第２期祝瑕琳等：养殖大黄鱼病原弧菌多重ＰＣＲ检测；Ｔａｂ．２；１６１；ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓ；ｏｆｔｉｓｓｕｅ；ｓａｍｐｌｅｓａｎｄｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅｓｃｏ；注：‘‘＿，’代表检测结果阴性，“ＶＡ＇’代表溶；ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｅｇａｔｉｖｅ；ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ；Ｖ／ｂｒ／ｏ＾删．ＨＢＡ－Ｈｕａｎｇ；ｒ∞ｕｌｔｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌ
第２期祝瑕琳等：养殖大黄鱼病原弧菌多重ＰＣＲ检测技术的建立和应用表２大黄鱼养殖场采集的组织样本和水体样本的检测结果
Ｔａｂ．２
ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｒｅｓｕｌｔｓ
ｏｆｔｉｓｓｕｅ
ｓａｍｐｌｅｓａｎｄｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒｆａｒｍｅｓ
注：‘‘＿，’代表检测结果阴性，“ＶＡ＇’代表溶藻弧菌，“ｖＰ’＇代表副溶血弧菌，“ＶＨ”代表哈维氏弧菌．ＨＢＡ一黄避岙；ＸＱ一新桥．Ｎｏｔｅ：‘ｏ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｎｅｇａｔｉｖｅ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ
Ｖ／ｂｒ／ｏ＾删．ＨＢＡ－Ｈｕａｎｇ
ｒ∞ｕｌｔｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，“ＶＡ＇’ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＶ／ｂｒ／ｏａ／ｇ／ｎｏｌｙｔ／ｃｕ５，“ＶＰ”ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓＥｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔ／ｃｕｓ，“ＶＨ”
Ｂｉ?ａｏ；ＸＱ－Ｘｉｎｑｉａｏ．
图８大黄鱼养殖场水体样本的多重ＰＣＲ检测
Ｍ：ＤＮＡ
ｍａｒｋｅｒ；１－１６：养殖场采集的１―１６号水体样本的多重ＰＣＲ检测结果；１７：阴性对照．
Ｆｉｇ．８
ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｗａｔｅｒ
ｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍＰ．ｃｒｏｃｅａｆａｒｍｓ
Ｍ：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；１－１６：ｒｅｓｕｌｔｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅｓＮｏｓ．１－１６ｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｆｍｈｅｒｙｆａｒｍ；１７：ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒ０１．
３．１多重ＰＣＲ的影响因素
浓度在一定范围内波动，多重扩增都可以出现，然而如果超出这一范围，浓度过高或过低都不利于多重扩增反应。本实验中溶藻弧菌引物浓度在０．４～０．８ｇｍｏｌ／Ｌ之间、哈维氏弧菌引物浓度在０．４～Ｏ．８
ｐｍｏＦＬ
多重ＰＣＲ要求不同引物能在同一反应体系中进行特异性扩增，影响其扩增效果的因素较多，不同引物对之间的相对浓度、循环温度、延伸时间，ＭｇＣｌ２和ｄＮＴＰ浓度间的平衡等‘删。多重ＰＣＲ反应中引物
之间、副溶血弧菌引物浓度在０．１６～Ｏ．８ｔｔｍｏｌ／Ｌ之间，
三重扩增都可以出现。但以最低引物量产生所需要
中国水产科学第１６卷
的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。因此确定最优化的引物浓度为溶藻弧菌０．４ｐｍｏｌ／Ｌ、哈维
氏弧菌０．４ｐｍｏｌ／Ｌ、副溶血弧菌０．１６ｐｍｏｌ／Ｌ。当采用
单一退火温度５４．５℃进行多重ＰＣＲ时，能得到预期的扩增产物，但稳定性不够，条带明亮暗度不一，结合降落ＰＣＲ和热启动ＰＣＲ后，可以得到均一、稳定的条带，获得很好的扩增效果，同时也减少了样品间交叉污染的机率。延伸温度和延伸时间也是影响多重ＰＣＲ结果的重要因素，高的延伸温度减少了某些基因的扩增，用较长的退火时间和延伸时间并不能完全消除这种影响，而将延伸温度降至６８℃后，能增加所有基因的ＰＣＲ产物量。
１０×ＰＣＲ反应缓冲液、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ酶的量等对多重扩增的影响不是很大，是变化较小的因素。但热启动ＥｘＴａｑ酶比普通Ｔａｑ酶更能增强各目的片段的扩增量。而当ｄＮＴＰ浓度为每种２００Ｉｘｍｏｌ／Ｌ时结果最好，浓度继续增加时扩增被抑制。降低ｄＮＴＰ浓度不抑制扩增，但扩增产物的量会减少。ｄＮＴＰ母液对于反复冻融十分敏感，反复冻融３～５次后，多重ＰＣＲ扩增产物几乎完全不可见。为了避免这一问题，应分装小份的ｄＮＴＰ，冻存于一２０℃，使用前离心。ｄＮＴＰ的这种低稳定性在单ＰＣＲ扩增中并不明显。３．２多重ＰＣＲ检测养殖大黄鱼弧菌病病原菌的意义
