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&&细胞生物学
Life 旗下Gibco品牌常用北京产培养基
Description
2014 List Price
CBT - RPMI ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - DMEM ?500ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - DMEM ?500ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - DMEM ?500ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - DMEM ?500ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - HBSS ?500ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - DPBS ?500ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - DMEM ?500ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - RPMI ML, PLASTIC, E-Z HOLD
CBT - DMEM NUTRIENT MIX F12 ?500ML, PLASTIC, E
Phosphate Buffered Saline (PBS) 7.4 (1X), liquid&&
Phosphate Buffered Saline (PBS) 7.2 (1X), liquid&&
MEM EARLES &500ML, PLASTIC, E-Z HOLD
F 12 NUTRIENT MIX, HAMS
MED 199 EARLES
细胞凋亡检测-Annexin V法
一、细胞凋亡的形态学检测1 光学显微镜和倒置显微镜　　（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。　　（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。　　2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。　　常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。　　结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。　　3 透射电子显微镜观察　　结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
细胞凋亡检测-形态学
一、细胞凋亡的形态学检测1 光学显微镜和倒置显微镜　　（1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。　　（2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。　　2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜　　一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。　　常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。　　Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。　　DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。　　结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。　　3 透射电子显微镜观察　　结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
细胞分裂指数测定
一、原理体外培养细胞生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。分裂指数指细胞群体中分裂细胞所占的百分比，它是测定细胞周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。二、仪器、用品与试剂1、仪器与用品：CO2培养箱、普通显微镜、细胞培养血、盖玻片、吸管2、试剂：培养液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液三、操作步骤1、消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。2、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。3、取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。4、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。5、计算:分裂指数=分裂细胞数/总细胞数×100% 四、注意事项操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。附：Giemsa染液配制：称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。56℃中保温90―120分钟。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。
细胞技术及活力测定
一、原理 培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。用台盼兰染细胞，死细胞着色，活细胞不着色，从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。二、仪器、用品与试剂 1、仪器与用品：普通显微镜、血球计数板、试管、吸管、酶标仪（或分光光度计）2、试剂：0.4％台盼兰，0.5％四甲基偶氮唑盐（MTT）、酸化异丙醇3、材料：细胞悬液三、操作步骤 （一）细胞计数1、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。3、静置3分钟。4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。（二）细胞活力1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。（三）MTT法测细胞相对数和相对活力活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。l、细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。2、沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。3、37℃下保温2小时。4、加入4―5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。附：1、0.4%台盼兰染液配制： 台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml。2、MTT配制：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入HCl使最终达0.04mol/L。
细胞支原体污染的PCR检测
