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) 南方医科大学学报（J South Med Univ）
血管内皮生长因子(VEGF) 是具有强烈诱导和促
进血管形成作用的血管生长因子，该作用通过其与血管
内皮生长因子受体（VEGFR）结合而介导［1］。 II 型
VEGFR（VEGFR-2）又称为激酶功能区受体（KDR/
Flt-1）是介导VEGF在肿瘤新生血管形成发挥功能的主
要受体。VEGF 肽链氨基端 110 个氨基酸残基多肽
（VEGF110）是识别并结合 VEGFR 的区域，称为
VEGFR结合肽（VRB）［1-3］。恶性肿瘤的生长和转移依
赖于血管生成，VEGFR是肿瘤血管生成的特异性分子
标志，因而成为抗血管生成治疗的主要靶分子。颗粒酶
B（GrB）系淋巴细胞的细胞毒因子之一，是淋巴细胞发
挥抗肿瘤、抗病毒作用的主要效应分子。GrB在穿孔素
或其它破坏细胞膜的分子的协助下能通过细胞膜进入
靶细胞内，激活多条信号传导途径诱导细胞凋亡［4-6］。
根据恶性肿瘤血管生成的特点和人体细胞免疫的
分子机制，有可能利用VRB的导向作用，使GrB靶向作
用于肿瘤血管，破坏内皮细胞和肿瘤细胞，达到治疗肿
瘤的目的。我们分别克隆了人VRB基因cDNA片段和
GrB基因cDNA，通过基因重组技术，构建了pBBADx-
VRB、pBBADx-GrB 和 pBBADx-GrB-VRB 表达载体
在大肠杆菌中表达，对表达产物的抗血管生成作用进行
了研究［7-9］。本实验中，我们将这些重组表达载体转化双
歧杆菌，L-阿拉伯糖诱导表达重组蛋白，研究GrB-VRB
双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡
陈 蕾 1，曾位森 2，郑 航 1
南方医科大学 1南方医院肿瘤科，2基础医学院细胞生物学教研室，广东 广州 510515
Granzyme B-VEGF receptor-binding peptide fusion protein expressed in B. longum
induces apoptosis of KDR-positive cells
CHEN Lei1, ZENG Weisen2, ZHENG Hang1
1Department of Oncology, Nanfang Hospital, 2Department of Cell Biology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
摘要：目的 在双歧杆菌中表达重组人颗粒酶B-血管内皮生长因子结合肽（GrB-VRB）融合蛋白并研究其对血管内皮生长因子
受体 II（KDR）阳性细胞的作用。方法 采用电穿孔法将重组表达载体转入双歧杆菌，以ELISA和免疫印迹鉴定表达产物，以细
胞增殖试验和TUNEL法分析其对KDR阳性细胞的影响。结果 工程化化双歧杆菌培养物的上清和菌体中均有重组产物，重组
人GrB-VRB能有效抑制KDR阳性如人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC、小鼠结肠癌细胞株CT-26细胞增殖、细胞死亡，这种死
亡的机制是细胞凋亡；但对KDR阴性细胞则无这些作用。结论 工程化双歧杆菌能分泌性表达重组GrB-VRB融合蛋白，其在
VRB的靶向作用下，GrB可有效地诱导KDR阳性细胞凋亡。
关键词：颗粒酶B；血管内皮生长因子受体结合肽；双歧杆菌；细胞凋亡
中图分类号：R730.54 文献标志码：A 文章编号：（9-05
doi: 10.3969/j.issn.12.07.035 http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1627.R.8.003.html
Abstract: Objective To express granzyme B-vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor-binding peptide (GrB-VRB)
fusion protein in Bifidobacteria longum (B. longum) and investigate the effects of this fusion protein on the proliferation and
apoptosis of cells expressing VEGF receptor II, the kinase domain receptor (KDR). Methods The recombinant expression
vectors pBBADx-VRB, pBBADx-GrB and pBBADx-GrB-VRB were separately transformed into B. longum cells by
electroporation. The expressed products were identified by enzyme-linked immunosorbent assay and Western blotting, and
their effects on KDR-positive cells were analyzed using proliferation assay and TUNEL assay. Results The expressed products
were detected in both the supernatant and cellular fractions of B. longum cells. The recombinant GrB-VRB fusion protein
reacted with such KDR-positive cells as human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and mouse colon cancer cell line
CT-26, and caused obvious cell proliferation inhibition, cytotoxicity and cell apoptosis in these cells. Conculsion The
recombinant GrB-VRB fusion protein secreted by the engineered B. longum cells can induce KDR-positive cell death as the
result of GrB-induced cell apoptosis following the cell recognition by VRB.