养殖大黄鱼的弧菌病研究仅限于中国，大多研究集中在疾病描述、流行病学、病原鉴定、致病机理、防治方法等方面。弧菌是一种条件致病菌，其致病性受宿主的生理状态及水质环境条件等综合因素的影响较大，当大黄鱼免疫机能低下或表皮擦伤磨损时，海水养殖环境中的致病弧菌就易引起感染，症状表现多种多样，病原菌可能有溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌“剖。关于大黄鱼弧菌病的早期检测技术研究较少，且集中在免疫学方法上。免疫学方法不仅可以检测发病鱼，还可以检测潜伏期的带菌个体，但只能检测一种细菌，难以用抗血清分辨相关菌群且敏感性较低ｈ引。随着分子生物学技术的发展，快速检测弧菌的ＰＣＲ方法已经广泛建立阻１５】。但常
规的ＰＣＲ检测法为单对引物扩增一种病原体ＤＮＡ，一次只能检测一种病原体，混合感染的检测显得操作烦琐，费时且成本高，而且容易产生漏诊。养殖大黄鱼致病性弧菌种类多，难以用一种方法进行确诊，而多重ＰｃＲ能有效地解决上述问题ｎ９。捌。
胶原酶基因是一种新的金属蛋白酶基因，这种金属蛋白酶基因是弧菌侵染宿主时的一种毒力因子剀。ＴｏｘＲ基因是一种毒素蛋白表达调控基因，可作为弧菌问鉴别和检测基因“”。因此，本研究针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因，以及哈维氏弧菌中的部分ＴｏｘＲ基因的特异性设计并优化建立了多重ＰＣＲ检测方法，检测灵敏度是１０２～１０３ＣＦＵ／ｍＬ，并把它应用到流行季节养殖大黄鱼弧菌病的监测中。
通过对２００７年６月至９月间采集的１６份养殖大黄鱼组织样本进行多重ＰＣＲ检测，结果只在１份样本中检出副溶血弧菌，这也与２００７年浙江省这２个大黄鱼养殖场没有暴发弧菌病的情况相吻合，并且表明多重ＰＣＲ不仅可以检测发病鱼，还可以检测潜伏期的带菌个体。另１６份水体样本进行多重ＰＣＲ检测，结果显示７份水体样本中含有这３种弧菌中的１种或２种，说明海洋水体中存在有大黄鱼弧菌病的致病菌。
用多重ＰＣＲ方法检测养殖大黄鱼组织或水体样本中的３种弧菌的优越性主要表现在：（１）操作简便，检测周期短。每一批次从样品准备到检出只需３～４ｈ，可在１个工作日内完成；（２）灵敏度高，结果准确。多重ＰＣＲ方法的灵敏度达到１０２～１护ＣＦＵ／ｍＬ，小于、等于致病菌的致病感染剂量（１０３ＣＦＵ／ｍＬ）酬，对致病弧菌的检测和监测具有实际应用价值；（３）工作量小，检测成本低，一种方法能同时检测３种可能致病弧菌；模式，具有广泛的适用性。
由于流行季节的时间等条件所限，在本实验中用多重ＰＣＲ方法仅对一定量的组织样本和水样中的３种弧菌进行了检测。若对不同来源的更多样品采取相应的总ＤＮＡ抽提技术，此法可更广泛地应用于海水养殖动物弧菌病的检测和预防。
（４）可为其他海水养殖动物病原菌早期检测提供借鉴
第２期祝璨琳等：养殖大黄鱼病原弧菌多重ＰＣＲ检测技术的建立和应用
参考文献：
【ｌ】毛芝娟，刘国勇，陈昌福．大黄鱼溃疡病致病菌的初步分离与鉴定Ｕ】．安徽农业大学学报，２００２，２９（２）：１７８―１８１．
【２］金珊。王国良．海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的流行病学研究Ｕ】．水产科学，２００５，２４（Ｉ）：１７―１９．
【３】王国良，祝璩琳，金珊．养殖大黄鱼３种致病弧菌的分子鉴定及其
系统发育学分析Ｕ】．海洋与湖沼。２００８，３９（２）：１６２―１６７．
【４】余俊红，姚斐，俞勇，等．应用间接荧光抗体技术快速检测花鲈病原菌一鳗弧菌Ⅱ】－海洋水产研究，２００２，２３（２）：３８―４３．
【５１王军，鄢庆枇，苏永全，等．溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测【Ｊ１．海洋科学，２００２，２６（７）：１―４．
【６】鄢庆枇，苏永全，王军，等．大黄鱼弧菌病的荧光抗体快速诊断研究Ⅱ】．集美大学学报：自然科学版，２００１，６（４）：２９１―２９５．
【７】王军，鄙庆枇．苏永全，等．养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸
附法研究【Ｊ】．台湾海峡，２００１，２０（３）：３４６―３５０．
【８】鄢庆枇，方恩华，苏永全，等．大黄鱼溶藻弧菌ＬＰＳ的间接ＥＬＩＳＡ
检测Ⅱ】．台湾海峡，２００４，２３（１）：５６―６１．
【９】【ｍＣＹ，ＰａｎＳＦ，ＣｈｅｎＣＨ．Ｓｅｑｕｅｎｅｅ
ｃｌｏｎｅｄｐＲ７２Ｈｆｒａｇｍｅｎｔ
ａｎｄｉｔｓｕ∞ｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ
ｓｈｅｌｌｆｉｓｈｗｉｔｈｔｈｅ
ＰＣＲⅡ】．ＡｐｐｌＥｎｖｉｒｏｎｍＭｉｅｒｏｂｉｏｌ，１９９５，６１（４）－１３１１―１３１７．
【１０】ＫｉｍＹＢ，ＯｋｕｄａＪ，ＭａｔｓｕｍｏｔｏＣ。ｅｔａ１．ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶｉｂｒｉｏ
ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｓｔｒａｉｎｓ
ｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｌｅｖｅｌｂｙＰＣＲｔａｒｇｅｔｅｄ
ｔＯｔｈｅ
ＬＩＩ．ＪＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｅｒｏｂｉｏｌ，１９９９，３７（４）：ｌ１７３―１１７７．
【１１】ＣｏｎｅｊｅｒｏＭＪＵ，ＨｅｄｒｖｄａＣＴ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｐａｒｔｉａｌｔｏｘＲ
