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硼酸酯偶联剂的合成与应用研究
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硼酸酯偶联剂的合成与应用研究
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缺血性脑卒中易感基因与环境因素交互作用的分子流行病学研究
华中科技大学 博士学位论文 缺血性脑卒中易感基因与环境因素交互作用的分子流行病学研 究 姓名：刘建平 申请学位级别：博士 专业：流行病与卫生统计学 指导教师：聂绍发;程锦泉
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文缺血性脑卒中易感基因与环境因素交互作用的 分子流行病学研究博士研究生：刘建平 导 师：聂绍发 教授 程锦泉 教授摘研究背景要缺血性脑卒中是受遗传与环境因素共同作用的多因子疾病,基因-基因、 基因 -环境交互作用在缺血性脑卒中的发病中具有重要影响。随着人类基因组计划的 完成,从基因水平阐明缺血性脑卒中的发病机制成为医学界关注的热点。近年来 研究表明 eNOS、GH1、IGF-1R 基因多态性能显著影响基因的表达,这可能与缺 血性脑卒中、冠心病的发生密切相关。但是关于 eNOS、GH1、IGF-1R 多态性与 缺血性脑卒中之间的关系, 以及该多态性与环境因素之间交互作用对缺血性脑 卒中的影响，国内外罕见报道。研究目的1.探讨 eNOS 基因-922A/G、 T-786C 及 G894T 基因多态性与缺血性脑卒中的 关系。 2.探讨 eNOS 基因多态性与环境因素之间的交互作用在缺血性脑卒中发病 中的地位与作用。 3.探讨 GH1 基因 T1663A 多态性与缺血性脑卒中的关系，同时研究其与相 关环境暴露因素之间的交互作用在缺血性脑卒中发病中的作用。 4.探讨 IGF-1R 基因 G/A(rs2229765)、A/G(rs951715)、A/G(rs2593053)多态性 与缺血性脑卒中之间的关系。 5.探讨 IGF-1R 基因多态性与相关环境暴露因素之间交互作用与缺血性脑卒I华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文中的关系。 6.采用分类树统计分析方法初步构建缺血性脑卒中发病风险的预测模型。研究方法本研究采用候选基因和病例对照的研究方法， 收集深圳市两家大型综合性医 院的 309 名缺血性脑卒中新发病例，按年龄相差小于 5 岁、性别、民族相同的匹 配条件选取对照，开展以医院为基础的 1U1 配对病例-对照研究。采用统一的调 查问卷对病例和对照进行调查， 并按相同的条件和标准采集病例和对照的血液样 本。用 Taqman MGB 荧光定量 PCR 技术分析基因多态性的基因型。运用单因素及 多因素 logistic 回 归分析基因多态性与缺血性脑卒中之间的关系，运用 PHASE2.0 软件进行单体型分析，用相加模型分析基因与环境相关危险因素之间 的潜在交互作用， 最后运用分类树分析方法初步构建缺血性脑卒中发病风险的预 测模型。主要研究结果1. 单因素 Logistic 回归分析结果表明： 文化程度、 体质指数、 腰臀比、 吸烟、 高血压、糖尿病、负性生活事件、甘油三酯等是缺血性脑卒中发病的危险因素。 在多变量 Logistic 回归模型中，吸烟（OR=5.42；95%CI：2.00~14.63）和高血压 （OR=3.51；95%CI：1.83~6.71）是缺血性脑卒中发病的正关联因素；而体育锻 炼（OR=0.10；95%CI：0.05~0.22） 、饮茶史（OR=0.25；95%CI：0.12~0.55）是 缺血性脑卒中发病的负关联因素。 2. eNOS 基因 T-786C 多态性基因型分布差异没有统计学意义（P=0.132）, 按性别进行分层后，男性病例组与对照组基因型分布差异处于临界值水平 （P=0.053） ；在未调整混杂因素时，携带 CC 基因型的个体患缺血性脑卒中风险 为 TT 3.819 倍，P=0.029；在调整上述因素的影响后，携带 CC 基因型的个体患缺 血性脑卒中风险为 TT 的 4.533 倍，P=0.047。eNOS 基因 A-922G 多态性病例组的 G 等位基因频率高于对照组,差异有统计学意义(P=0.018)，基因型分布进行线性 趋势检验，χ2=4.886, P=0.027，可见随着等位基因 G 的增加,发生缺血性脑卒中II华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文的危险性也增高；在调整上述因素影响后，A-922G 多态性仍是缺血性脑卒中发 病的危险因素, OR 值为 2.156，P=0.029。 3. GH1 基因 T1663A 多态性等位基因频率及基因型频率分布差异无统计学 意义，P 值分别为 0.124 和 0.358；多因素 Logistic 回归分析发现，GH1 基因多态 性与缺血性脑卒中发病无关联。 4. IGF-1R 基因 G→A 多态性，病例组 A 等位基因频率(50.00%)高于对照组 (31.93%)，等位基因频率分布差异有统计学意义(P=0.001)；以 GG 基因型为参考 基因型，在调整其他混杂因素的影响后，携带 AA 基因型的个体缺血性脑卒中发 病风险增加，OR=1.992，P=0.015。对于 A/G(rs951715)多态性，病例组 G 等位 基因频率（56.15%）高于对照组（43.85%） ，P=0.001，以 AA 基因型为参照，携 带 AG 基因型的个体缺血性脑卒中的发病风险增加，OR 值为 2.201，P=0.000； 当调整其他因素影响后，AG 基因型仍是缺血性脑卒中发病的危险因素，OR 值 为 2.381，P=0.000。 5. T-786C 多态性与高血压家族史、糖尿病、糖尿病家族史及吸烟存在正相 加交互作用，S 为 3.76、3.10、4.22 和 1.63；A-922G 基因多态性与饮酒存在负相 加交互作用，S 为 0.43，与高血压家族史，糖尿病家族史和吸烟存在正相加交互 效应，S 分别为 2.46、3.24、1.99；调整混杂因素后，GH1 AT 基因型与超重存在 交互效应，P 为 0.025，OR 值为 4.06。未发现 IGF-1R 基因多态性与环境因素存 在明显的交互作用。 6. 采用分类树构建脑卒中发病风险模型，分类树模型共包括 4 层，共筛选 出 6 个解释变量。采用筛检试验评价指标对模型的灵敏度和特异度进行评价，结 果发现灵敏度为 76.70%，特异度为 81.88%，约登指数为 58.58%。研究结论1. 传统的危险因素仍是目前深圳市汉族人群中缺血性脑卒中发生的主要原 因，因此在人群中培养健康的生活方式，早期、及时地控制高血压、糖尿病、血 脂和体重是预防缺血性脑卒中的主要措施。 2. eNOS 基因 T-786C、A-922G 多态性和 IGF-1R 基因 G/A(rs2229765)、III华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文A/G(rs951715)多态性均于缺血性脑卒中遗传易感性显著相关。 3. eNOS 基因 T-786C、A-922G、GH1 基因 T1663A 多态性与环境因素如吸 烟、高血压、家族史等之间在缺血性脑卒中患病中存在不同程度的交互作用。 4. 分类树模型能够较好地拟合缺血性脑卒中发病风险的预测模型。 5. 缺血性脑卒中是由许多微效基因协调作用并与环境因素共同作用的结 果，研究它们之间的相互关系对阐明缺血性脑卒中的病因及发病机理有重要意 义。