Key words: granzyme B; vascular endothelial growth factor receptor- apoptosis
收稿日期：
基金项目：广东省医学科研基金（A2009412）；广东省自然科学基金
（7300385）
作者简介：陈 蕾，在读硕士研究生，E-mail:
通讯作者：郑 航，博士，副主任医师，硕士生导师，电话：020-，
E-mail: ；曾位森，硕士，副研究员，硕士生导师，电
话：020-，E-mail:
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷
融合蛋白能否作用于KDR/Flt-1阳性的血管内皮细胞
和肿瘤细胞及其作用，为口服这种工程化双歧杆菌使之
在肠道内表达重组GrB-VRB，靶向性地作用于新生血
管内皮细胞，治疗有关肠道肿瘤提供一些实验依据。
1 材料与方法
重组表达载体 pBBADx-VRB、pBBADx-GrB 和
pBBADx-GrB-VRB由本室构建［8-9］；长型双歧杆菌、人
脐静脉血管内皮细胞株HUVEC、小鼠结肠癌细胞株
CT-26、人结肠癌细胞株SW480、人Burkitt's淋巴瘤细胞
株 Raji、小鼠成纤维细胞株 NIH3T3 均为本室保存；
MRS 培养基购自 Difico，PRMI 1640 培养基购自
Gibco，新生牛血清（NCS）购自杭州四季青生物工程材
料研究所；抗人GrB单克隆抗体购自Dako，HRP-羊抗
鼠 Ig抗体购自 Jackson Immuno；可溶性膜蛋白相位分
离制备试剂盒为美国GENMED产品，人GrB ELISA试
剂盒和人VEGF ELISA试剂盒购自R&D，磺酰罗丹明
B（SRB）细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒和TUNEL
（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡原位
检测试剂盒购自凯基生物公司；PVDF膜购自Pierce；电
转化仪为Bio-Rad产品，厌氧盒为bioMrieux(R)sa产品。
1.2 细菌及细胞的培养
双歧杆菌接种于MRS 培养基中，37 ℃厌氧培养。
各种细胞株均培养于含10% NCS的RPMI 1640培养基
中，置37 ℃，5% CO2培养箱中培养，2 d换液传代1次。
将细胞洗涤后供实验用，实验用细胞为状况良好的对数
生长期细胞。
1.3 重组表达载体转化双歧杆菌
采用电穿孔法。在电压2.5 kV、电容25 μF、电阻
200 Ω 条件下，将3种重组表达载体分别转入双歧杆
菌。将转化后双歧杆菌接种于含60 μg/ml氨苄西林的
MRS固体选择培养基，37 ℃厌氧培养。挑取乳白色、圆
形边缘光滑完整的阳性菌落，接种于MRS液体培养基
中，37 ℃厌氧培养。
1.4 重组蛋白的诱导表达
为了将外源基因转化双歧杆菌的表达产物直接用
于有关细胞实验中，重组蛋白的诱导表达在PRMI 1640
培养液（用丙酸调节pH值6.5左右）中进行。基因转化
双歧杆菌接种于PRMI 1640培养基后，37 ℃厌氧培养
至D650为0.6~1.0时，加终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖诱
导表达培养24 h。取样分离上清和菌体进行鉴定。小
量分装培养上清，-70 ℃保存备用。
采用VEFG ELISA检测试剂盒测定培养上清中
rhVRB的含量，以GrB ELISA试剂盒测定培养上清中
rhGrB和 rhGrB-VRB的含量，操作按ELISA试剂盒说
明书进行。培养上清中重组蛋白的浓度，根据ELISA
测定结果和各重组蛋白的计算相对分子质量折算为摩
尔浓度，便于应用于细胞培养实验。
1.6 免疫印迹
分别取经L-阿拉伯糖诱导表达24 h的转基因双歧
杆菌菌体和培养上清，经样品处理液煮沸处理后，进行
SDS-PAGE（12%凝胶）；电泳完成后，将蛋白转移到
PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭过夜，加抗GrB单克隆抗
体室温反应2 h，洗涤后与HRP-兔抗鼠Ig抗体室温反应
2 h，加入化学发光剂，放入暗盒中压片，2~5 min后显
影、定影。
收取生长状态良好的各细胞株，离心洗涤后收集细
胞，采用可溶性膜蛋白相位分离制备试剂盒制备各细胞
株的膜蛋白样品，操作按说明书进行。膜蛋白进行
SDS-PAGE（10%凝胶），如上转膜和封闭后，加抗Flk-1