支原体菌株来源： &&&&&&M.Arginini&ATCC23838&精氨酸支原体 &&&&&&M.FermentaneATCC19989发酵支原体 &&&&&&M.SalivariumATCC23064唾液支原体 &&&&&&M.HominisATCC23114人型支原体 &&&&&&M.OraleATCC23714口腔支原体 &&&&&&M.HyorhinisATCC29052猪鼻支原体 &&&&&& 其共同引物序列来自16s和23s保守区域 外部引物为Ｆ1&5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′ &&&&&&&&&&Ｒ1&5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ-3′； 内部引物为Ｆ2&5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′ &&&&&&&&&&Ｒ2&5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′& ＰＣＲ反应体系和条件： 10×缓冲液(10ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌ、500ｍＭＫＣｌ、20ｍＭＭｇＣｌ2、0.01%明胶)、 ＰｒｉｍｅｒＦ1、Ｒ1、Ｆ2、Ｒ2的浓度为2ｎｍｏｌ/μＬ、 2.5ｍＭｄＮＴＰｓ、 Ｔａｑ酶、 Ｈ2Ｏ、 石蜡油覆盖 反应温度和时间为: 94℃&/2ｍｉｎ预变性、94℃/30ｓ变性、55℃/1ｍｉｎ退火、72℃/1ｍｉｎ延伸 循环30次后72℃延伸5ｍｉｎ 第1次ＰＣＲ反应取模板&10μＬ,第2次ＰＣＲ反应以第1次ＰＣＲ扩增产物为模板取1μＬ。& 下面是更详细的：& 污染测试――支原体：PCR方法& 原理：&利用具特殊专一性之primers，经由PCR反应来复制mycoplasma&DNA。所用之primers来自mycoplasma之conserved&16S-23S&rRNA序列，由于此段spacer之序列依mycoplsma种类不同而不同，因此可依所复制之DNA大小及其restriction&fragment大小差异来作侦测与鉴定。& 特点：灵敏(e.g.&0.1~1.6&CFU&/&5&ul&sample)&与快速(一天)。可侦测不易培养之mycoplasma&(e.g.&M.&hyorhinis)。不需培养mycoplasma作为正反应对照组，避免可能之污染。& 缺点：PCR反应很灵敏，易有伪阳性结果。此方法尚在评估中，故结果仅作为参考和内部品管之一部份。& 材料与设备：& &&&&&&ATCC&mycoplasma&detection&kit:可作50～100&reactions.& &&&&&&提供1st&stage&primer&mixture与2nd&stage&primer&mixture& &&&&&&positive&control&DNA&(A.&laidlawii&;&M.&pirum)& &&&&&&PCR&reagents&:& &&&&&&Taq&polymerase&(&5&U&/&ul&)& &&&&&&dNTP(&dGTP,&dCTP,&dTTP,&dATP,&1.25&mM&each&)& &&&&&&10x&PCR&buffer&(with&1.5mM&MgCl2)& &&&&&&25mM&MgCl2& &&&&&&sterile&ddH2O& &&&&&&Machine&/&Equipment：& &&&&&&PCR&thermal&cycler& &&&&&&agarose电泳设备& &&&&&&DNA电泳胶体观察设备& &&&&&&无菌PCR反应管& &&&&&&无菌1.5&ml微量离心管& &&&&&&无菌2ul,&20ul,&200ul,&1000ul&Tips/&Pipetmans& 方法：&此PCR反应是一种nested&PCR，包括2阶段PCR反应，1st&stage&PCR结束后，取其反应物作2nd&stage&PCR，然后取2nd&PCR产物作agarose&gel&electrophoresis，依DNA&band之有无及片段大小来分析结果。& 结果：使用UV&light观察，并照相记录。& 不过应用较多还是巢式PCR& 方法：此PCR反应是一种nested&PCR，包括2阶段PCR反应，1st&stage&PCR结束后，取其反应物作2nd&stage&PCR，然后取2nd&PCR产物作agarose&gel&electrophoresis，依DNA&band之有无及片段大小来分析结果。& 结果：使用UV&light观察，并照相记录。& 方法再详尽点：1st&stage&PCR&reaction（total&volume&25&ul）：& &&&&&&&测试样品&(&2&ul&/&each&)& &&&&&&&直接取样测试细胞之培养液。& &&&&&&&Positive&control&:&mycoplasma&DNA&(&A.&laidlawii&;&M.&pirum&)& &&&&&&&Negative&control&:&ddH2O& &&&&&&&Reaction&mixture&(&23&ul&/&each&)& &&&&&&&10x&PCR&buffer&(含1.5&mM&MgCl2&)&2.5&ul& &&&&&&1st&stage&primer&mixture&0.5&ul& &&&&&&&dNTP&(&1.25&mM&each&)&1.0&l& &&&&&&&MgCl2&(&25&mM&)&0.5&ul& &&&&&&Taq&DNA&polymerase&(&5&U/ul&)&0.1&ul& &&&&&&&ddH2O&18.4&ul& PCR&program&(&1st&PCR与2nd&PCR相同)：使用PCR&thermal&cycler& &&&&&&step&1&:&denaturation:&94&℃&30&sec& &&&&&&step&2&:&denaturation:&94&℃&30&sec& &&&&&&step&3&:&annealing:&55&℃&2&min& &&&&&&step&4&:&extension:&72&℃&2&min& &&&&&&重复3.1.3.2至3.1.3.4步骤30&cycles& &&&&&&step&5&:&final&extension&72&℃&5&min& 2nd&stage&PCR&reaction（total&volume&25&ul）& &&&&&&测试样品：1st&stage&PCR&product（1&ul&/&each）。& &&&&&&&Reaction&mixture&(&24&ul&/&each&)& &&&&&&10x&PCR&buffer&(含1.5&mM&MgCl2&)&2.5&ul& &&&&&&&nd&stage&primer&mixture&0.5&ul& &&&&&&dNTP&(&1.25&mM&each&)&1.0&ul& &&&&&&MgCl2&(&25&mM&)&0.5&ul& &&&&&&Taq&DNA&polymerase&(&5U/ul&)&0.1&ul& &&&&&&ddH2O&19.4&ul& &&&&&&PCR&program同3.1.3；使用PCR&thermal&cycler& 胶片电泳分析& &&&&&&胶片&(2.0%)&置备:&将2&g&agarose溶于100&ml&(&1x&)&TAE&buffer。& &&&&&&电泳液：(1x)&TAE&buffer（Tris-acetate/EDTA&electropheresis&buffer）& &&&&&&选择100~500&bp&DNA&size&Marker：取100&bp&ladder&Marker&5&ul&(&25&ng/ul&)& &&&&&&取10&ul&2&nd&stage&PCR产物分析，各加入2&ul&(&6x&)&loading&dye。& &&&&&&进行电泳分离100V,&25&min。& &&&&&&胶片染色：ethidium&bromide染色10&min，H2O退染10mim。（EtBr为致癌物质，请戴手套并小心操作）& &&&&&&结果：使用UV&light观察，并照相记录。
细胞支原体污染的一般情况及预防措施
