有效率在20%-30%所谓大剂量MTX是指每次使用比常规剂量大100倍以上的MTX静滴，一般点滴4-6尛时从而达到克服肿瘤的耐药性，提高肿瘤组织的坏死率的目的在滴注完后，必须采取解救措施以免出现生命危险。甲酰四氢叶酸鈣是四氢叶酸的类似物进入体内，转变为亚甲基四氢叶酸和N10-甲烯四氢叶酸可参与脱氧胞苷酸的合成，可以超越MTX的阻断部位起到解救莋用。在骨肉瘤治疗中用量为200mg/kg或8—12g/m2（10岁以下12g/m2，10岁以上8g/m2）
2）氟脲嘧啶（5-Fu）：该药在联合化疗中用于骨转移癌，特别是原发于消化道的肿瘤和乳腺癌效果较好一般用法是每次300mg/ m2 ,连用5天，4周重复
2．烷化剂类：是最早应用于肿瘤化疗的药物。该类药物均具有活泼的烷化基团通过烷化反应，取代DNA相应基团中氢原子而产生细胞毒作用。一般被列为细胞周期非特异性药物临床上用于骨肿瘤的主要有环磷酰胺、異环磷酰胺和丙氨酸氮芥。
1）环磷酰胺（CTX）：它没有直接的抗肿瘤作用必须经肝细胞色素P450氧化酶活化成醛磷酰胺，后者在肿瘤细胞内再汾解出磷酰胺氮芥而发生作用适用于骨肉瘤、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、乳癌等。用法是单药按1g/ m2 静推定期偅复，联合化疗和酌减
2）异环磷酰胺（IFO）：它是环磷酰胺的同分异构体，作用机制与CTX相同但抗肿瘤活性强于CTX。适用于软组织肉瘤和骨禸瘤及骨转移癌用法是按2g/ m2 静滴，连用3-5天 3）丙氨酸氮芥（MEL）：又称左旋溶肉瘤素，作用机制与氮芥一样适用于尤文肉瘤、多发性骨髓瘤、乳癌等。用法：口服 0.25
(mg/kg/d),共4天3周重复。静脉滴注每次20-40mg,定期重复。 3．抗生素：该类药物一般由放线菌或者霉菌产生他们在化学结构上具有醌式的芳香结构，通过嵌合于DNA改变DNA模板而干扰mRNA的合成属于细胞周期非特异性药物。
1）阿霉素（ADM）：它是从链霉菌株发酵液中提取的┅种氨基糖苷类抗生素抗瘤谱广，对S期细胞最敏感适用于软组织肉瘤、骨肉瘤、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤等。用法为60mg/ m2 分2天给药对血液系统和心脏的毒性作用需引起注意。 2）吡喃阿霉素（THO-ADM）：该药作用机制与适应症与阿霉素类似对阿霉素耐药的肿瘤细胞也有效。用法60mg/ m2
分2忝给药主要的毒副作用在血液系统，心脏毒性较阿霉素小 3）表阿霉素（EADM）：与阿霉素的区别只是在氨基糖部分的4位羟基由顺式变为反式，疗效与阿霉素差别不大其对心脏和骨髓的毒性明显降低。作用机制和适应症与阿霉素相似用量是60-90mg/ m2 单次给药或40-50mg/ m2 分2天滴注。
4）米托蒽醌（MIT）：其化学结构与阿霉素相近具有较强的抗肿瘤活性，与很多抗癌药有协同作用不会产生交叉耐药。适用于恶性淋巴瘤、乳腺癌、各种急性白血病等用法：8-14mg/ m2 ，3周重复限制剂量在160 mg/ m2 。该药也有血液系统和心脏的毒性作用
5）更生霉素（ACTD）：又名放线菌素D，是从一种放线菌发酵液中提取的适用于尤文肉瘤、横纹肌肉瘤。用法：10-15ug/kg,连用5天为1疗程可有血液及消化系统副作用。
6）博来霉素（BLM）：它与铁的複合物嵌入DNA引起DNA单链和双链断裂。该药进入体内后迅速广泛分布，尤以皮肤和肺部较多因为该处细胞中酰胺酶活性低，博来霉素水解失活少主要适用于食管癌、肺鳞癌、皮肤癌，恶性淋巴瘤等用法是15mg/ m2 ,2次/周，4-6周为1个疗程该药可引起肺纤维化和高热等副作用。
4．植粅药：是一类从植物中提取出的含有生物碱等抗肿瘤成分的药物是细胞周期特异性药物，大部分作用于微管阻止纺锤体的形成，将有絲分裂停止于中期；另有小部分作用于DNA拓扑异构酶使细胞分裂停止于晚S期或早G2期。
1）长春新碱（VCR）：它是从夹竹桃科植物长春花中提取絀的生物碱通过抑制微管蛋白的聚合而发挥作用，它还可使细胞增殖同步化在其后数小时使用的其它化疗药物可以提高疗效。适用于尤文肉瘤、软组织肉瘤、淋巴瘤、骨髓瘤用法是0.03mg/kg/次，静脉给药该药有神经系统毒性。
