质粒提取常见问题分析_生物科学吧_百度贴吧
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质粒提取常见问题分析收藏
1、影响质粒提取的因素有哪些？质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。2、为什么从革兰氏阳性菌中提取质粒要在悬浮液中加入溶菌酶？革兰氏阳性菌有一层细胞壁，必须加入溶菌酶才能使之溶解。3、如何根据实验需要选择不同级别的产品？&&
从纯度上：各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化，普通纯度的质粒可以满足要求；而对于转染实验，则要求使用高纯度质粒提取试剂盒方能满足要求。&&
从提取的量上：1-20μg，应选择小量提取试剂盒；20-40μg，应选择中量提取试剂盒；大于40μg，应选择大量提取试剂盒。&&
从宿主菌上：分为普通细菌质粒提取试剂盒、G+菌质粒提取试剂盒和酵母菌质粒提取试剂盒，根据情况进行选择。
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■ 未提出质粒或质粒得率较低：△ 大肠杆菌老化请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。△ 质粒拷贝数低由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。△ 菌体中无质粒有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。△ 碱裂解不充分使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液1、2和3的用量。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液1、2和3，可能有助于增加质粒提取量和质粒质量。△ 溶液使用不当溶液2、3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。△ 吸附柱过载不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。△ 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。△ 乙醇残留漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，离心吸附柱型试剂盒漂洗后应晾干吸附柱，再加入洗脱缓冲液。△ 洗脱液加入位置不正确洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。△ 洗脱液不合适DNA只在适当pH值的低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液TE (10 mM Tris•Cl, pH 8.5)或水。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使更用有利于提高洗脱效率。△ 洗脱体积太小洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但提取浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。△ 洗脱时间过短洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。■ 质粒质量不高：△ 混有蛋白不要使用过多菌体。溶液1、2、3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。△ 混有RNARNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液3之后室温放置一段时间。如果溶液1已保存6个月以上，请在溶液1中添加RNase A。△ 混有基因组DNA加入溶液2和3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，建议不要超过16小时。△溶液3加入时间过长溶液3加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。△ 含大量核酸酶的宿主菌宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用含有少量核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。△ 裂解时间过长加入溶液2后裂解时间不应超过5分钟。△ 质粒的二聚体和多聚体形式质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。
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质粒抽提常见问题与解答(精选)
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质粒抽提常见问题与解答(精选)
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核酸分离纯化实验技术指南
◆ 总RNA提取常见问题分析
1. 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不&&
足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。
2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免
RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。
3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮
速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而
&& 直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现
&& 化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完
&& 时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
4. 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。
5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。
OD260/OD280比值偏低
1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿
后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏
&& 低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力
和时间要足够。
3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致
OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。
4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀
释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏
RNA提取得率低
1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高
&& 丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量
&& 0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量&0.05μg/mg)。
2. 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂
&&&解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。
◆ 质粒DNA提取常见问题分析
未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
1. 大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2. 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝
3. 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。
&& 另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
4. 碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、
P2和P3的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助
&& 于增加质粒提取量和提高质粒质量。
5. 溶液使用不当：溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的
溶液，才能使用。
6. 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若
用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很
&& 高的生长率，则需减少LB培养液体积。
7. 质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
8. 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。
9. 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达
到最大洗脱效率。
10. 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，
&&&&pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值
&&& 在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后
&&&&使用，有利于提高洗脱效率。
11. 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度
降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
12. 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1分钟可达到较好的效果。
质粒纯度不高，如何解决？
1. 混有蛋白：不要使用过多菌体。经溶液P1、P2、P3处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微
&&&小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。
2. 混有RNA：RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液
P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNaseA。
3. 混有基因组DNA：加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从
而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间
&&&过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。
4. P3溶液加入时间过长：P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。
5. 含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒
DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。
6. 质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，
单酶切处理后可变成单一条带。
◆ DNA片段纯化与回收常见问题分析
利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片段？
可能有以下几个原因：
1. 胶块未完全溶解，可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解；
2. 胶块体积太大，应先将其切为小块，分多次回收；
3. 电泳缓冲液pH太高，硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整；
4. 漂洗液中未加入无水乙醇。
能否改用去离子水洗脱？
可以。但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当调高其pH值，以增加洗脱得率。
回收DNA进行后续酶切实验？
洗脱产物含有残留的乙醇会影响酶切，请确保彻底去除漂洗缓冲液，具体方法参见回收效率低的解决方案。
可否使用更小洗脱体积(小于说明书提供的最小洗脱体积)进行洗脱以提高浓度？
不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。
电泳检测只有一条目的带，可否选用凝胶回收试剂盒？
可以。如果后续实验对片段纯度要求较高，建议即使只有一条带，也可以切胶纯化，其回收得到片段的纯度可能要比直接回收高一些。
琼脂糖凝胶胶块不溶？
1. 琼脂糖质量不好。2. 含目的片段的凝胶再空气中放置过久，使胶块失水、干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存在4℃或-20℃。3. 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
欲了解更多的实验常见问题分析请参考《TIANGEN实验技术手册》之系列专题。
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请教细菌质粒提取的具体步骤和注意事项。谢谢大家！
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质粒提取都有专门的试剂盒，按照盒子的说明书一步步操作即可，一般都没什么问题的。可根据你的后续试验选择盒子，如果你的试验对质粒的含量和纯度要求相当高，可选择Qiagen的，就是特别贵，没有太高要求的话随便一个盒子就行，都管用的，呵呵...