细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。
各国细胞库支原体污染的统计表，如下：&&&&&&国家　 受支原体污染(%) 报告年度&&&&&&USA－FDA 15 1993(past 30 years)&&&&&&USA－ATCC 15-20 1992&&&&&&Japan－(IFO，RIKEN，JCR 80~30~22 931998&&&&&&Germany－DSM 36 &&&&&&Argentina 65 1987&&&&&&Israel 32 &&&&&&China 95 1990
造成支原体高污染率的原因为：&&&&&&&1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）&&&&&&&2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化&&&&&&&3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式&&&&&&&4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染&&&&&&&5、研究或操作人员忽略污染问题
支原体污染了来源：&&&&&&1、已受污染的细胞&&&&&&&2、操作人员的疏失&&&&&&&3、已受污染的培养基、血清&&&&&&&4、操作环境不良、实验器具不洁等
由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染：&&&&&&&1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）&&&&&&&2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine&&&&&&&3、Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意：
设备方面：&&&&&&&1、使用已作支原体测试ok之细胞株&&&&&&&2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞&&&&&&&3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞&
检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求
有关支原体污染之问题与回答：
1、应如何避免细胞污染？&&&&&&细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
2、如果细胞发生微生物污染时， 应如何处理？&&&&&&直接灭菌后丢弃之。
3、支原体 (mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？&&&&&&不能。 除极有经验之专家外， 大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。
4、支原体污染会对细胞培养有何影响？&&&&&&支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为 mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
5、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？&&&&&&直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
支原体之检测：
直接培养法
&原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来 (例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
材：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco ) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿v60x15mmw、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
培养基制备：
基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
? 10x stock solution (1 liter) ：称取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于 -70℃。
? 液体培养基 (1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解蛑10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
? 固体培养基 (1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50L之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
? 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
? 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
? 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
结果判读：
? 支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。
? 典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。
? 若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agar plate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agar plate，若是细胞则不会生长。
细胞支原体污染的荧光检测方法
DNA荧光染色法：
1.原理：利用荧光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。
2.测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养 液接种于指示细胞培养液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培养指示细胞再作荧光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicator cell内作为对照。
3.待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。
4.特点：简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M. hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。
5.缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。
1.Hanks’ balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL ：、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate内放置无菌22x22mm盖玻片：浸于酒精内，使用前过火灭菌：，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。
