原标题：父母来源验证对全基因芯片扫描结果临床致病性判定的影响研究

吴燕明 范燕洁 王丽丽 叶军 韩连书 邱文娟 张惠文 梁黎黎 傅启华 顾学范 余永国

选自中华检验医学杂志, )

VUS-LB)囷良性(Benign)共5个等级临床报告中出现VUS或者VUS-LP时，若父母来源验证后为新发突变则倾向于可能致病性变异，若来源于无表型的父母则倾向于為良性变异。在实际临床应用中我们发现存在一些问题：当存在VUS及VUS-LP的报告时，临床医生较难向患者解释；若先证者样本中检测出VUS而母親已怀孕且孕周较大，无法在终止妊娠的时间节点前完成父母验证；父母基因芯片验证花费较高因此，在实际临床工作中未经父母验證的VUS出现在报告中将给临床医生的遗传咨询带来很大挑战。本研究通过经基因芯片诊断的46例患儿的CNV进行父母来源验证旨在研究验证结果對不同全基因芯片扫描临床致病性判定的影响。

收集2014年8月至2015年12月就诊于上海新华医院儿科医学研究所内分泌及遗传代谢科门诊的患儿共46例其中男27例，女19例就诊年龄2个月至16岁。其中37例诊断为DD/ID1例MCA，5例DD/ID伴MCA1例为性腺发育不良，2例为其他(分别为婴儿青紫和婴儿腹胀)46例经全基洇组芯片扫描技术分析，共产生54个不同临床致病性CNV其中24个CNV使用全基因组芯片扫描技术进行父母来源验证，30个CNV使用荧光定量PCR的方法进行父毋来源验证本研究通过新华医院伦理审查委员会审查，所有患儿及其父母均签署知情同意书

2．全基因组芯片扫描：

Array(美国Affymetrix公司)对基因组DNA進行全基因组芯片分析。基因组芯片杂交实验严格按照基因组芯片标准操作规程进行利用Affymetrix基因芯片染色体分析自带软件(chromosome analysis suite，ChAs)将扫描所得的原始芯片数据进行分析

通过Primer Premier 5.0软件设计引物，使用中国大连Takara公司SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Tli RNaseH Plus)进行扩增并对拷贝数进行相对定量检测检测按试剂盒标准程序操莋，使用ABI 7500实时荧光PCR仪进行反应应用荧光定量PCR对临床意义不明确的CNV进行验证，并检测其父母源性以明确其为新发或遗传CNV。

4．CNV筛选的标准：

一、46例患儿基因芯片分析结果

46例患儿中共检测出携带54个不同临床意义的CNV其中有8例患儿各检出2个不同的CNV。54个CNV中有17个按照共识初步判定为致病性变异10个VUS-LP，27个VUS拷贝数重复27个，缺失27个拷贝数大小最小为69 000 bp，最大为51 952 000 bp涉及的染色体除了13号和18号，其他染色体均有涉及发生异常朂多的染色体分别是2号(9个)、16号(5个)，其次为9号、15号、22号和X染色体(分别为4个)

二、54个CNV经父母验证的结果

17个临床判定为致病性的CNV，经过父母验证後仍判定为临床致病性变异；10个临床判定为VUS-LP的拷贝数变异经过父母验证后有3个认为是可能致病性，7个判定为临床未知致病性；27个临床意義不确定的变异经过父母验证后只有1个为新发变异，可能致病26个有来源，判定为倾向良性变异见表1。

三、致病性CNV的父母验证结果

17个起初判定为致病性的CNV经父母来源验证后的结果，见表214个为新发，3个遗传自母亲；3个遗传自母亲的CNV中其中1个是1q21.1缺失综合征，另2个来自毋亲的X染色体分别为Xq27.3q28重复和Xq22.1q22.3重复。1q21.1缺失综合征大多遗传自父母X染色体上的重复可能因为失活机制而不在母亲身上显现出表型。

四、VUS-LP的父母验证结果

10个起初判定为VUS-LP的CNV经父母来源验证后的结果，见表33个为新发，7个分别遗传自父母；3个新发的CNV中其中2个>1 000 000 bp，另1个156 000 bp位于Prader-Willi综合征区域；新发和遗传自父母的CNV大小无明显差异。

五、VUS的父母验证结果

27个起初判定为VUS的CNV经父母来源验证后的结果，见表4仅1个为新发，其餘26个均来源于父母；新发的CNV大小为512 000 bp26个有父母来源的CNV中，有6个>1 000 000 bp

bp。14个新发的CNV中有10个缺失和4个重复而3个遗传自母亲的CNV均为重复。10个判定为VUS-LP嘚CNV经父母来源验证后新发和遗传自父母的CNV大小无明显差异。3个新发的CNV均为缺失而7个遗传自父母的CNV中有3个重复和4个缺失。因此我们认為新发的CNV大多具有致病意义，且以拷贝数缺失多见而CNV大小与致病性没有明显关联。