单克隆抗体反应，余同上。
1.7 细胞生长抑制实验
收集生长状态良好的细胞，洗涤后重悬为适当密度
的细胞悬液，加入96孔培养板，每孔105细胞，并加入含
一定终浓度工程化双歧杆菌产物的培养上清，培养一定
时间。在显微镜下观察、拍照保存资料。按照SRB细
胞增殖及细胞毒性检测试剂盒说明书进行固定、染色、
脱色，最后在酶联仪上测定D515值。
1.8 TUNEL细胞凋亡原位检测
收集细胞株HUVEC，在培养板中每孔加入105细
胞，加入含rhGrB-VRB培养上清至rhGrB-VRB终浓度
为 8 nmol，培养 24 h，取细胞进行涂片、固定。采用
TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒分析细胞凋亡，操作
按照说明书进行。
1.9 统计学分析
实验数据用SPSS 16.0 统计软件进行单因素方差
分析，多个样本均数间每两个均数的比较采用SNK法
（q检验），两样本间用独立样本t检验。
2.1 重组蛋白的表达
工程化双歧杆菌经L-阿拉伯糖诱导表达培养24 h，
分离各上清，以 ELISA 方法检测重组蛋白 rhVRB、
rhGrB和 rhGrB-VRB，发现有重组蛋白分泌表达，其含
量大致在0.5~1.0 μg/ml。分离GrB-VRB基因转化双歧杆
菌培养物的菌体和上清，进行免疫印迹鉴定，发现上清
和菌体样本均在约38 000处出现蛋白条带（图1），表明
除上清中有rhGrB-VRB外，菌体内也存在rhGrB-VRB。
2.2 KDR/Flk-1在几种不同类型细胞中的表达
将各细胞株的膜蛋白样品进行免疫印迹分析，发现
陈 蕾,等.双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
HUVEC和CT-26细胞的膜蛋白出现了约 125 000条
带，前者很强而后者较弱，表明HUVEC表达高水平的
KDR/Flk-1，CT-26也表达KDR/Flk-1，但水平较低。另
外几个细胞株包括SW480、Raji和NIH3T3则否（图2）。
2.3 rhGrB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞生长
加入不同终浓度的各种重组蛋白处理KDR/FlT-1
阳性细胞HUVEC 24 h，SRB法测定细胞存活水平，发
现rhGrB-VRB对HUVEC的增殖具有显著抑制作用并
呈浓度依赖关系，rhGrB未见任何影响，而 rhVRB显示
轻微的促生长作用（图3）。分析 rhGrB-VRB对不同细
胞生长的影响，发现低浓度 rhGrB-VRB即对HUVEC
有明显抑制作用（未给出资料），达到一定浓度（8 nmol）
时，对较低表达KDR/Flt-1的CT-26细胞也有明显的生
长抑制作用，但对KDR/Flt-1阴性细胞的增殖无任何影
响（图4）。
2.4 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用
用终浓度 8 nmol/L rhGrB-VRB处理HUVEC，光
镜下观察，发现rhGrB-VRB具有快速、强烈的细胞毒性
作用。作用30 min时，光镜下即可观察到细胞发生剧
烈变化；处理12 h时，大多数细胞死亡、裂解，仅剩细胞
痕迹；而rhGrB处理12 h的细胞则未见明显变化（图5）。
2.5 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡
以终浓度8 nmol/L rhGrB-VRB处理HUVEC 24 h，
采用TUNEL法分析细胞凋亡情况，发现只加培养液的
对照组仅有少数细胞核TUNEL标记阳性，阳性率约
13%，而rhGrB-VRB处理的实验组细胞，绝大多数细胞
核TUNEL标记阳性，阳性率达89%（图6）。
目前，尽管肿瘤的治疗进展迅速，但仍未能找到确
切有效的治疗药物和措施，尤其肿瘤的转移性更是困扰
医学界的一大难题。大量研究证明，实体瘤的发生、发
展和转移都依赖于肿瘤血管的生成。当瘤体长大到一
定大小后，需要新生血管来提供肿瘤细胞迅速增长所需
要的养分［10-11］。许多实验证明，抗血管生成治疗是抑制
肿瘤生长和转移的有效途径［12-13］。然而，目前许多在研
图1 免疫印迹分析rhGrB-VRB融合蛋白
1: 诱导前上清; 2: 诱导24 h菌体; 3: 诱导12 h培养上
清; 4: 诱导24 h培养上清
Fig.1 Analysis of rhGrb-VRB fusion protein by
Western blotting.