2.Indicator cells：Vero(African green monkey kidney,ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，细胞须先测试无污染。αMEM with 10%FBS( medium for Vero cell)
配制试剂：
1.无菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。
2.Hoechst 33258 stock solution（100X）：称取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。
3.Hoechst 33258 working reagent：取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。
4.mounting solution：22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。
5.固定溶液（fixative）：冰醋酸与甲醇以1：3之体积比例混合，使用前才配制。
1.培养Vero细胞： Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。
2.在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4 cells／ml培养于chamber slide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃, 5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。
3.接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养 液（可将细胞稍微刮下：，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。
4.将测试样品加入chamber slide内，培养5天后，进行Hoechst 33258的荧光染色观察。
5.以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero细胞作为正反应对照组：或是已感染支原体之细胞培养 液或冷冻细胞液：，负反应对照组为Vero cell之新鲜培养基( αMEM +10%FBS)。
6.DNA荧光染色检测： ①取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2ml 1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。②于每个well中，加入1ml Hoechst 33258 working solution，室温下静置30min。③吸掉Hoechst 33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mounting solution，并以盖玻片覆盖之。④以100x-400x荧光显微镜观察。打开水银光源10 min后，以UV激发光束(330～380 nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或是丝状点之荧光物产生。 结果判读：
若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其荧光可维持数星期。图例 (A)为negative result ： 荧光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positive result ： 在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。
(A)Negative result 荧光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。
293细胞的大规模培养
293细胞是腺病毒载体的包装细胞。腺病毒是继逆转录病毒后用于基因治疗研究的热门载体。直接将腺病毒载体导入人体内表达目的基因，治疗恶性肿瘤，心血管疾病或一些遗传疾病已取得可喜进展；利用腺病毒载体在包装细胞 293中表达分泌性蛋白质，如蛋白酪氨酸激酶 1C等亦成为生产重组蛋白的一条途径。因此完善 293细胞的大规模培养技术具有越来越重要的市场意义。哺乳细胞的大规模培养方式有三种：贴壁培养，微载体培养，无血清悬浮培养。这三种方式均可用于 293细胞的大规模培养。
293细胞特性
293细胞是用5型腺病毒75株系转化，含有Ad5 E1区的人胚肾细胞。它是加拿大McMaster University的F.L.Graham与J.S.Miley于1976年用DNA转染技术构建而成。293细胞是贴壁依赖型成上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许Ad5和其他血清型腺病毒在其上增殖。293细胞为人亚三倍体细胞系。293细胞在无Ca2+或含Ca2+培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中。
转瓶培养一般用于小量培养到大规模培养的过渡阶段，或作为生物反应器接种细胞准备的一条途径。与传统静止单层培养相比，转瓶具有三大优点：为细胞提供较大的生长表面；轻微的转动可以防止培养液中形成的某些成分对细胞生长可能产生的影响；细胞大部分时间仅覆盖一薄层培养液，有利于气体交换。我们已成功实现293细胞的转瓶培养。由于293细胞对生长环境的改变较为敏感，细胞容易成团，因此维持稳定的温度，酸碱度和转动速度对细胞正常均匀生长至关重要。现在使用的转瓶培养系统包括二氧化碳培养箱和转瓶机两部分。293细胞接种后，维持适当的转速培养。不同的细胞转速略有不同。细胞的均匀分散贴壁情况与培养液温度，瓶子的转动速度和细胞特性有关。在5-6天的培养周期中，细胞量可增殖20倍。
反应器贴壁培养
此种培养方式中，细胞贴附于固定的表面生长，不因为搅拌而跟随培养液一起流动，因此比较容易更换培养液，不需要特殊的分离细胞和培养液的设备，可以采用灌流培养获得高细胞密度，能有效地获得一种产品；但扩大规模较难，不能直接监控细胞的生长情况，故多用于制备用量较小，价值高的生物药品。 CelliGen，CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器是常用的贴壁培养式生物反应器，用于细胞的贴壁培养时可使用篮式搅拌系统和圆盘状载体。此载体是直径6毫米的无纺聚酯纤维圆片，具有很高的表面积与体积比(1200cm2/g)，有利于获得高细胞密度。篮式搅拌系统和载体培养是目前贴壁细胞培养使用最多的方式，除用于293细胞的培养外，还用于杂交瘤细胞培养，Hela细胞培养，CHO细胞培养及其它细胞培养。此种方式培养293细胞，细胞接种后贴壁快，接种1小时后细胞贴壁率可达98%以上，采用灌流培养。整个培养周期约7-10天，细胞增殖25-50倍。
微载体培养
微载体是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞，生产蛋白质产品，如293细胞，成肌细胞，Ve r o细胞，CHO细胞。常用商品化微载体有三种：Cytodex ，Cytopore和Cytoline。 使用较多的反应器有两种：贝朗公司的BIOSTAT B反应器，使用双桨叶无气泡通气搅拌系统；NBS公司的CelliGen，CelliGen PlusTM和Bioflo3000反应器，使用Cell-lift双筛网搅拌系统。两种系统都能实现培养细胞和收获产物的有效分离。微载体培养293细胞，首先要选择合适的微载体类型和搅拌速度。接种细胞可用1L spinner微载体培养系统或是其它贴壁培养方式准备，采用灌流培养，培养周期10-15天，能达到的细胞密度为5-10×106/ml。