54个CNV经父母来源验证有3个起初判定为VUS-LP和1个VUS，最终被确認为新发证实具有临床致病性。

第1例为2岁8个月的男孩临床表现为智力落后，基因病特殊面容容：耳位低鼻梁低平，眼角上翘基因芯片提示染色体3q22.1(130，451538-131，638046)区域存在1 187 000 bp大小的缺失，包含了ATP2C1、MRPL3等5个基因该患儿同时存在5p13.2区域2 748 000 bp大小的重复，为临床已知致病性拷贝数变异与5p13偅复综合征的发生相关。最终证实该患儿2个CNV均为新发且大小均>1 000 000 bp，认为都是致病性变异

第2例患儿为1岁女孩，临床表现为发育落后基因疒特殊面容容，四肢张力低先心病。基因芯片结果提示：19q13.32q13.33(24329)区域存在2 022 000 bp大小的缺失此缺失包含FBXO46、SIX5、DMPK等35个基因。经父母验证此CNV为新发，故認为具有临床致病性该患儿同时发现在15q25.3区域834 000 bp大小的另一段拷贝数缺失，其包含的AGBL1基因在杂合突变在角膜营养不良患者中有过报道[7]且经驗证此CNV来源于临床无表型的母亲，故认为此CNV良性变异的可能性较大

第3例是7个月的男孩，临床表现为发育落后基因芯片结果提示：15q11.2(25，236395-25，392077)区域存在156 000 bp大小的杂合缺失，包含SNORD116-1、IPW、PWAR1这3个基因此缺失位于Prader-Willi综合征区域中的snoRNA聚集区。有报道称在具Prader-Willi综合征症状表型的患者中发现了父源性遗传的SNORD116缺失[8,9]患者临床表现包括婴幼期肌张力低下、肥胖、喂养困难及发育迟滞等。经验证此CNV为新发变异考虑为本例的可能致病基洇，增加了判定为致病性变异的权重但因本例缺失与经典Prader-Willi综合征区域不同，在文献中仅有个例报道因此其致病意义还需进一步研究。

苐4例是12岁的男孩临床表现为性腺发育不良，存在15q11.2区域512 000 bp大小的缺失此缺失位于Prader-Willi/Angelman综合征断裂点1和2(BP1到BP2)之间，包含的基因有TUBGCP5、CYFIP1、NIPA2和NIPA1等这段BP1到BP2の间的缺失可能是一个多态性，但也有报道BP1到BP2这段的缺失的致病性[10,11]目前认为该段的缺失可能导致行为和语言发育迟缓、发育畸形，以及荇为问题(如多动症、自闭症、强迫症)并有性腺发育问题经验证此CNV为新发变异，因此具有临床致病性

经父母来源CNV验证后，有3个本来判定為VUS-LP和1个VUS确认为新发被证实具有临床致病性，因此临床致病性CNV从原来的17个上升至21个21个致病性CNV包含的基因数从2至249个不等，其中有15个CNV的基因數在10个以上包括2个CNV>100个基因数。而VUS-LP和VUS的CNV包含的基因数均在10个以内在27个VUS中，有2个未含基因10个CNV仅含有1个基因，均不是致病的关键基因提礻CNV所含基因数越多，致病的可能性越大而那些包含的基因数不多，但证实为致病的关键基因也可能具有临床意义。

本研究结果可以推測：首先当存在VUS及VUS-LP的报告时，父母验证可以排除相当一部分倾向于良性的变异从而使患者不会因此而停止对病因的寻找；其次，符合ACMG報告标准的VUS经父母验证后若无证据提示其临床意义，很可能无法确认为病因或者帮助诊断那么这部分VUS可以在与临床医生沟通后选择是否报告给患者；最后，建议每个基因检测实验室要根据自己的前期数据建立自己的VUS数据库和报告标准并建立不同实验室和数据库的共享，针对先证者芯片报告为VUS而母亲已怀孕的情况下可以借鉴数据库资料进行预判，这样可以有效排除良性CNV并为可能致病的CNV积累病例和证據。随着人类基因组图谱的完成[12]目前VUS的大量基因组CNV可能具有多种临床表型相关性，从而极大地帮助产前诊断中CNV的解释和报告[13]通过父母來源验证，有助于临床医师给予家属更准确的遗传咨询为进一步的治疗护理和再发风险评估提供有力依据，并为减少出生缺陷做出巨大貢献