关键词多态性缺血性脑卒中内皮性一氧化氮合酶类胰岛素生长因子受体 基因生长激素 交互作用IV华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文A Molecular Epidemiological study of Gene Polymorphisms and Environmental Factors Associated with Ischemic StrokeCandidate: Liu Jian-Ping Supervisor: Prof. Nie Shao-Fa，Cheng Jin-QuanAbstractBackgroundIschemic stroke (IS) is a multi-factorial disease, which is related to both the genetic and environmental factors. Gene-gene and gene-environmental interaction makes great contribution to the risk of IS. With the advance of Human Genome Project, it has become more and more popular in medical fields to clarify the pathogenesis of IS at genetic level, especially IS. In recent years, studies have suggested that endothelial nitric oxide synthase (eNOS), growth hormone(GH) and insulin-like growth factor-I receptor (IGF-1R) gene, which can significantly affect gene expression, have been associated with IS and coronary heart disease (CHD). However, reports are extremely rare presently on the association between the above-mentioned genes and IS in the Han nationality of China, and the interaction between the gene polymorphisms and environmental factors.Objectives1. To explore the association between the T-786C, A-922G and G894T polymorphism in eNOS gene and IS. 2. To explore and assess the possible interaction effects between eNOS gene polymorphisms and environmental factors. 3. To explore the association between GH1 T1663A gene polymorphism and IS, in addition, to assess the interaction between GH1 T1663A gene polymorphism and IS. 4. To explore the possible association between IGF-1R gene G/A (rs2229765), A/G (rs951715) and A/G (rs2593053) polymorphisms and IS. 5. To explore and assess the possible interaction effects between the IGF-1R geneV华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文polymorphisms and environmental factors. 6. Classification tree model was applied to build the risk model for IS.MethodsCandidate genes and case-control study were used to determine the possible the association between gene and IS. A 1:1 matched case-control study was performed. 309 cases were those onset IS patients registered in two general hospitals in Shenzhen. The controls were selected by the same gender and ethnic group, and each pair’s ages were permitted to differ within 5 years. The cases and controls were interviewed using the same questionnaire, and the blood samples were drawn in terms of the same conditions and standards. Gene polymorphisms were determined by using Taqman MGB genotyping assay. Univariate test and multiple logistic regression models were used to explore the association between the above-mentioned genes polymorphisms and IS. Haplotype analyses of these polymorphisms were performed using PHASE2.0 software. Additionally, the interaction between genes and environmental risk factors were assessed by multivariate logistic regression model. The odds ratio values (OR) was calculated by using regression model to determine the addition effects among different factors and measure the interaction. Finally, Classification tree model was applied to build up the risk model for IS.Results1. Univariate logistic regression demonstrated that risk factors of IS included income, education, body mass index (BMI), WHR, smoking, hypertension, diabetes mellitus (DM), negative events and TG levels (triglyceride). In multivariate logistic model, smoking and hypertension were positively associated with IS, with OR=5.42 (95%CI: 2.00~14.63) and OR=3.51 (95%CI: 1.83~6.71) respectively, while moderate physical training and history of tea-drinking were inversely associated with IS, with OR=0.10 (95%CI: 0.05~0.22) and OR=0.25 (95%CI: 0.12~0.55), respectively. 