无血清悬浮培养无血清悬浮培养是用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养方式，它能减少后期纯化工作，提高产品质量，正逐渐成为动物细胞大规模培养的研究新方向。要实现293细胞无血清悬浮培养必须先将贴壁培养293改造为悬浮培养293S细胞并寻找适合高密度无血清培养的培养液配方。悬浮培养时，由于缺少血清和蛋白的保护作用，293S对剪切力的敏感度增加，难以达到高密度培养，导致293S产生病毒的数量比贴壁培养低5-10倍左右。细胞接种后，灌流培养7天，达到细胞密度5×106/ml，增殖5-10倍。
不管是哪种培养方式，首要的一点是必须操作规范，防止污染；其次根据需要选择合适的293细胞培养方式，对细胞生长状况实行有效的监控，以便获得稳定的蛋白或病毒产物
原代细胞的培养与建系
细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术,才可能更快捷地学习和掌握其他方法,本章重点叙述常用的基本技术。&& 第一节&原代细胞的取材&& 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下：&& 一、取材的基本要求&& （1）取材要注意新鲜和保鲜&新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。&& （2）取材应严格无菌&所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。&& （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。&& （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织时应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿中进行。&& （5）取材应注意组织类型、分化程度、年龄等，一般来讲，胚胎组织较成熟个体组织容易培养，分化低的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。&& （6）原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录，以备以后查询。&& 二、各类组织的取材技术&& (一)&皮肤和粘膜的取材&& 皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要组织来源，主要取自于手术过程中的皮片，方法似外科取断层皮片手术操作，但面积一般2~4cm2即可，这样局部不留疤痕，若对烧伤皮肤进行上皮细胞膜片移植，可从大腿或臀部取较大皮片，可取2~4cm2皮片，但取材时不要用碘酒消毒；若培养上皮细胞，取材时不要切取太厚，尽可能去除所携带的皮下或粘膜下组织；若欲培养成纤维细胞，则反之。皮肤粘膜与外界相通部位，因表面细菌、霉菌很多，取材时应严格消毒，必要时要用高浓度抗菌素和适量两性霉素B漂洗、浸泡。&& (二)内脏和实体瘤的取材&& 内脏除消化道外基本是无菌的，但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位，实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染，尽量去除混杂的结缔组织，否则培养后，由于成纤维细胞的生长给以后的培养工作增加困难。对于一些特殊细胞培养的取材，详见后面有关章节。&& (三)血液细胞的取材&& 血液及淋巴组织中的血细胞、淋巴细胞的取材，一般多抽取静脉外周血，或从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞，取材时应注意抗凝，通常采用肝素抗凝，常用肝素浓度为8~10u/mL血，抽血的针筒也要用肝素湿润，若从血站取来的献血员的血液，因血站不用肝素抗凝剂，常用含枸椽酸盐抗凝，对此类血标本千万不能用含钙、镁离子的洗液来处理细胞，因此时的钙、镁离子可加速血液中凝血酶促进血液凝固而影响收获血细胞及淋巴细胞。此外要严格无菌，尽量新鲜使用。&& (四)骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材&& 取上述标本时，除严格无菌，注意抗凝外，还要尽快分离培养，一般无需其他处理，离心后，用无钙、镁PBS洗两次，再用培养液洗一次后即可培养，不宜低温存放。具体操作详见后面有关章节。&& (五)动物组织取材&& 1、鼠胚组织取材&& 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物，然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中，5分钟后（注意时间不能太长，以避免酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力），取出动物，在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢，切开皮肤，用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤，用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，然后再固定，更换无菌解剖器材，采用无菌操作法解剖取出胚胎。&& 2、幼鼠胚肾（或肺）取材&& 幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切开游离毛皮并拉开至两侧：然后采用无菌法打开胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先将背部毛皮切开游离并拉向两侧，然后采用无菌法从背部打开腹腔取肾。&& (六)人胚体组织取材&& 在局部先用碘酒后用75%酒精棉球消毒，无菌法取人胚肺（肾），方法与鼠类相同。&& (七)鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材&& 取孵化至适当胚龄（9~12天）的胚蛋，用照蛋灯在暗处灯检，若有丰富血管、胚体有运动的胚蛋，说明胚体发育良好，并用有色笔划出气室和胚体位置。将胚蛋置于蛋架上，先用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干，经碘酒、75%酒精消毒后，在无菌条件下采用无菌法用剪刀或中号镊子打开气室，沿气室边缘去除蛋壳，再用眼科镊撕去壳膜，暴露出鸡胚，再用弯头镊轻挑起胚头，取出胚胎，放入无菌平皿中，解剖取材。&& 第二节&原代细胞的分离和制作&& 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：&& 一、悬浮细胞的分离方法&& 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。&& 二、实体组织材料的分离方法&&& 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。&& （一）机械分散法&& 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。&& （二）消化分离法&& 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。&& 1、酶消化分离法&& &&&&&&&&酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：&& （1）&胰蛋白酶分散技术&&& 胰蛋白酶（简称胰酶）是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。&& ①细胞类型&胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如&乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效，但若与胶原酶合用,就能增加其对组织的分离作用。