ｏｆＶ／ｂｒ／ｏ
危ｗｗ―ａｎｄｄｅｓｉｇｎｏｆｔｏｘＲ－ｔａｒｇｅｔｅｄＰＣＲ
ｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒ
ｓｐｅｃｉｅｓｄｅｔｅｅｆｉｏｎ
Ｕ】．ＪＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００３，９５（３）：６０２－６１１．
【１２】ＣｏｎｅｊｅｒｏＭＪＵ，ＨｅｄｒｖｄａＣＴ．ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｈｅｍｏｌｙｓｉｎ（ｖｈｈ）ｇｅｎｅ
Ｖ／ｂｒ／ｏｂａｒ．ｒ／ＬＩ】．ＪＧｅｎｅｒＡｐｐｌＭｉｃｍｂｉｏｌ，２００４。５０（３）：１３７－１４２．
【１３】ＰａｎｇＬ，Ｚｈａｎｇ
Ｈ，ＺｈｏｎｇＹ，ｅｔ
ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ啪ｒ如ｋｎ竹ｉ
ｕｓｉｎｇＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｏｘＲ
ｇｅｎｅ【Ｊ】．ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００６。４３（３）：２４９－２５５．
【１４］ＬｅｅＫＫ，ＹｕＳＲ，ＹａｎｇＴＩ，ｅｔａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ
Ｖｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｓｅａｓｅｄｋｔｔｒｕｍａｐｒａｗｎ，Ｐｅｎａｅｕｓ
ｊａｐｏｎｉｃｕｓｔ１１．ＬｅｔｔｅｒｓｉｎＡｐｐｈｅｄＭｉｅｍｂｉｏｌ，１９９６，２２（２）：１１ｌ―１１４．【１５】“ｕ
ＰＣ，Ｌｉｎ
ＪＹ，ＨｓｉａｏＰＴ，ｅｔａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓｆｒｏｍｄｉｓｅａｓｅｄｃｏｂｉａＲａｃｈｙｃｅｎｔｒｏｎ
ｃａｎａｄｕｍ［Ｊ１．ＪＢａｓｉｃＭｉｅｒｏｂｉｏｌ，２００４，４４：２３－２８．
【１６】萨姆布鲁克，拉塞尔．分子克隆实验指南：第３版【Ｍ】．北京：科学
出版社，２００２：２７―３６．
【１７】邓先余．６种水产病原菌１６Ｓ－２３ＳｒＤＮＡ间区序列分析及检测技
术［Ｄ】．广州：中山大学，２００３：Ｉ－１６８．【１８】Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ０。ＨｅｅｒｅｍａＮＡ，Ｄｌｏｕｈｙ
ＳＲ，ｅｔ
ａ１．ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ：
ｃｒｉｔｉｃａｌ
ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
ａｎｄｓｔｅｐ－ｂｙ―ｓｔｅｐｐｒｏｔｏｃｏｌ【Ｊ】．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ。
１９９７．２３（３）：５０４－５１１．
【１９］ＫｏｎｇＲＹＣ，ＬｅｅＳＫＹ，Ｌａｗ
ａ１．Ｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
ｔｙｐｅｓ
ｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｍａｒｉｎｅ
ｗａｔｅｒｓ
ｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ＰＣＲ【Ｊｌ
ＷａｔｅｒＲｅｓ，２００２，３６（１１）：２８０２―２８１２．
１２０】ＢｒａｓｈｅｒＣＷ．ＤｅＰａｏｌａＡ，ＪｏｎｅｓＤＤ，ｅｔａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ
ｉｎｓｈｅｌｌｆｉｓｈ
ｗｉｔｈｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ【ＪＪ．ＣｕｒｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９８，
３７（１）：１０１―１０ｒ７．
【２１】ＤｅｌＣｅｒｒｏＡ，ＭａｒｑｕｅｚＩ，ＧｕｉｊａｒｒｏＪＡ．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ
Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ，ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｕｍａｎｄＹｅｒｓｉｎｉａｒｕｃｋｅｒｉ。ｔｈｒｅｅｍａｊｏｒｆｉｓｈｐａｔｈｏｇｅｎｓ，ｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ【Ｊ】．Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍ
Ｍｉｃｒｏｂｉ０１．２００２，６８（１０）：５１７７―５
［２２】ＡｎｇｅｌａＤ。ＧｉｕｓｅｐｐｉｎａＣ，Ｍａｒｉａ
Ｆ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ
ａｎｄＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕ．ｓ
ｓｈｅｌｌｆｉｓｈｓａｍｐｌｅｓ
ｕｓｉｎｇ
ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ‘
ｔａｒｇｅｔｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘ―ＰＣＲＵ】．ＪＦｏｏｄＳａｆ，２００６，２６：１５０－１５９．【２３】ＫｉｍＳＫ。ＹａｎｇＪＹ，ＣｈａＪ．Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ｎｏｖｅｌ
ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ
ｆｒｏｍＶｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｔａｓ０４［Ｊ】．Ｇｅｎｅ。
２００２，２８３：２７７―２８６．
１２４１ＵＳＥＰＡ。Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓｆｏｒ
ｗａｔｅｒ
ｒｅｕ肫【Ｍ１．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：ＵｎｉｔｅｄＳｌａｔｅｓ
ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＡｇｅｎｃｙ，１９９２．
中国水产科学第１６卷
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｏｆｖｉｂｒｉｏｓｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｃｕｌｔｕｒｅｄｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒ，Ｐｓｅｕｄｎｏｓｃｉａｅｎａｃｒｏｃｅａ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）
ＺＨＵＪｉｎｇ．１ｉｎｌ”。ＷＡＮＧＧｕｏ―ｌｉａｎ９１”，ＪＩＮＳｈａｎｌ
（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｐｐｌｉｅｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＭａｒｉｎｅＢｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＦａｃｕｌｔｙｏｆＬｉｆｅ－ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＢｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎｉｎｇｂｏ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｉｎｇｂｏ３１５２１１，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，ＮｉｎｇｂｏＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｉｎｇｂｏ３１５２１１，Ｃｈｉｎａ；３．ＦｒｅｓｈｗａｔｅｒＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｉｓｈｅｒｙＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗｕｘｉ２１４０８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，Ｖｉｂｒｉｏｓｉｓｗａｓｔｈｅｍｏｓｔｉｎ
ｓｅｖｅｒｅ
ｄｉｓｅａｓｅｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗ
ｃｒｏａｋｅｒ（Ｐｓｅｕｄｎｏｓｃｉａｅｎａｃｒｏｃｅａ）
ａｎｏｒｅｘｉａ，ｆｌｏａｔｉｎｇｕｐｗａｒｄ
Ｚｈｅｊｉａｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ，ｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｇｒｅａｔｅｃｏｎｏｍｉｃｌｏｓｓｅｓ．Ｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓ
ｉｎｃｌｕｄｅｄ
ａｎｄｓｗｉｍｍａ唱ａｌｏｎｅ，ｐｔｅｒｙｇｉｏｐｈｏｒｅｈｙｐｅｒａｅｍｉａ，ｕｌｃｅｒａｔｉｏｎ，ａｓｃｉｔｅｓａｎｄｌｉｐｐｉｔｕｄｅ．Ｉｔｗａｓ
ｗｉｔｈｐｅａｋ
ｅｐｉｄｅｍｉｃｆｒｏｍＪｕｎｅｔｏＯｃｔｏｂｅｒ，
ＪｕｌｙｔｏＡｕｇｕｓｔ．Ｔｈｅｍｏｒｔａｌｉｔｙ
ｖａｒｉｅｄｆｒｏｍ３０％ｔｏ４０％，ｅｖｅｎｕｐｔｏ８０％ｓｏｍｅｔｉｍｅｓ．Ｉｔｃｏｓｔｅｄｏｎｌｙ
ｗｅｅｋｆｒｏｍｓｏｍｅｆｉｓｈｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｔｏａｌｍｏｓｔａｌｌｄｅａｄ．Ｔｈｒｅｅｂａｃｔｅｒｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓａｃｃｏｕｎｔｅｄｆｏｒｔｈｅ
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ｏｆｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗ
ｃｒｏａｋｅｒｖｉｂｒｉｏｓｉｓｉｎ
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ａｎｄ％而ｋｎ吲．
Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉａｌｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｉｍｅｒｓｆｏｒｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄ，ｂａｓｅｄｔｈｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｂｅｔｗｅｅｎｍ渤ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ
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ｓｐｅｃｉｆｃ
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７谊删．Ｔｈｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ
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ｗｅｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ
ａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｔｈｅ
ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｉｓｗｅｌｌｄｅｖｅｌｏｐｅｄ
ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｌｌｏｗｉｎｇｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｈｒｅｅｂａｃｔｅｒｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎ
ＰＣＲｔｕｂｅｗｉｔｈｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｅｑｕａｌｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓＤＮＡ
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ｗｈｅｎａｎａｌｙｚｅｄｉｎ
ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ．ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓａｍｐｌｅｓｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｅｄＤＮＡｏｆｌ矗ｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ．Ｖｉｂｒｉｏ
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ｙｉｅｌｄｅｄ
ｅｖｉｄｅｎｔ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｅｘｐｅｃｔｅｄＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓｏｆ７３７
ｂｐ，３８２ｂｐａｎｄ２７１ｂｐｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｗａｓ１０２－１０３
ＣＦＵ／ｍＬ．ｗｈｅｎ
ｉｔｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔ
ｔｈｅｖｉｂｒｉｏｓｉｎｌｉｖｅｒｓａｎｄｋｉｄｎｅｙｓｏｆｆｉｓｈｗｈｉｃｈｗｅｒｅａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄ，ｔｈｅｖｉｂｒｉｏｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｆｉｖｅｏｆｓｉｘｓａｍｐｌｅｓ，ｗｈｉｃｈｗａｓａｓ
８ａｎｌｅａｓ
ｔｈｅｖｉｂｒｉｏｆｏｒｍｅｒｌｙｉｎｊｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔ
ｗａｓｃｏｈｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈｔｈａｔｏｆＡＰＩ２０Ｅｍｅｔｈｏｄ；ｗｈｅｎｉｔｗａｓａｐｐｌｉｅｄ
ｄｅｔｅｃｔｔｈｅｖｉｂｒｉｏｓｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｏｆｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒａｎｄｗａｔｅｒ
ｓｅａｓｏｎ，ｏｎｅ
ｓａｍｐｌｅｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｓｅｖｅｎ
ｆｒｏｍｆｉｓｈｅｒｙｉｎｅｐｉｄｅｍｉｃ
ｏｆ１６ｔｉｓｓｕｅｏｆ
ｏｎｅｏｒ
ｓａｍｐｌｅｓ
ｐｒｏｄｕｃｅｄｐｏｓｉｔｉｖｅｂａｎｄｓｏｆ
Ｖ／ｂｒ／ｏ玩九柳，ａｎｄ
ｏｆ１６ｗａｔｅｒｓａｍｐｌｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ
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ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅ
ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ
ｔｅｓｔｅｄ
ｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ
ａｎｄＡＰＩ２０Ｅｍｅｔｈｏｄｓｗａｓ９３．７５％．
Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｂｕｔａｌｓｏｔｏ
ｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ
ｍｃ（毗ｔｈｅ
ｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｃｏｕｌｄｂｅ．ｕｓｅｄｎｏｔｏｎｌｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｅｔｈｅｅｌｉｎｉｃａｌｌｙｄｉｓｅａｓｅｄｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒ，
ｃａｒｒｉｅｒ．Ｗｈａｔｉｓｍｏｒｅ，ｔｈｅｒｅ
ｖｉｂｒｉｏｓｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｔｏｃｕｌｔｕｒｅｄｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒｉｎｔｈｅａｑｕａｔｉｃ
ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｉｔ
ｂｅｃｏｎｃｌｕｄｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｉｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｓｅｎｓｉｔｉｖｅ．Ｉｔｉｓ
ｒｅｌｉａｂｌｅｔｏｏｌｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
ｔｈｅｍａｊｏｒＶｉｂｒｉｏｓｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｗｉｔｈｌｅｓｓｔｉｍｅａｎｄｃｏｓｔ，ａｎｄｉｔ
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Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
ｏｆＣｈｉｎａ，２００９，１６（２）：１５６－１６４】
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒ（风ｅ眦ｆ，ｂ∞ｃ施ｅ，弛ｃｒｏｃｅａ）；ｅｏｌｌａｇｅｎａｓｅｇｅｎｅ；Ｚ１０胡ｇｅｎｅ；ｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＷＡＮＧＧｕｏ－ｌｉａｎｇ．Ｔｅｌ：０５７４－８７６００９２２；Ｅ－ｍａｉｈ
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养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用
作者：作者单位：
祝Z琳， 王国良， 金珊， ZHU Jing-lin， WANG Guo-liang， JIN Shan
祝Z琳,ZHU Jing-lin(&应用海洋生物技术&教育部重点实验室,宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江宁波315211;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,江苏,无锡,214081)， 王国良,WANG Guo-liang(&应用海洋生物技术&教育部重点实验室,宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江宁波315211;宁波大学医学院,浙江宁波,315211)， 金珊,JIN Shan(&应用海洋生物技术&教育部重点实验室,宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江宁波315211)中国水产科学
JOURNAL OF FISHERY SCIENCES OF CHINA)0次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：引用次数：
参考文献(24条)
1.毛芝娟.刘国勇.陈昌福 大黄鱼溃疡病致病菌的初步分离与鉴定[期刊论文]-安徽农业大学学报 .金珊.王国良 海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的流行病学研究[期刊论文]-水产科学 2005(01)
3.王国良.祝Z琳.金珊 养殖大黄鱼3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育学分析[期刊论文]-海洋与湖沼 .余俊红.姚斐.俞勇 应用间接荧光抗体技术快速检测花鲈病原菌-鳗弧菌[期刊论文]-海洋水产研究 .王军.鄢庆枇.苏永全 溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测[期刊论文]-海洋科学 2002(07)