2. For eNOS T-786c polymorphism, there were no significant difference in the distributions of genotypes between two groups (P=0.132). Stratified by sex, the p values for the genotypes of the above mentioned polymorphism was 0.053 in male. Conditional logistic regression revealed that the CC genotype of eNOS was associated with IS (OR=3.819, P=0.029). After adjustment for confounding factors, eNOS CC genotype was still significant associated with IS (OR=4.533, P=0.047). For eNOSVI华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文A-922G polymorphism, the frequency of eNOS -922 G allele was significant higher in the patients than the controls (12.14% vs 8.09%, P=0.018). Linear tendency test showed the risk for development of IS raised with increasing G allele (chi-square value=4.886, P=0.027). After adjustment for confounding factors, eNOS A-922G polymorphism was significant associated with IS (OR=2.156, P=0.029). 3. There were no significant difference in the distributions of allele and genotypes in GH1 gene T1663A polymorphism between two groups (P=0.124 and 0.358, respectively.). Multiple logistic regressions revealed that the GH T1663A polymorphism may not be an additional risk factor for the development of IS. 4. For IGF-R G/A (rs2229765) polymorphism, the frequency of IGF-1R A allele was significant higher in the patients than the controls (50.00% vs 31.93%, P=0.001). After adjustment for confounding factors, AA genotype was significant associated with an increased risk of developing IS with the GG genotype as reference genotype (OR=1.992, P=0.015). For IGF-R A/G (rs951715) polymorphism, the frequency of IGF-1R G allele was significant higher in the patients than the controls (56.15% vs 43.85%, P=0.000). Compared with AA genotype, AG genotype was significant associated with an increased risk of developing IS without adjusting for other confounding factors (OR=2.201, P=0.000). After adjustment for confounding factors, AG genotype was significant associated with an increased risk of developing IS (OR=2.381, P=0.000). 5. The positive additive interactions were found between eNOS gene T-786C polymorphism and family history of hypertension, DM, family history of DM and smoking, synergy Index (S) were 3.76, 3.10, 4.22 and 1.63, respectively. The interactions analysis between A-922G polymorphism and environmental factors indicated that a negative additive interaction was found between A-922G and alcohol drinking (S=0.43), and the S for family history of hypertension, family history of DM and smoking were 2.46, 3.24 and 1.99, respectively. No interactions between IGF-1R and environmental factors were found. 6. Classification tree model was applied to build up the risk model for IS, and the model had four stratum. Six explanatory variations were screened out in our model. The indexes of the screening test were used to evaluate the fitness of the model. The results revealed that sensitivity and specificity and Youden index were 76.70%, 81.88% and 58.58%, respectively.Conclusions:VII华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文1. The classical risk factors are still main reasons of patients with IS in the Han population of Shenzhen city. Therefore it is an important measure to prevent IS in community population to propose healthy life style including proper exercise, control of high blood pressure, high blood fat and weight. 2. The T-786C, A-922G polymorphism in eNOS gene and G/A (rs2229765) and A/G (rs951715) polymorphisms in IGF-1R are all significant associated with the hereditary susceptibility of IS in the Han population of Shenzhen city. 3. There are obvious interactions between T-786C and A-922G polymorphisms in eNOS gene and environmental factors such as smoking, alcohol drinking, hypertension, diabetes and family history vascular diseases. 4. Classification tree model can properly predict the occurrences of IS. 5. IS is caused by the interactions between many minor genes and environmental risk factors. It is very important to study their correlation to classify the cause and pathogenesis of IS.Key words: Ischemic Stroke, Endothelial Nitric Oxide Synthase, Insulin-LikeGrowth Factor-I Receptor, Genetic Polymorphisms, Growth Hormone, Interaction EffectsVIII独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□ ，在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密□。 （请在以上方框内打“√” ）学位论文作者签名： 日期： 年 月 日指导教师签名： 日期： 年 月 日华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文缺血性脑卒中易感基因与环境因素交互作用的 分子流行病学研究 第一部分 绪论脑卒中(stroke), 又称为中风或脑血管意外(Cerebrovascular accodent)， 是一组 突然起病，以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病，也是当今严重 威胁人类健康与生命的主要疾病。在西方国家它是继冠心病、恶性肿瘤之后死亡 率第三的疾病。在我国脑卒中是仅次于癌症的第二致死性疾病，每年新发脑卒中 超过 200 万，每年死于脑卒中者约为 150 万，存活者中 50-70%病人遗留瘫痪、 失语等严重残疾，由此可见脑卒中是严重危害人类健康的主要公共卫生问题之 一。 众所周知， 脑卒中、 冠心病等为代表的心脑血管疾病是多因素， 多基因疾病， 有关这类疾病的发病机制及病因远未阐明。国内外流行病学研究已经证实高血 压、冠心病、肥胖、吸烟和饮酒等是心脑血管疾病的主要传统危险因素，但这仅 能解释约 1/3 的脑卒中事件， 此外很多证据表明遗传因素在脑血管疾病中的作用。 随着人类基因组计划的完成，从分子水平揭示脑卒中的发病机理，可为及早发现 脑卒中的危险人群、预防脑卒中的发生提供有利手段。1 研究背景1.1 脑卒中的流行病学 目前有关脑血管疾病流行病学研究落后于其他非传染性疾病（如冠心病、高 血压、肿瘤等） 。原因比较多，首先是神经系统解剖生理的复杂性，诊断需要有 高水平的临床与基础神经学知识， 但是很少人接受神经病学和流行病学两门学科 的长期训练；其次对于大多数神经系统疾病，包括脑血管疾病，尚缺乏一致赞同 的最低诊断标准和统一的分类方法，因此往往造成不同中心调查结果差异较大。 在全球，从五十年代以后，传染性疾病得到了有效地控制，但是以脑血管疾病和 心血管疾病为代表的非传染性疾病在人类死亡原因序列中明显前移。根据 WHO 脑血管病协作研究组对 57 个国家的统计资料，脑血管病列在前三位的有 40 个； 因此病致死的人数占 57 个国家总死亡数的 11.3%。 1982 年以后在美国、 加拿大、 古巴等国占第三位。以我国城市人口计，在
年死因占第一位，19831华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文年后占死因第二位， 全国由此病致死人数占城市死亡总数的 20%左右， 占农村死 亡总数的 16%左右。在发病率方面，脑卒中的世界平均发病率约为 200/10 万人 口.年， 1980 年世界卫生组织协调进行的 12 个国家 17 个研究中心的脑卒中协作 研究表明：首次脑卒中的年发病率在 15-287/10 万，最高的是日本，最低的是尼 日利亚。流行病学研究资料表明，我国脑卒中发病率城市为 219/10 万，农村为 185/10 万，大体与世界平均水平一致或稍有偏高，但仍属于高发地区。特别是我 国北方一些地区，如哈尔滨市 441/10 万，黑龙江省农村 371/10 万。而最近研究 表明我国脑卒中平均发病率为 170.3/10 万，其中男性为 182.5/10 万，女性为 159.7/10 万。患病率方面，脑卒中的世界平均患病率为 500-600/10 万，我国 6 城市调查结果为 719/10 万，21 省农村调查结果为 394/10 万，与死亡率和发病 率相一致，我国北方一些省市如北京、哈尔滨、银川和黑龙江等地脑卒中患病率 很高。 最近台湾的一篇文献报道脑卒中患病率高达 1642/10 万。 在性别分布方面， 16 省市男女平均发病率之比为 1.6:1。在广东省男性脑卒中发病率为 351/10 万， 女性为 170/10 万，其中广州发病率为 160/10 万。 在我国按照 WHO-MONICA 方案诊断标准监测表明，在 27 个国家的 47 个 中心中，我国男性脑卒中发病率居第 11 位，女性为第 3 位，且该人群脑卒中呈 北高南低的梯度分布；此外我国 16 省市平均发病年龄为 60.9 岁，较国外提前十 年左右，这从另一面也说明在我国开展脑卒中的防治工作，推迟发病年龄是有潜 力的，也表明随着我国人口的老龄化，脑卒中将成为我国一个严重的公共卫生问 题之一。病死率也是反映脑卒中的一个重要指标，我国南方省市脑卒中调整病死 率为 23.8-68.1%，南方省市脑卒中病死率高于北方（30-40%左右） 。 1.2 脑卒中的病因及危险因素 在流行病学中病因是指被流行病学判断病因的八大因素证实的疾病的真正 病因；而危险因素是有潜在病因可能而被证实的与发病显著相关因素，二者不能 等同， 但又有联系。 引起脑卒中发生的因素众多， 目前比较明确的脑卒中病因有： (1)动脉的损害：凡是引起脑动脉病变的因素，都可成为脑卒中病因。如高血压， 动脉硬化性血栓性栓塞，颅内小血管病变，全身动脉炎性病变影响脑动脉，如多 发性大动脉炎，结节性动脉炎，系统性红班狼疮，感染性动脉炎，如钩端螺旋体 性、梅毒螺旋体性、真菌性脑炎等，动脉夹层病变和先天性脑血管病变等。(2)2华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文血液流变学异常：血液黏度增高，血液浓缩等。(3)血液动力学异常：低血压， 放射病。(4)血液成分异常：如各种栓子、红细胞异常、血小板异常、凝血因子 异常等。(5)一些继发因素引起：如肿瘤（癌栓子坏死或侵袭动脉出血） 。目前认 为脑卒中的主要危险因素主要分为两类： 一类是无法干预的， 如年龄、 基因突变、 遗传等；另一类是可以干预的，有高血压、糖尿病、肥胖、吸烟、坐位生活方式、 口服避孕药、短暂性缺血发作(TIA)、父母卒中史、偏头痛、饮食因素、饮酒等。 近年来发现 40 岁以下脑卒中发病率在我国有逐年上升趋势，目前有关中青年脑 卒中发病的病因及危险因素也开始成为研究的热点。 一些研究表明早发性动脉粥 样硬化及高血压动脉硬化是青年性缺血性脑卒中，特别是 30 岁以上脑梗死的主 要病因，这与越来越多的青年人血脂代谢异常、糖尿病、高血压、肥胖、从事紧 张性工作、吸烟、饮酒、进食高热量饮食有关，是促发青年早发性动脉粥样硬化 的主要危险因素。 近年来研究发现心源性脑梗死在各种原因引起的年轻人脑梗死 中占 11.5-25.8%， 青年人风湿性心脏病和先天性心脏病是引起心源性脑梗死的主 要原因。在青年脑梗死发病中，遗传因素是一个重要的不可忽视的因素，其中心 脑血管病家族史是青年脑梗塞发病的主要危险因素。 但是许多人即使具备上述危 险因素却未发生脑卒中，这说明脑卒中的发生还与其他因素有关，尤其是个体遗 传易感性。因此近年来脑血管分子流行病学要寻找包括社会、环境及遗传因素在 内的新的危险因素。这些新的危险因素包括传统危险因素中的一些亚单位，如造 成胆固醇紊乱的一些特异性脂蛋白。 另外脑血管疾病研究的两个新型领域是： (1) 对脑血管疾病炎症过程的研究；(2)对脑血管疾病易感基因的研究。 1.3 缺血性脑卒中发病机制 由以上可知， 动脉粥样硬化斑快、 炎性标志物是脑血管疾病的重要危险因素。 斑快的破裂、血小板的聚集及血栓的形成是缺血性脑卒中的主要发病机制。目前 一般认为动脉粥样斑快的不稳定和易破裂及继发血栓形成或栓塞从而引起急性 脑卒中的发生， 而不稳定的斑块的一个重要特征是大多有炎性细胞特别是巨噬细 胞、T 淋巴细胞的浸润。由此可见对炎症的研究主要是阐明脑血管疾病发病的第 一阶段动脉特征性硬化和增厚的动脉粥样硬化。 炎症标志物的增加表明血管内膜 受损，接下来动脉便发生巨噬细胞、血小板及含量丰富的脂类斑块的聚积。高血 压加重了动脉粥样硬化的问题，因为血液被迫以高速通过阻塞的动脉。然而只有3华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文一少部分动脉梗塞的病人演变成像缺血性脑卒中这样的临床血栓形成综合征， 其 中动脉斑块便成了威胁生命的凝血块。 动脉粥样硬化是血管壁对各种刺激引起的 一种保护性炎性纤维增生性反应,是心肌梗死、卒中和肢端坏疽的主要原因。动 脉粥样硬化导致动脉内膜增厚，脂质沉积，甚至粥样斑块形成。