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呵呵，你先说说你的问题呗，具体的，
该用户从未签到
生物秀探花
1. 质粒制备的基本原理是什么？
答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。
2. 质粒 DNA 制备的关键是什么？
答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。
3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？
答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。
4. 如何确定质粒小抽细胞的用量？
答：根据实验目的确定质粒的需求量。对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。
5. 电泳分析抽提的质粒会看到什么？
答：如果您制备的质粒很脏，从电泳加样孔起，您会看依次看到微量的基因组DNA, 开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒（denatured supercoiled plasmid）, 细菌RNA。判定质粒制备质量高低的标准是观察超螺旋质粒在整个抽提DNA中的百分比。质量高的主要部分为超螺旋质粒，没有变性超螺旋质粒和没有基因组，没有RNA污染。
6. 质粒制备的得率是由哪些因素决定的？
答：由细胞拷贝数，细胞的用量，属主细胞类型和和纯化方式。
7.您的质粒需要什么样的纯度？
答：根据您的实验目的确定您需要的纯度。对于一般的克隆分析鉴定，用手工和试剂盒制备的DNA都能达到要求。测序需要将质粒中的非核酸类杂质和RNA的水平控制在非常低的水平。基因组的存在对测序影响不大。开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒的测序效果基本相似。转染细胞纯度较高，用于基因治疗的最高，需要无热源，无内毒素 （LPS）。
8. 为什么酶切鉴定“有插入片段”的质粒测序却发现是空的？
答：这种现象测序经常会发现，有些用户怀疑是我们搞错了。请相信，测序不可能将您的片段搞丢，测序结果是硬指标。产生这种现象的直接原因是质粒制备过程中产生了变性的超螺旋质粒，它无法被限制性内切酶酶切；而正常的超螺旋质粒，酶切后变成线性分子，迁移率变小，酶切后变性与正常超螺旋质粒之间的距离加大。变性的超螺旋质粒和正常的超螺旋质粒在酶切前靠得比较近，常被忽略。电泳分析酶切效果时，变性的超螺旋质粒常常被误认为是酶切下来的片段，导致误判。其实要判定这种假象非常容易，只要在酶切电泳分析时，增加不做酶切的对照就可以了。
9. 如何判定DNA 的纯度和浓度？
答：对于采用试剂盒抽提的DNA, 测定OD260和OD280浓度，OD260/OD280一般在1.7-1.8之间。1 OD260 = 50 μg/ml。需要注意的是，用简单手工抽提的DNA，OD260/OD280没有多大意义，由于含有水解的核酸小片段，该比值偏高。需要通过琼脂糖电泳来估计浓度。
10.为什么有些纯化的质粒时间长了会发生降解？如何解决 ？
答：有人将问题的责任推到试剂盒的生产商，冤枉了。产生此的原因有很多，主要原因是核酸酶的污染。除了制备过程外源带入核酸酶外，但是根据有关报道发现，质粒属主细胞的种类会影响抽提核酸的质量。理想的用于抽提高质量质粒的细胞有DH5alpha, DH1, C600, XL1-Blue；HB101, JM系列细胞内含丰富的核酸酶活性，如果您制备的质粒准备长期保存，请换属主细胞。
11. 为什么小抽可以，一放大就不行了？
答：此种情况经常会发生，常使研究人员感到很困惑。原因主要出在大规模制备时细胞接种量和方式有问题，细胞裂解时溶液的用量和处理时间把握不准所致。大规模细胞培养正确的方式是从新鲜培养板上挑单克隆接种到2-5ml含合适抗菌素的培养基中，培养到对数期（8小时左右）；放大培养时需要将种子稀释 500-1000倍继续培养12-16小时（通常是过夜培养）。摇瓶培养，摇瓶所接的培养基不要超过摇瓶总体积的25%。转速达到250转/分。
收集细胞没有什么讲究，采用的速度能将细胞沉下来就可以了。速度过高，细胞悬浮比较困难。大规模碱法制备需要选用合适的细胞用量，一般原则是细胞宁少勿多，溶液宁多勿少，变性时间宁短勿长。大规模制备采用的裂解溶液与细胞重量的比例小于小抽，细胞的裂解效果成为得率和纯度高低的关键。如果裂解不完全或采用的细胞过多，很多质粒不能充分的释放出来，有些释放出来的质粒也会滞留在各种沉淀物之间无法回收。NaOH-SDS (Solution II)变性过程是关键，溶液加入后通过上下颠倒小心混匀，如果发现细胞很难变澄清，表明溶液少了，整个变性过程应控制在5-10分钟，如果条件许可，预冷所有溶液。加入合适量的中和液(Solution III)要上下颠倒小心混匀数次，让抽提物真正做到中和，使基因组 DNA，蛋白质，细胞碎片充分的沉淀下来，才能保证后续可以得到高纯度的质粒。
还有一点需要强调是，接种的克隆新鲜十分关键。甘油菌，4度保存的菌液，时间很长的划板或转化板，都不是理想的种子。如果没有做过传代实验，不要直接采用甘油菌接种做大抽。
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