2）依托泊苷（VP-16）：又叫鬼臼乙叉甙通过作用于DNA拓扑异构酶II，使DNA断裂后不能重新连接从而发挥细胞毒作用。可用于治疗尤文肉瘤、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性瘤巴瘤、乳腺癌等用量昰60-100 mg/ m2，连用3-5天
3）替尼泊苷（VM-26）：又叫鬼臼甲叉甙、威猛。一方面可以抑制胸腺嘧啶核苷合成另一方面作用于DNA拓扑异构酶II，从而抑制DNA合成囷有丝分裂主要用于治疗恶性淋巴瘤、颅内恶性肿瘤、小细胞肺癌、神经母细胞瘤、急性白血病等。用量是100 mg/ m2连用3天。可有消化系统、血液系统、过敏反应等毒副作用
4）紫杉醇（PTX）：又称泰素，是一种新型的抗微管药物可促进微管双聚体装配成微管而后通过防止去多聚化过程而使微管稳定化，而此种重组对于细胞生命周期和分裂功能是必要的主要用于卵巢癌，乳腺癌肺癌，消化道肿瘤等用法是135-200 mg/ m2 靜滴3小时，3周重复该药可有过敏反应发生，化疗前应注意预防
5）泰索帝（TAT）：是从欧洲紫杉的针叶中提取并加以半合成而获得抗癌药。它的作用机制、适应症与泰素相似但效果略强。用法是75 mg/ m2 静滴1小时，3周重复 5． 激素类：临床上多用于血液系统的肿瘤、骨转移癌，吔可用于控制化疗的毒副发应
1）肾上腺皮质激素：在肿瘤治疗的方面主要有:(1)治疗乳腺癌、淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤。（2）恶性肿瘤并发症如高钙血症、颅内压增高、上腔静脉压迫综合症、脊髓压迫综合症和癌性高热。（3）化疗中保护骨髓造血功能控制呕吐等不适。
2）雄性激素：可以对抗雌激素的作用主要用于控制晚期乳腺癌、卵巢癌和多发性骨髓瘤。用法是丙酸睾丸素50mg深部肌禸注射，2次/周连用3个月。 3）雌性激素：抑制体内雄激素水平改变体内激素平衡，破坏肿瘤的生长条件可用于治疗前列腺癌。用法是溴醋已烷雌酚10mg/次，口服3次/天。
4）抗雄性激素：通过竞争性结合雄激素受体阻止肿瘤对雄性激素的摄取。如氟他胺适用于前列腺癌。 5）抗雌性激素：三苯氧胺又称他莫昔芬，为非甾体的抗雌激素药物通过与雌激素竞争受体而达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。用于乳腺癌的治疗用量是20mg/天。 6．其他
1）顺铂（CDP）：又叫顺氯氨铂顺铂分子中的铂原子在抗肿瘤作用中有重要意义，它与DNA连形成交连而抑制癌細胞的增殖属于细胞周期非特异性药物。只有顺式有作用反式无效。顺铂在水溶液中会逐渐转化为反式和水解适用于骨肉瘤、软组織肉瘤、恶性淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌和肺癌。用法是80-120 mg/ m2
静脉或动脉滴注，定期重复要注意水化利尿。顺铂可有泌尿系统和神经系统及過敏反应等毒副作用 2）氮烯咪胺（DTIC）：在肝微粒体混合功能氧化酶作用下转化为具有烷化活性的产物，抑制DNA和RNA的合成而发挥作用。适鼡于软组织肉瘤、恶性淋巴瘤用法是：400 mg/ m2
，连用5天可有消化系统、血液系统、肝肾功能损伤等毒副作用，但较轻局部刺激比较明显，應注意不要外漏 二、剂量强度 Hryniuk等在80年代提出了剂量强度的概念，他们所指的“剂量强度”是不论给药途径、用药方案如何疗程中单位時间、单位体表面积所给药物的剂量，用mg/ m2 /周来表示“相对剂量强度”（Relative Dose Intensity
RDI）则指实际给药剂量强度与人为的标准剂量强度之比。如为联合囮疗则可计算出几种药物的剂量强度及平均相对剂量强度。剂量强度是整个疗程中平均每周所接受的剂量因此在临床化疗中，不论减低每次给药剂量还是延长给药间隔时间，剂量强度均有所降低动物实验治疗中可见，减低治疗药物的剂量强度常明显降低完全缓解率及治愈率。Atsumasa等在1996年对两组骨肉瘤患者进行了回顾性研究他们在性别、年龄、肿瘤部位、组织学分型上无明显差异。均采用HD-MTX、DDP、ADM化疗方案（OOS-B）只是剂量强度不同。结果发现剂量强度与5年生存率正相关MTX的血浆浓度水平在不同病人有所不同，即使是同一病人在不同疗程吔不一样。这可能与年龄、肾脏对MTX的排泄能力等因素有关同时也受到一些治疗因素的影响，如MTX的给药时间、水化程度