而斑块破裂、斑 块内出血以及斑块基础上血栓形成,均可导致动脉供血区脑组织缺血、梗死。动 脉粥样斑块的形成需要血液中的单核细胞募集至血管内膜， 继而形成巨噬泡沫细 胞。血管内皮细胞在此过程中被激活，产生白细胞黏附因子及细胞素，参与粥样 硬化的过程。 1.4 缺血性脑卒中病理生理 近年来，虽然钙超载、毒性氧自由基和兴奋等学说的出现为解释脑缺血的病 理生理奠定了基础，一些治疗脑缺血的药物如钙通道阻滞药、自由基清除剂和兴 奋性氨基酸拮抗剂也应运而生，但是效果不是很明显。这也说明有关脑缺血病理 生理的研究仍是艰巨的任务。 钙超载理论认为钙超载后触发了一系列影响再灌期 神经元存活的反应，引起神经元存活后数小时乃至数日后继发性死亡。始初的损 伤可能引起细胞膜钙处理能力的持续变化，导致线粒体持续、缓慢的钙超载。另 一种可能是细胞内的信号转导通路持续紊乱而引起转录和翻译水平上的改变， 及 某些细胞(如产生应激蛋白的细胞、产生营养因子或对存活必需酶的细胞)的丢 失。与此相反，局部脑缺血虽然也会引起钙超载而触发一系列反应，但对脑细胞 死亡的作用是次要的， 而起主要作用的是在继发性损伤中产生的调质所引起的反 应。这些调质可能是花生四烯酸(AA)代谢物，一氧化氮(NO)，自由基或其它活 性代谢物。 这些调质可诱导内皮细胞和多形核白细胞(PMNLs)上粘连分子的表达 或氧化关键蛋白质，还可触发炎性细胞因子如白介素(IL)-1，-6，-8，γ-干扰素， 或肿瘤坏死因子(TNF)的合成和释放，引起缺血阴影区微血管阻塞。 近年来研究发现 NO 在脑循环和脑损伤过程中起重要作用,它与经典的神经 介质不同， 它能在神经元之间或神经元与胶质细胞之间进行顺向和逆向的信息传 递。它在心脑血管，神经系统和免疫系统有很广泛的功能。已经证明内皮细胞、 神经元和神经纤维末稍(非肾上腺和非胆碱神经纤维，NANC)以及神经胶质细胞 内均有 NO 合酶(NOS)。NO 是很强的血管扩张剂，抑制血小板聚集和白细胞粘 连。在生理状态下，由内皮、神经元和胶质细胞生成的 NO 作用于平滑肌细胞内4华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文的乌苷酸环化酶，生成 cGMP，引起脑血管扩张张。持续的 NO 生成，使脑血管 保持正常张力。在病理条件下，如在脑缺血时，脑缺血后 2～3min，NO 迅速增 加，6min 达到高峰，60min 降至正常水平。因此在缺血超早期，内皮产生的 NO 超过神经元产生的有毒性的 NO，能增加侧枝循环，阻止血小板和白细胞对微血 管的阻塞，改善脑循环，这是其有利的一面。NO 具有双重作用，其有利一面， 除对改善 CBF 外，还能阻滞 NMDA 受体，这是由于 NO 氧化产生亚硝基离子， 对 NMDA 受体亚硝基化，从而减轻兴奋毒对神经细胞的损伤。其有害的一面是 在脑缺血数小时后，NO 对血管不再有保作护用，而变为有害的了。在脑缺血超 过 6 h， iNOS 在脑缺血后的炎症细胞部位表达， 产生大量 NO， 引起迟发性损伤， 过量 NO 对细胞有不利的影响，如 NO 与 OO2- 作用能生成过氧化硝基产物 (peroxynitrite)，发挥细胞毒作用。NO 还可引起能量耗竭，产生 DNA 损伤，抑制 DNA 合成，而且触发细胞凋亡。因此 NO 在脑缺血中的利和弊取决于脑缺血后 的不同时间段和 NO 是由哪种细胞所产生的。 1.5 基因多态性研究现状 单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)由于其分布广、密度 高等特性作为第三代遗传标记，成为后基因组时代研究的热点，目前认为 SNP 是决定人类疾病（尤其是多基因疾病及复杂疾病）易感性和药物反应差异性的主 要因素。SNP 不仅存在于基因组非编码区，也存在于基因的编码序列中，被称为 编码 SNPs (cSNPs)， cSNPs 中的非同义 SNPs 可引起基因编码的蛋白质功能改变， 如引起酶动力学参数，基因转录调控蛋白的 DNA 结合能力、跨膜受体信号转导 活动及结构蛋白结构的改变，而位于基因调控序列中的 SNPs 则会影响基因表达 量的多少，故这两类 SNPs 的生物学意义非常显著，被称为功能性多态性。由于 其数目众多、遗传稳定及适用于自动化、高通量检测的优点，在常见疾病和药物 遗传学研究中具有重要意义。 SNP 的检测包括以下两方面内容：在基因组范围或某一特定 DNA 区域搜寻 未知的 SNP；对一直的 SNP，确定其在若干或不同群体中的分布范围和分布频 率。这些都需要建立有效的技术和方法进行简单和快速的检测。 首先搜寻未知的 SNP，目前已建立了两大类方法：1、依赖于构像改变引起 电泳迁移率差异的技术，如单链构像多态性分析（SSCP） ，异源双链分析（HA） ，5华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术等；2、由于 DNA 片段的断裂而引起电泳图像 改变的技术：RNA 酶断裂和错配化学断裂法（CCM）等。上述方法均需要电泳 进一步证实。近几年来建立了几种新的检测方法：T4 内切核酸酶断裂法，大肠 杆菌错配修复酶法，变性高效液相色谱法（DHPLC） 。这些方法虽然在可靠性， 易操作性等方面存在或多或少的问题，但为 DNA 序列的测定、分子多态检测提 供了新颖的思路。其次检测已知的 SNP，上述搜寻未知 SNP 的技术均可用于对 已知 SNP 的诊断，确定其分布范围和分布频率。此外等位基因特异性聚合酶链 反应（ASPCR） ，单核苷酸引物延伸（SNUPE）和 DNA 芯片三项技术均可大量 鉴定已知 SNP，且除 ASPCR 外均不需电泳鉴定。 目前认为包括 SNP 在内的 DNA 序列变异是由诸如突变、重组、选择等进化 压力作用的结果，随着时间的变化，这些进化压力决定了现代人类基因组结构与 疾病易感性之间的关系。对于寻找常见疾病的致病基因而言，关联分析较连锁分 析更为有效， 但其核心是连锁不平衡分析 （LD） 已广泛应用于常见疾病的研究。 ， 关联分析的结果有统计学意义时，其意义不外乎以下三点：该结果可能因混杂或 选择偏倚而出现假阳性； 该等位基因同另一位点上的直接影响该病表型的等位基 因存在连锁不平衡；该等位基因本身在功能上直接影响该病表型的表达。 1.6 SNPs 研究存在的问题 SNPs 研究现在正处于发展之中, 虽然它有很好的前景, 但目前仍存在不 少问题。 1、基因选择问题：人类的 30 亿缄基中大约有数百万个 SNPs 位点。因此在 如此众多的基因及 SNPs 位点中选择哪些基因？在同一基因中选择哪些 SNPs 位 点进行研究？这些已成为许多分子流行病学研究工作者所关注的问题。 目前选择 基因主要从以下几方面考虑：应着重研究参与疾病发生发展的具有共性的基因； 具有明确的病理生理学或生物化学基础；候选基因多态性具有潜在的功能影响； 对于多基因疾病，应根据不同疾病可能的发病机理，选择同一通路的多个候选基 因或相互关联的不同通路的候选基因进行联合分析。 2、样本量的问题：虽然基因多态性和疾病可能关联的文献有大量发表，但 结果的不一致性的现象较为普遍，重要原因之一是样本量都偏小。以病例对照研 究为例， 目前国内外的平均样本量在 150~300 对。 这样的样本量不足以判断人群6华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文中存在较罕见的 SNPs（如频率&5%）或虽频率较高但其与疾病的关联强度较弱 的 SNPs。因此为了进行可能由 SNPs 起主效应的研究，开始时一般建议要有 300 对以上的对子，如果要进行交互作用的分析，常常需要 1000 对对子以上。 3、研究设计问题：目前研究设计大多采用传统的病例对照研究。该研究设 计关键要选择合适、 可比的、 具有人群代表性的对照和控制可能存在的选择偏倚。 在病例选择上最好选新发病例而不是现患病例。 在对低共显性基因和复杂性状疾 病的分子流行病学研究中，对于混杂因素的的控制尤为重要。 4、复杂疾病相关分析中的问题：在 Skokloster 举行的国际 SNP 及复杂基因 分析会议上透露出许多问题，利用 SNP 寻找致病基因的工作并不象最初想象的 那样简单。研究者除需要大量的 SNPs, 有时需要弄清被研究人群的历史，如他 们的迁移模式等。在对心脏病危险因素 LPL 基因的研究中，由于减数分裂中的 基因重组，使 SNP 的关联分析很困难；Rosalind Harding 用 SNPs 研究镰刀细胞 贫血的 β 球蛋白基因时也遇到了困难，她认为研究者除依靠 SNP 外，还需知道 疾病的模式及被研究人群的历史。 