6.鄢庆枇.苏永全.王军 大黄鱼弧菌病的荧光抗体快速诊断研究[期刊论文]-集美大学学报(自然科学版) .王军.鄢庆枇.苏永全 养殖大黄鱼副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究[期刊论文]-台湾海峡 .鄢庆枇.方恩华.苏永全 大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测[期刊论文]-台湾海峡 2004(01)
9.Lee C Y.Pan S F.Chen C H Sequence of a cloned pR72H fragment and its use for detection of Vibrioparahaernolyticus in shellfish with the PCR 1995(04)
10.Kim Y B.Okuda J.Matsumoto C Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the specieslevel by PCR targeted to the toxR gene 1999(04)
11.Conejero M J U.Hedrvda C T Isolation of partial toxR gene of Vibrio harveyi and design of toxR-targeted PCR primers for species detection 2003(03)
12.Conejero M J U.Hedrvda C T PCR detection of hemolysin (vhh) gene in Vibrio harveyi .Pang L.Zhang X H.Zhong Y Identification of Vibrio harveyi using PCR amplification of the toxRgene 2006(03)
14.Lee K K.Yu S R.Yang T I Isolation and characterization of Vibrio alginolyticus isolated fromdiseased kuruma prawn,Penaeus japonicus 1996(02)
15.Liu P C.Lin J Y.Hsiao P T Isolation and characterization of pathogenic Vibrio alginolyticus fromdiseased cobia Rachycentron canadum 200416.萨姆布鲁克?J.拉塞尔 分子克隆实验指南 2002
17.邓先余 6种水产病原菌16S-23S rDNA间区序列分析及检测技术[学位论文] 2003
18.Henegariu O.Heerema N A.Dlouhy S R Multiplex PCR:critical parameters and step-by-step protocol1997(03)
19.Kong R Y C.Lee S K Y.Law T W F Rapid detection of six types of bacterial pathogens in marinewaters by multiplex PCR 2002(11)
20.Brasher C W.DePaola A.Jones D D Detection of microbial pathogens in shellfish with multiplex PCR
包含各类专业文献、专业论文、高等教育、文学作品欣赏、应用写作文书、外语学习资料、中学教育、52养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用_图文等内容。　
　PCR 扩增技术, 是在同一反应体系中加人多对引物...本文对多重 PCR 技 术在食品病原细菌检测中的应用...涉及人数最多, 其中又以副溶血性弧菌(Vibrio para... 　目前发展起来的多重PCR 检测技术可以几种微生物同时...对大肠杆菌、沙门氏菌和致病性弧菌等的同步检测 。...ATP生物荧光技术检测乳制品中的细菌总数及特异性病原... 　抗体技术、核酸 杂交技术、聚合酶链反应(PCR)技术等...目前生物技术在水产养殖病原体检测上的应用 ,我国...用于菲律宾哈上,成功检测出了弧菌 PI 满意的 效果... 　PCR技术在食品安全检测上的应用_生物学_自然科学_专业...2.2.6 利用 PCR 技术检测肉中的副溶血性弧菌 副...肉类中大肠杆菌 O157:H7 多重 PCR 检测方法的建立... 　组织开展了“大黄鱼人工育苗及其增养殖应用技术研究”...苗种调运与投放之前要进行检验、检疫,防止病原带...大黄鱼的几种主要病害及其具体防治措施 1、弧菌病:... 　多重 PCR 技术、实时荧光定量 PCR 检测技术、免疫 ...应管内同时检出多种病原微生物,如肝炎病毒、肠道...副溶血性弧菌、志贺氏菌、大肠杆菌、单 增李斯特菌... 　病原:主要为弧菌属的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) 、副溶血弧菌(V....本病并非养殖大黄鱼的常见病害,如果放养密度过高、 水体流动不畅、有机碎屑过多... 　生物技术在水产养殖中的应用_水产渔业_农林牧渔_专业...SPF 是一 个病原控制概念,核心技术是病原检测技术...近年来,有学者已成功制备了 抗鳗弧菌的单抗和抗嗜... 　王军等[7]建立了养殖大黄鱼病 原溶藻弧菌的间接荧光抗体免疫快速检测技术。该...3.4.2 聚合酶链式反应(PCR)技术 基因探针技术虽已广泛应用,但主要问题是灵敏...