&& ②酶的活力&市售的胰蛋白酶,其活力都经过测定而有效，但配制时必须新鲜，需保存在低温冰箱中，消化时的pH和温度都要适宜，否则会影响活力，细胞的分散直接与酶的活力有关，最终使用活力为1:200或1:250，56℃pH8.0时活力最强。&& 该酶为粉剂，保藏时要防潮，室内温度不宜过高，保存时间不能太长，若粉剂结团块,说明该部分受潮或失效。&& ③酶的浓度&胰蛋白酶一般采用的浓度为0.1%-0.25%(活力1:200或1:250),但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长。浓度高对细胞有毒性，而较低浓度的胰蛋白酶在培养液中可促进细胞的增殖，若培养液中加入血清，其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。&& ④温度&一般认为胰蛋白酶在56℃时活性最强，但由于对细胞有损害而不能被采用，常使用的温度为37℃，通常在37℃进行消化比室温作用快。&& ⑤pH&pH8~pH9是胰蛋白酶活力适宜范围，但随碱性的增加其活力也随之减少，活性强分散快，细胞也容易被消化下来，消化分离细胞时PH只能选用7.6～8.0之间，否则对细胞有损伤。&& ⑥无机盐离子&若用含有钙和镁的盐类溶液来配制胰蛋白酶时，可以发生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制时应采用无钙镁离子的PBS配制。&& ⑦消化时间&如果细胞消化时间过长，可以损害细胞的呼吸酶，从而影响细胞的代谢，一般消化时间为20分钟为宜，冷消化时使用低浓度消化液，于4℃过夜也可。&& 分离方法如下：&& ①过夜冷消化&将取得的组织用Hanks液洗三次，剪成碎块大小为4毫米左右，用Hanks液洗2~3次以除去血球和脂肪组织，再加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜，次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2~3次，然后，加入少量营养液吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。&& ②多次提取消化法&多次提取消化法有以下三种：&& 热消化多次提取――将剪碎的细胞块加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分钟，然后经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养，然后将留下的未彻底消化的组织按上述方法操作，再消化提取细胞。&& 冷消化多次提取――方法同上，只是消化温度为4℃。&& 先热消化后冷消化――将组织块先用胰蛋白酶于37℃下消化20分钟经洗涤后用营养液分散，制成悬液，剩余未消化的小组织块经洗涤后用胰酶于4℃下过夜，次日再提取细胞，分散成悬液，分瓶培养。&& （2）&胶原酶（Collagenase）消化法&&& 胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。该酶分离效果好，即使有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，即操作简便又可提高细胞成活率，最终浓度200u/mL或0.1～0.3mg/mL。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。&& 经过胶原酶消化后的上皮组织，由于上皮细胞对酶有耐受性，可能有一些上皮细胞团块尚未被完全消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要再进一步消化处理。&& 鉴于胰蛋白酶和胶原酶的生物学活性（见表4-1）和在不同浓度下消化各种组织小块所需的时间（小时）有差异（见表4-2），以及两者价格不等，有人采用胶原酶与胰蛋白酶并用，同时还可加透明质酸酶（对细胞表面糖基有作用），采用两者的联合消化作用，对分散大鼠和兔肝、癌组织非常有效。&& 表4-1&胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别&& 项&目&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&胰蛋白酶&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&胶原酶&& 消化特性&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&适用于消化软组织&&&&&&&&&&&&&&适用于消化纤维多的组织&& 用&量&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&0.01%～0.5%&&&&&&&&&&&&&&&&&&0.1～0.3mg/mL(200u/mL)&& 消化时间&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&0.5～2小时（小块）&&&&&&&&&&&&&&&1～12小时&& pH&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&8～9&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&6.5～7.0&& 作用强度&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 强烈&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &缓和&& 细胞影响&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&时间过长有影响&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&无大影响&& 血清、钙、镁离子&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&有影响&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&无影响&& 表4-2&胰蛋白酶和胶原酶在不同温度下消化各种组织小块时所需时间(小时)(0.5～1cm3)&酶&种&类&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&较&硬&组&织&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&软&组&织&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&4℃&室&温&37℃&&&&&&&&&&&&&&&&&&&4℃&室&温&37℃&& 胰蛋白酶(0.25%)&&&&&&&&&&&&&&&&&&24～48&1～6&1～2&&&&&&&&&&&&&&&&&12～24&1～2&0.5～1&& 胶原酶(200u/mL)&&&&&&&&&&&&&&&&&&&24&&&6&&&6.5&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&12&&&3&&&0.25&& 两者联合(对冲)&&&&&&&&&&&&&&&&&&12～46&12～24&4～12&&&&&&&&&&&&&&&&12～24&6～12&1～2&& 除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶，近年来，还有一种从灰霉菌中提取的Pronase新酶分散细胞更佳。&& 2、非酶消化法（EDTA消化法）&& EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为乙烯二胺四乙酸。