5、基因型的检测：目前虽然有大量检测 SNP 的方法，但大都价格昂贵，速 度较慢，这限制了其在关联研究中的应用，所以迫切需要低成本，高生产率的新 方法出现。目前的遗传分析系统在对多个 SNPs 位点进行基因分型中具有快速及 低成本的特点，有广泛的应用前景。此外必须采用灵敏度和特异度高的基因分型 方法，尽可能降低假阳性和假阴性结果。 6、结果的评价与解释：许多研究报道过分强调了来自分层分析的结果，而 这样的结果往往缺乏普遍意义，从而导致了来自不同研究的结果不一致。对于关 联研究结果的评价和验证需要综合 SNPs 所在序列信息、进化保守性的有无、人 群遗传学、实验室功能学证据、暴露评价（如基因型-环境交互作用研究）和流 行病学证据。如 Rebbeck 等根据上述综合证据把 SNPs 是否具有功能效应分为强 支持功能显著性、中度支持功能显著性及无功能显著性三类。 1.7 基因多态性与复杂性状疾病的研究策略 由以上可见，群体关联分析比较容易出现假阳性的结果，因此针对各种可能 出现假阳性的因素，应在实验设计中予以足够重视，通常一个完整的群体关联设 计包括确定被研究群体，选择候选基因，然后多态性检测、基因分型及单体型分7华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文型，最后是数据分析。在上述实验设计中，各个环节都有可能影响数据分析的结 果和准确性，为了克服假阳性结果，目前有以下几种解决的途径：1.尽可能选择 一个相对同源的群体、如地区、年龄结构、种族、性别比例相同、人口流动性较 小； 2.应用专门的软件分析一些与疾病无关的遗传标记在两组间的分布差异是否 存在显著意义，以判断群体分层程度和关联分析结果的真实性；3.通过前瞻性研 究来验证；4.选择以受累家系为基础的内在对照组（由双亲及同胞组成） ，进行 单体型相对风险率及传递/不平衡试验，从而排除可能的虚假关联；5.加大样本 量。由于群体分层大大降低了参与关联分析的有效人数，使其难以反映标记位点 与疾病发生的关联性，增加样本量可以克服。 绝大多数复杂性疾病(complex diseases)都是多基因病，指一类由多对、十几 对或更多的基因控制的，遗传因素与环境因素相互作用的疾病，如高血压、脑卒 中、冠心病等为代表的心脑血管疾病。目前认为一些常见的遗传变异、主要是指 SNPs 及其特定组合可能是造成复杂性状疾病易感性的最重要的原因，与一般的 单基因疾病有很大差别。以往传统的关联分析是建立在候选基因的基础上，如果 该遗传标记的等位基因频率在两组中有显著性差异， 则表明该候选基因与所研究 的疾病有关。传统的关联分析主要缺点之一是不适合发现新的易感基因或致病 DNA 区域。尤其是随着大量代谢通路和 400 万个 SNPs 的确认，传统的分析策 略就显示出巨大弊端。从另外一方面也说明 SNP 与疾病的关联研究显示出极有 潜力的应用前景，现代疾病易感基因研究策略主要包括以下几方面：1.基于候选 基因的关联分析，该方法是发现易感基因的最常用的方法，采用基于病例对照或 基于家系背景的关联分析。 该研究方法应用于复杂性状疾病易感基因与表型的相 关研究，如糖尿病、高血压、肥胖、脑卒中等。2.基于候选区域的关联分析：当 用 STR 作连锁分析或细胞遗传学方法发现某一区域或染色体上的条带与疾病表 型相连锁，研究者可在该区域以每 10 kb 中选 1 个 SNP 的密度研究与疾病表型 相关的位点， 由于候选区域大小一般在 5～30cM 之间， 所以一个项目研究一般 要选用 500～3000 个 SNPs 作遗传标志。所需的病例样本数为 300 例以上，最好 1000 例以上。基于候选区域的关联分析的最大优点是提供了发现新的疾病易感 基因的可能。 如最近在 Nature Genetics 上连续发表的对类风湿关节炎新的易感基 因有机分子转运基因 SLC22A4 和小牛相关转录因子 1 RUNX1 的发现，新的易8华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文感位点 PADI4 单体型的发现，都是运用的这种策略。3.全基因组的分析策略： 该策略不但为发现新的易感基因提供了可能， 也为找到复杂性疾病致病机制中可 能起重要作用的弱效基因提供了有效的手段。 尽管目前还没有确定全基因组关联 分析的 SNP 密度，但根据不同 DNA 区域、不同的种族、SNP 密度的选择会有所 不同。 1.8 目前基因多态性与脑卒中关系研究存在的局限性及策略 脑血管病的致病基因广泛，其发病是遗传和环境共同作用的结果，目前关于 其遗传易感性与脑卒中关系的研究结论还不很完善，且许多研究结果存在矛盾， 可能主要是关联研究设计的各个环节影响到了数据分析的准确性， 表现在研究者 选择研究对象的种族、地域、分布及研究方法的差异。此外很重要的方面是目前 研究基因多态性与脑卒中遗传易感性关系多局限在单个基因上，没有从基因、环 境暴露和蛋白水平综合进行研究，进而无法从基因-表型、基因-环境、基因-基因 的角度揭示基因多态性在脑卒中发生中的作用； 另外关联研究中没有进一步探讨 多态性对基因表达功能的影响；在数据分析方面，必须进行单体型分析，因为在 相同样本量的条件下，进行多位点相关分析比单位点分析的所得结果更可靠。所 以解决的办法和策略必须着眼于以上几个方面。 1.9 Meta 分析在脑卒中基因多态性研究中作用 从上面的论述可以知道，脑卒中是一组复杂的多基因、多因素的疾病，目前 脑卒中的遗传机制还不是很明确，但随着研究技术的进步和研究的深入，认识和 鉴定与脑卒中关联的基因多态性数目在不断增加， 到了一定数目后可以进行全基 因组范围的关联分析，进而可以进行大量的重复分析。而 Meta 分析作为一种定 量的文献分析方法，提供了一种解决有争议和不确定问题的较客观全面的手段， 可以更好地解决主要致病基因的这些问题。它通过增大样本含量来提高检验效 能，解决各个研究之间的矛盾问题，比较全面地掌握研究现状。迄今为止，脑卒 中遗传致病基因主要是 ACE 基因、 AGT 基因、 APOE、 基因、 MTHFR 基因、 eNOS 基因、ANP 基因等。虽然多数研究表明这些基因跟脑卒中都存在一些联系，但 对脑卒中的主要致病基因的看法不完全一致，有待进一步研究。研究表明缺血性 脑卒中是多基因病，利用所有可用出版的数据来提高统计力度，Meta 分析将允 许似合理的候选基因的排除，来鉴定可信赖的病因基因，遗传危险因素也将会被9华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文定量得更准确。同时, 利用脑卒中的遗传基因的病例对照的资料进行 Meta 分析, 也可以为循证医学指导临床提供有力证据。病例对照研究中，要求必须用足够的 几千个样本去检测从小到适中效果的基因， 少数个别的基因研究已经达到在这范 围的数据，但大多数基因还没有足够的病例对照研究。目前可能由于病例对照分 析资料的限制，对于脑卒中的致病基因的鉴别和联合危险因素的量化，其最终结 果还不完全一致， 有些分析结果还相互矛盾。 相信随着资料的积累， 采用 Meta 分 析来分析多基因在缺血性脑卒中的相互作用会具有更重要的意义。 国内杨天鹏等 人利用 Meta 分析研究脑卒中的候选基因，从而鉴定脑卒中的主要基因，发现 ACE、APOE 和 MTHFR 等基因与脑卒中密切相关。虽然 Meta 分析具有以上优 点，但利用 Meta 分析法来研究脑卒中的致病基因在国内的应用时间还不长，各 种研究所采用的研究方法及观察指标等具体操作准则还未形成统一的规范， 因此 其应用还受到一定的限制。但随着循证医学的发展，统计学方法的改进，Meta 分析在脑卒中基因遗传学中的应用会更广泛。2. 研究意义脑卒中是一组受遗传因素、环境因素及其相互作用影响的多因素、多基因疾 病，有关脑卒中发病机理及病因远未阐明。国内外流行病学已证实吸烟、饮酒、 糖尿病、肥胖等是脑卒中的主要危险因素，随着人类基因组计划的完成，分子生 物学技术迅猛发展，一系列脑卒中的易感基因被发现，如脂质代谢相关基因、肾 素-血管紧张素系统基因、四氢叶酸还原酶基因、凝血纤溶系统基因等。虽然一 些易感基因被确定，但是脑卒中是一种多基因疾病，有关脑卒中的致病基因远未 阐明。可见深入探讨脑卒中的发病机理，对脑卒中的防制与诊治具有重要的学术 价值及实际意义。 自 1980 年 Furchgott 等发现一氧化氮是舒血管因子以来，NO 及其合成酶与 基因便成为脑卒中、冠心病为代表的心脑血管疾病发病机理新的研究领域。迄今 发现内皮性一氧化氮合成酶基因变异主要有以下几种，一类是短串联重复多态， 另一类是位于启动子区的变异，如-922A/G、-786T/C 等；还有一类是外显子 8 的 G894T 变异，虽然国外一些表明 G894T 等基因多态性与缺血性脑卒中关联， 但也有相当研究得出相反的结论。