图2 免疫印迹分析KDR/Flk-1在不同细胞株
1: HUVEC; 2: CT-26; 3: SW480; 4: R 5: NIH3T3
Fig.2 Analysis of KDR/Flt-1 expressions in
different cells by Western blotting.
图3 不同浓度重组蛋白对人血管内皮细胞HUVEC增
Fig.3 Effects of different recombinant proteins on the
proliferation of human umbilical vein endothelial cells
0 2 4 8 16
ρ重组蛋白/(nmol·L-1)
图4 rhGrB-VRB抑制HUVEC和CT-26细胞增殖
GrB-VRB 处理组分别与 GrB 处理组和 VRB 处理组比
南方医科大学学报（J South Med Univ） 第32卷
的抗血管生成药物只能简单抑制肿瘤血管的形成，不能
破坏已经形成的新生血管，因而只能限制肿瘤的生长和
转移，不能彻底消除肿瘤病灶的问题。
近年来，我们根据恶性肿瘤血管生成的特点和机体
细胞免疫的分子机制，选择VRB作为导向工具，以GrB
为效应分子，通过基因重组技术，使二者形成融合基因
GrB-VRB，并以双歧杆菌为载体，期望通过口服工程化
双歧杆菌的方式，使之在肠道内表达重组GrB-VRB，能
靶向性地作用于新生血管内皮细胞，诱导新生血管内皮
细胞凋亡，达到靶向性治疗肠道肿瘤的目的。近年，我
们已对双歧杆菌作为效应分子/基因载体进行了一些研
究［14-16］。本实验中，我们将前期构建的重组表达载体
pBBADx-VRB、pBBADx-GrB 和 pBBADx-GrB-VRB
转化长型双歧杆菌，经L-阿拉伯糖诱导表达了rhVRB、
rhGrB 和 rhGrB-VRB 蛋白。有关功能实验证明，
rhGrB-VRB蛋白能有效抑制KDR/Flk-1阳性细胞如人
脐静脉血管内皮细胞HUVEC和小鼠结肠癌细胞CT-26
的增殖，但对KDR/Flk-1阴性的细胞则否。还发现，
rhGrB-VRB蛋白可迅速引起KDR/Flk-1阳性细胞死
亡，而这种死亡的机制是细胞凋亡。本实验未发现人结
图5 rhGrB-VRB对HUVEC的细胞毒作用
A: 处理前细胞; B: rhGrB-VRB处理30 C: rhGrB-VRB处理12 D: rhGrB处理12 h
Fig.6 Cytotoxicity of HUVECs mediated by rhGrB-VRB (Original magnification: ×100).
图6 rhGrB-VRB诱导HUVEC细胞凋亡
A: 对照组, 少数细胞核TUNEL标记阳性; B: 实验组, 绝大多数细胞核TUNEL标记阳性
Fig.6 Apoptosis of HUVECs induced by rhGrB-VRB (Original magnification: ×400).
陈 蕾,等.双歧杆菌表达的重组人GrB-VRB融合蛋白诱导KDR阳性细胞凋亡第7期
肠癌细胞株SW480表达KDR/Flk-1，下一步将选取多
种人肠道肿瘤细胞株、活检或手术切除的新鲜肠道肿瘤
组织进行鉴定，并分析其对rhGrB-VRB的敏感性；开展
荷瘤动物模型的研究，以期为 rhGrB-VRB基因转化分
歧杆菌的临床应用铺平道路。
综上，利用双歧杆菌表达的重组GrB-VRB蛋白抗
肿瘤血管生成治疗方法，模拟了淋巴细胞生理性的作用
机制，克服了一般血管抑制剂只能抑制血管生成的缺点，
既可破坏肿瘤新生的血管，又可直接攻击肿瘤细胞本身，
能较好地抑制肿瘤的生长和转移，可望彻底消除肿瘤
病灶，在防治大肠癌等肠道肿瘤方面取得较大突破。
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（编辑：陈望忠）
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（编辑：吴锦雅）
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