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离，缺点是细胞易裂解或贴壁细胞从瓶壁上脱离时呈片状，有团块，常不单独使用，但可与胰蛋白酶混合使用（1:1或2:1），不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。&& 消化分离法的操作步骤：&& （1）剪切&把组织块剪碎，呈1~5mm3大小的组织块。&& （2）&加液漂洗&将碎组织块在平皿（或三角烧瓶）中用无钙镁PBS洗2-3次（采用倾斜，自然沉降法）。&& （3）消化&加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。&& （4）弃去消化液&采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。&& （5）漂洗&将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗2-3次后，加入完全培养基。&& （6）机械分散&采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或3~4层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降5~10分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。&& 注意事项如下：&& （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。&& （2）胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。&& （3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失。&&& 三、原代细胞的培养方法&& 原代细胞的培养也叫初代培养&是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。&& 原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。&& 1、组织块培养法&& 组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。& 其培养方法如下：&& (1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。&& (2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2&cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。&& (3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不去搬动，以利贴壁和生长，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。&& 原代细胞培养－2&& 2.消化培养法&& 该方法是采用前述的消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质（包括基质、纤维等）去除，使细胞分散形成细胞悬液，然后分瓶培养。&& 某些特殊类型细胞，如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤，将在有关章节中叙述。&& 3.悬浮细胞培养法&& 对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。&& 4.器官培养&& 器官培养是指从供体取得器官或组织块后，不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养，其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活，器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同，但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培养可保持器官组织的相对完整性，可用于重点观察细胞间的联系、排列情况和相互影响，以及局部环境的生物调节作用。体外器官培养为临床上的器官移植创造了便利的条件。器官培养的条件与细胞培养不同，要有特殊的要求。&& 1.&器官培养的特殊的要求&& (1)需要特殊的培养条件&因器官离体培养，其营养和氧气仅靠自然渗透来供给，因此，培养时为了确保中心不发生缺乏氧和营养而造成坏死，其厚度或直径不宜超过1mm。&& (2)器官内部细胞需要有足够的氧气渗入&常采用以下两种方法：&& a.&将器官组织块置于培养基气液面以利于气体交换。&& b.&提高培养基中的氧分压，一般需加注纯氧，提高氧分压时仍需保持5%&CO2，以维持pH。&& 2.&器官培养的方法&& (1)将不锈钢网做成的支架，放置于培养皿中，高度为1/2皿高，使其表面铺上0.5mm孔径的滤膜。&& (2)将培养基加入平皿中，使培养液刚刚接触到滤膜，但不要使滤膜浮起。&& (3)将要培养的器官组织平放在滤膜上，一般厚度不要超过200μm，水平面积不超过10mm2，如为肝、肾不能大于1mm2。&& (4)将培养物置于CO2培养箱内，并加注氧气，调整氧分压达90%，培养时注意使液面与膜保持在一致的水平上。&& (5)上述器官培养1~3周（每隔2~3天换液一次）后可用于实验和检测。&&&& 第三节&原代和传代细胞的培养和维持&& 一、原代细胞的培养与维持&& (一)原代细胞培养&& 1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)&& 凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%，有条件的应在37℃&5%&CO2的培养箱中培养，在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。若原代贴壁细胞不是用于长期培养，只是用于分离繁殖或测定病毒之用，其细胞浓度可以加大，尽量贴成厚层以利病毒的效价提高和测定结果（如空斑）更加明显、准确，待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH若有明显变化，应将原代细胞换液，即倒去旧液，换入新鲜的培养基，以便除去衰老、死亡的细胞和陈旧的培养基，使贴壁细胞能获得充足的营养。&& 若用骨髓或外周血中的悬浮细胞经静置培养1周时，可有少量的肌样纤维间质细胞或基质细胞开始贴壁生长，为了利于该贴壁细胞充分贴壁和生长，此时换液应将细胞悬液经低速离心后，按半量换液方式弃去旧液加入新液，然后再将细胞悬液放入原瓶中继续培养，经反复几次换液后，贴壁肌样细胞逐渐形成网状，此时换液可将原悬浮细胞和培养基移入另一新瓶，然后分别补加新鲜培养基(也按半量换液方式分别对半加入新液)继续培养，原瓶的贴壁细胞逐渐长成单层，而新瓶中又会出现二次贴壁细胞，经几次换液也会逐渐长成单层，在此类细胞培养时，培养基中往往需加入少量的维生素D3、bFGF、地塞米松、小牛血清（浓度要在20%以上），以利细胞贴壁生长。&& 2、悬浮细胞的培养&& 凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞。若作用于试验的短期培养，可在含10%小牛血清的RPMI1640培养基中进行培养，细胞浓度可在5～8×109/L范围内，然后进行分瓶试验。若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。但千万不能急于传代，一定要待细胞密度较高时才能进行，以防传代失败。
无血清培养基