同时最近国外一些研究表明饮食、行为方式等10华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文相关因素暴露可能通过体内的 GH-IGF-1 轴影响到脑卒中的发生，这提示脑卒中 可能有新的发生机制。近年来研究发现 GH1、IGF-1 基因启动子区域存在高度的 多态性，在 GH1 启动子区 535bp 区域存在 15 个 SNP，通过 40 种单倍型表现出 来，其中 10 个单倍型可能与基因表达水平升高有关，目前国外仅有一篇文献报 道了 GH1 基因多态性与脑卒中的关系，国内尚未见相关报道。且国内外的相关 研究侧重于从基因的角度探讨基因多态性与脑卒中易感性关系， 而忽略了或很少 涉及多个微效基因与特定环境因素存在的复杂的相互作用。 目前对于环境因素的 危险性评价目前虽然有许多规范的方法， 有一套相对成熟和健全的评价模式和体 系，但这种评价是基于一般人群的平均暴露水平的资料和实验数据，不能考虑到 和平衡存在差异的个体的实际耐受力， 尚未涉及到个体基因多态性对暴露危险性 的影响。但是随着分子生物学技术的发展，及人类基因与环境相互作用的机制的 不断阐明， 人类会明确基因、 环境、 及其相互作用在复杂疾病疾病中的作用机制， 一定会寻找到疾病的易感或致病基因， 从而预测具有特定基因型和环境危险因素 的个体的发病风险， 为缺血性脑卒中特异性干预措施的制定及预测预警系统的建 立提供科学的依据。 本研究采用 1：1 匹配的病例对照研究流行病学研究方法，对选定人群的环 境暴露情况定量测量， 运用 TaqmanMGB 探针荧光定量 PCR 技术对基因多态性进 行检测，并采用 RT-PCR 技术研究基因多态性对基因表达水平的影响。从基因环境、基因-基因、基因多态性与基因表达等角度揭示 eNOS、IGF-1R、GH1 等 基因多态性与脑卒中的关系，同时进行单体型分析，探讨 SNP 与缺血性脑卒中 的关系； 最后采用分类回归树统计方法初步构建缺血性脑卒中发病风险的预测模 型。本研究旨在寻找缺血性脑卒中的病因线索，为最终揭示其病因和发病机理奠 定理论基础。3.核心概念缺血性脑卒中 是指由于脑动脉管腔狭窄或阻塞，造成其灌流区的脑组织缺血或 坏死而产生的一系列临床症状。缺血性脑卒中包括脑血栓形成、脑栓塞、暂时性 脑缺血发作以及静脉系统的血栓形成等。 候选基因(candidate gene)候选基因通常是指已经获得某些证据说明其与某种疾11华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文病有关的基因。本方法是直接研究与疾病假说有关候选基因与疾病的关系,主要 分析这些候选基因在正常群体和患病群体之间的等位基因和基因型频率的差异。 单核苷酸多态性 是人类基因组中最常见的多态性表现形式，它是基因组 DNA 序 列中单个核苷酸的改变，充分反映了个体间的遗传差异，决定了个体对疾病的遗 传易感性以及对药物的敏感性， 作为人类基因组中数目最多且稳定的多态性标记 的单核苷酸多态性，正成为常见疾病及药物遗传学研究的重要工具。 单体型(Haplotype)定义：人类基因组中，相邻近的 SNPs 等位位点倾向于以一个 整体遗传给后代。位于一条染色体上或某一区域的一组相关联的 SNP 等位位点 被称为单体型(haplotype)，如果一个单体型有 N 个变异位点,理论上就可能有 2n 种可能的单体型。haplotype 的词根是 haploid，中文译为单倍体，描述配子细胞 的染色体组成，而 haplotype 是讲一条染色体上等位基因的同线状态或连锁相， 而不是指 23 条染色体（单倍体）的状态，因此中文应该译为“单体型”而不是 “单倍型” 。 基因型 (genotype)一个人所拥有的一对等位位点的类型。 基因型是某个人特有的 不同于其它人的基因密码，基因型本身不引起疾病，但是某些基因型对特定环境 因素非常敏感，进而增加疾病发生的风险。基因型这一名称既可以指个体 SNP 的等位位点，也可以指基因组中很多 SNPs 的等位位点。 标签 SNP (htSNP) 研究表明,用少部分的遗传标记仍可保留单体型的大部分信 息。这就引出了如何选择单体型标签 SNP (haplotype tagSNP , htSNP)的问题一些 文献将 htSNP 定义为构建样本单体型或进行与相关分析所必须的一组遗传标记 (SNP）Patil 等将 htSNP 解释为能够分辨样本中至少 α%的单体型，且位点数目最 少的一组 SNPs。 TaqMan 探针法 是使用 5’端带有荧光物质(如： FAM 等)， 3’端带有淬灭物质,(如 TAMRA, MGB 等)的 TaqMan 探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的 不能发出荧光。 而当 TaqMan 探针分解后， 荧光物质受到 3’端的淬灭物质的制约， 5’端的荧光物质便会游离出来,发出荧光，当 PCR 反应液中加入荧光探针后，在 PCR 反应的退火过程中,荧光探针便会和模板杂交。进一步在 PCR 反应的延伸过 程中，Taq DNA 聚合酶的 5’→3’Exonuclease 活性可以分解与模板杂交的荧光探 针，游离荧光物质发出荧光，可以达到检测 PCR 产物扩增量的目的。12华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文GH-IGF-1 也就是生长激素/胰岛素样生长因子( GH-IGFs) 轴，是一个重要的人 体内分泌代谢轴。 生长激素( GH) 调节局部胰岛素样生长因子 1 ( IGF-1) 的产生, IGF-I 也可抑制垂体 GH 的释放， GH、IGF-1 相互作用,共同构成了一个紧密 联系的调节系统,调控着生长发育。近年来的研究表明，很多因素包括生长激素 受体(GHR)、瘦素(1ep-tin)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、泌乳素、甲状 腺素、表皮生长因子(EGF)以及对胰岛素的敏感性等，任何对下丘脑 GH-IGF-1 轴产生影响的因素均可影响人体的生长。在青春期前主要表现为体格发育的异 常，例如身材矮小、低体重、肥胖，成年后常表现为内分泌代谢疾病、高血压等。 一氧化氮合酶 催化 NO 合成的酶称为一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)， NOS 以 L-精氨酸和分子氧为底物，催化 L-精氨酸的两个等价胍基氮之一，经 5 电子氧化反应生成 NO 和 L-瓜氨酸，消耗 1.5 mol NADPH 和 2mol 分子氧。目 前已确知 NOS 的亚型有 3 种， 分别由不同基因编码， 按细胞/组织来源及表达方 式，分别为神经元型 NOS (neuronal, nNOS) 、诱导型 NOS (inducible, iNOS) 和 内皮型 NOS (endothelial, eNOS)。 位于血管内皮细胞上的 eNOS 是一个双区结构， C-端为还原酶区， 序列与细胞色素 P450 还原酶同源， 含有 NADPH、 FAD、 FMN 和 CaM 结合位点； N-端为氧化酶区，含有血红素、四氢叶酸(BH4 )、L-精氨酸 结合位点， 两个酶区彼此独立折叠和行使功能。 NO 合成过程中， 在 来自 NADPH 的电子通过还原酶区的黄素传给位于氧化酶区的血红素， 从而血红素上的铁结合 O2 催化 L-精氨酸生成 NO。与其它两种形式一致的是，eNOS 是个二聚体结构， 两个相同亚基组成的亚基二聚体化是 NOS 活性所必需的。13华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第二部分 研究框架与技术路线1 研究框架1.1 研究设计 疾病遗传易感性的分子流行病学研究：是利用生物化学、分子生物学、分子 遗传学等基础学科的相关技术和手段，在疾病发病机制方面开展基因多态性、基 因与环境交互作用等相关的研究。常见的研究设计方法有病例对照研究、病例病例研究和前瞻性队列研究。 在疾病遗传易感性我们多采用的是病例对照研究设 计方法。病例与对照的基本来源有两个：一个来源是医院的现患病人、医院门诊 的病案及出院记录，我们称为医院为基础的；另一个来源是社区、社区的监测资 料或普查、抽查的人群资料，称为以社区为基础的。病例的选择主要是确定判断 病人的标准和怎样获得这些符合判断标准的病人； 对照最好是全人群的的一个无 偏样本或是产生病例的人群中全体非患该病的人的一个随机样本， 而且是经过相 同诊断标准确认的不患所研究的疾病。