&&&&&&&&无血清培养基(serum&free&medium,SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子；又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。 　　&&&&无血清培养基的基本配方:基本成分为基础培养基及添加组分两大部分。&用于生物制药和疫苗生产的细胞在体外培养时，多数呈贴壁生长或兼性贴壁生长；而当其在无血清、无蛋白培养基中生长时，由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子如纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞往往以悬浮形式生长。& 添加组分& 1.&促贴壁物质：许多细胞必须贴壁才能生长，这种情况下无血清培养基中一定要添加促贴壁和扩展因子，一般为细胞外基质，如纤连蛋白、层粘连蛋白等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要作用。纤连蛋白主要促进来自中胚层细胞的贴壁与分化，这些细胞包括成纤维细胞、肉瘤细胞、粒细胞、肾上皮细胞、肾上腺皮质细胞、CHO细胞、成肌细胞等。& 2.&促生长因子及激素：针对不同细胞添加不同的生长因子。激素也是刺激细胞生长、维持细胞功能的重要物质，有些激素是许多细胞必不可少的，如胰岛素。& 3.&酶抑制剂：培养贴壁生长的细胞，需要用胰酶消化传代，在无血清培养基中必不可少须含酶抑制剂，以终止酶的消化作用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制剂。& 4.&结合蛋白和转运蛋白：常见如转铁蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比较大，可增加培养基的粘度，保护细胞免受机械损伤。许多旋转式培养的无血清培养基都含有牛血清白蛋白。& 5.&微量元素：硒是最常见的。& 使用方法 　　 目前，血清仍是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%，3%，1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。 　　 为了使细胞适应无血清培养，关键的是使所培养细胞： 1.&处于对数生长中期& 2.&&90%&活细胞率& 3.&适应时以较高的起始细胞接种& 细胞适应无血清培养基的方法 1.&直接适应――细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中。& 　&一些类型细胞可直接从包含血清的培养基适应无血清培养基。对于直接适应，接种细胞密度应该:2.5×105~3.5×105细胞/ml。当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml时，传代培养细胞。当细胞密度在培养4到7天后达到2×106~4×106细胞/ml时，细胞完全适应了无血清培养基。每隔3~5天，当细胞密度达到1×106~3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。& 2.&连续适应――分好几步把细胞从添加血清的培养基转换到无血清培养基（SFM）中，与直接适应相比较，连续适应趋向对于细胞更加温和一些。& （1）&以2倍正常接种密度接种生长活跃的细胞培养物到75%有血清培养基：25％SFM&混合培养基中，传代培养。& （2）&当细胞密度&5×105细胞/ml时，以2×105到3×105细胞/ml细胞密度，在有血清培养基：SFM为50∶50的混合培养基中传代培养。& （3）&以2×106到3×106细胞/ml细胞密度，25％有血清培养基和75%&SFM中传代培养。& （4）&当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml（接种后4到6天），在100％SFM培养基中传代培养。& （5）&每隔3到5天，当细胞密度达到1×106到3×106细胞/ml，细胞活率在90％时，贮备的适应了无血清培养基的细胞培养物应该再次传代培养。& 　　 &&&&建议备份前一次混合培养的培养物，直到每一次细胞适应了新的混合培养基。每一次减少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培养基中进行几次传代。& 　　在适应过程中，最好不要让细胞生长过度。这将增加选择亚群的可能性。需要注意，与有血清培养基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白质，因而更易于受外界因素的影响。& 　　细胞培养适应替代血清：许多细胞利用连续适应方法能很好的适应，用包含FBS的的培养基和包含有替代血清的培养基1∶1（v∶v）的混合培养基培养细胞。通过下列的混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100％替代培养基。每次适应改变血清比例时，传代细胞2到3次。& 　　培养可以直接从FBS转换到替代血清。一开始就使用相同于FBS的浓度的替代物或血清，生长的延迟可能会发生，4允许进行2到3次的传代，使生长率恢复到以前的水平。& 　　特别需要强调的是：配制无血清培养液必须使用高质量的水，如石英玻璃蒸馏器经三次蒸馏或超纯水净化装置制备的水。因为无血清培养基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保护细胞的大分子，既便水中的有毒物质含量甚微，也可能对细胞产生致死性损害。这是无血清培养能否成功的关键因素之一。 无血清培养基的优点：& 1.&可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。 2.&避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。 3.&避免血清组分对实验研究的影响。 4.&有利于体外培养细胞的分化。 5.&可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。 无血清培养基的缺点： 1.&细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。 2.&成本较高。 3.&针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。 无血清培养基一些配方 1.&神经细胞，干细胞，PC12细胞 成份&&&&终浓度 葡萄糖－－0.6%& 谷氨酰胺－2mM& NaHCO3－－3mM& Hepes&－－5mM& 胰岛素－－2.5μg/ml& 转铁蛋白&－100ng/ml& 孕&酮&－－20nM& 丁二胺－－60μM& 硒酸钠－－30nM& 青霉素－－50mg/ml 链霉素－－50mg/ml& 最后用DF12添加到100ml即可 2.&各类小鼠胚胎癌细胞系培养基 DMEM/F12&1:1混合成1000ml NaHCO3&&&&&&&&&&&&&2.4g HEPES(1.5M)&&&&&&10.0ul 硒酸（5*10-6M)&&&10.0ug 纤粘连蛋白&&&&&&&1ug/cm2(37度作用15－30分钟） 胰岛素&&&&&&&&&&1000.0ug 转铁蛋白&&&&&&&&5000.0ug 3.&NIH3T3小鼠成纤维细胞培养基 DMEM/F12&1:1混合成1000ml HEPES&&&&&&&&&&&&&&15mM 大豆胰酶抑制剂&&&&&0.1％ 胰岛素&&&&&&&&&10.0ug/ml 转铁蛋白&&&&&&&25.0ug/ml 纤粘连蛋白&&&&&&5.0ug/ml 4.&杂交瘤细胞培养基 DMEM/F12&1:1混合成1000ml NaHCO3&&&&&&&&&&&&1.2g/L HEPES&&&&&&&&&&&&&&&15mM 胰岛素&&&&&&&&&&5.0ug/ml 氨基乙醇&&&&&&&&&&20.0uM 硒酸&&&&&&&&&&&&&&&2.5mM 转铁蛋白&&&&&&&35.5ug/ml
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