对于样本量主要从以下几个方面考虑，研 究因素在对照人群中的暴露率，预期暴露于该研究因素造成的 OR，另外是检验 性水平 α 和希望达到的检验把握度 1-β。在估计样本量尤其在基因多态性与遗传 易感性方面的研究时要根据不同的配比方式采用不同的公式计算或从样本量中 查得，所估计的样本的样本含量并非绝对的数值，要根据所研究的条件考虑，也 并不是对照的个数越多越好，一般说来病例组和对照组样本含量相等时效率最 高，另外配比的因素也不要太多，否则会增加工作难度，很难获得实际需要的对 照。 本研究是采用 1：1 个体匹配的病例对照研究设计方案，从深圳市人民医院、 北京大学深圳医院收集经 CT 或 MRI 确诊的首发缺血性脑卒中患者做为病例组， 对照的选择是来自社区健康体检人群，以往没有脑卒中病史，按年龄、性别、民 族 1：1 进行匹配。这类研究设计对照的选择关键要体现对照来源于患者人群以 外的一个类似的非患病人群，与观察组的距离比较远，对照组的选择要体现可比 性原则、来源于同一总体，同时要合理考虑对照组的种类与数量。然后设计流行 病学调查表、进行流行病学调查和血液采集及相关生化指标和研究指标的检测。14华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文探讨基因多态性与缺血性脑卒中易感性的关系及关联的强度。 1.2 研究目标 1.2.1 明确 GH1、IGF-1R 和 eNOS 等基因多态性在缺血性脑卒中的主效应、基 因-环境交互效应，进一步揭示缺血性脑卒中发病的分子机制，为缺血性脑卒中 的早期预测、早期预防、早期诊断和早期治疗提供新的思路。 1.2.2 初步构建 GH1、IGF-1R、eNOS 等基因多态性、体力活动、吸烟、饮酒等 相关因素暴露作用的多因素模型， 并在此基础上初步构建缺血性脑卒中的发病风 险的预测模型， 为将来进一步进行缺血性脑卒中易感人群的筛检和预测预警模型 的建立和危险度的评估提供科学的依据。 1.3 研究内容 本研究主要内容如下： 1.3.1 GH1、IGF-1 基因多态性与缺血性脑卒中遗传易感性分子流行病学研究 1.3.1.1 采用病例对照的研究方法，研究 GH-IGF-1 轴家族基因中 GH1 及 IGF-1R 基因多态性在缺血性脑卒中发生中的作用 本研究采用 1：1 配比的病例对照的研究方法，调查相关环境因素、检测相 关生化指标，通过采用 TaqMan MGB 探针荧光定量 PCR 等技术对 GH-IGF-1 轴 基因家族中 GH1、IGF-1R 等基因多态性进行检测；运用多因素条件 Logistic 回 归分析基因多态性与缺血性脑卒中发病的主效应，计算其主效应的 OR 值；对 GH1、IGF-1R 基因构建单体型，找出影响缺血性脑卒中发病的核心单体型。 1.3.1.2 GH-IGF-1 轴家族基因-基因、基因多态性与吸烟、饮酒、体力活动等相关因素间的交互作用分析 1.3.2 内皮性一氧化氮合酶与缺血性脑卒中遗传易感性的分子流行病学研究 1.3.2.1 研究内皮性一氧化氮合酶(eNOS)基因多态性与缺血性脑卒中发生中的 作用。 通过采用 TaqMan MGB 探针荧光定量 PCR 等技术对 eNOS 基因多态性进行 检测；运用多因素条件 Logistic 回归分析 eNOS 基因多态性与缺血性脑卒中发病 的主效应，计算其主效应的 OR 值；对 eNOS 基因构建单体型，找出影响缺血性 脑卒中发病的核心单倍型。15华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文1.3.2.2 eNOS 基因-基因、基因多态性与吸烟、饮酒、体力活动等相关因素间的交 互作用分析。 对上述病例对照研究中的病例应用条件 logistic 回归分析进行基因-基因、基 因-饮食、行为等相关因素交互效应的分析，计算其交互效应的 COR 值，应用相 加模型分析 eNOS 基因多态性与环境暴露因素交互作用的大小。 1.3.3 初步构建缺血性脑卒中发病风险的预测模型 从基因-基因、基因-环境等角度，采用分类树统计分析方法构建缺血性脑卒 中的发病风险预测模型， 为缺血性脑卒中特异性干预措施的制定和预警系统的建 立提供科学的依据。2 技术路线2.1. 研究对象：本研究采用 1:1 配对病例-对照研究方法。研究对象来自 2003年 9 月至 2006 年 5 月期间就诊于深圳人民医院、北京大学深圳医院住院病人和 深圳市慢性病防治院的社区健康体检人群。所有研究对象均为在深圳市居住 5 年以上的户籍居民并愿意配合者， 考虑到现患或复发病例可带来存活偏倚及选择 偏倚，本研究的对象均为首发病例。 2.1.1. 病例的选择：病例选自深圳市人民医院和北京大学深圳医院研究期间的缺 血性脑卒中新发病例，共计 309 例。 2.1.2. 缺血性脑卒中的诊断标准所有病例均按中华神经科学会第四届全国脑血 管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点（1995） [27]作为诊断标准，由 》 两位有丰富临床经验的神经内科医师根据临床神经功能缺损表现和头部 CT、MRI 检查确诊。排除标准:排除瓣膜性心脏病、房颤、血液病、肿瘤、脑血管畸形或 动脉瘤、自身免疫性疾病等引起的继发性脑卒中患者。 2.1.3.对照的选择 对照来自研究期间社区健康体检人群，按年龄相差&5 岁、性别和民族相同，经病史询问、体检、心电图检查和其他血液生化检查无异常发 现，且以前无脑卒中病史的正常人。 2.2 样本含量的估计 根据 1：1 匹配的病例-对照研究样本量计算公式，同时考 虑到无对照病例研究样本量计算公式估计样本含量。16华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文2.3 资料收集 对所有的研究对象采用统一的调查问卷和询问方式，由调查员直 接询问符合要求的病例与对照（患者或其直系亲属）获得调查资料。调查员经过 严格训练，一致性达到满意程度，Kappa&0.75。 流行病学调查的资料包括：(1)一般人口学资料：姓名、年龄、性别、民族、 婚姻状况、职业、学历、居住条件等；(2)病史资料：现病史、既往病史（高血 压、糖尿病、心脏病、其他血管性疾病） 、有无服用雌激素和避孕药史（女性填 写） 、家族史(父亲、母亲、子女、兄弟姐妹、祖父母、外祖父母及其他亲属)等。 (3)生活方式资料：吸烟、饮酒、饮茶和体力活动和体育锻炼等；(4)体检资料： 身高，体重、臀围和腰围等。(5)实验室检查资料：白蛋白、球蛋白、总蛋白、 空腹血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白等。病例的发病资料来自同一报 病医院的病历记录。 2.4. 标本的收集 在知情同意的原则下， 采集患者及对照个体的血样。 由受检者 空腹 12-15 小时过夜，于次日晨 8 时抽取外周静脉血 5ml，分置于含有 2%乙二 胺四乙酸二钠（EDTA）100?l 的一次性试管中，共两管：一管置 1ml，用于 DNA 抽提；一管置 4ml，用于血浆和淋巴细胞分离，置于-80℃冰箱内长期保存。用 全自动生化分析仪等仪器检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白 (HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、空腹血糖(FBG)。 2.5. 变量的定义 糖尿病诊断按照 1999 年世界卫生组织（WHO）和国际糖尿病联盟的标准， 该诊断标准是：有糖尿病的相关临床症状，并且一天当中任意时候血糖浓度 ≥200mg/dl(11.10mmol/l) 或 者 空 腹 至 少 8 小 时 后 ， 血 糖 浓 度 ≥126 mg/dl(7.00mmol/l)，或者 OGTT 2 小时的血糖≥200 mg/dl(11.10mmol/l)。 高血压：按照 1999 年 WHO/ISH《高血压防治指南》 ，收缩压≥140mmHg 和/ 或舒张压≥90mmHg 和或正在服用降压药者。 肥胖：衡量整体肥胖的指标为体重指数(body mass index, BMI)。医学专家根 据国际肥胖症诊断标准，提出我国肥胖的诊断标准，即 BMI 值等于（以公斤为 BMI≥25kg/m2 单位） 除以身高 （以米为单位） 的平方， BMI≥23kg/m2 属于超重， 若 属于肥胖，但目前有关肥胖国际上尚无统一的标准。17华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文吸烟：采用 WHO（1984）关于吸烟调查方法的标准建议规定：根据 WHO 关 于吸烟情况调查方法标准化建议将吸烟分为： A.经常吸烟者： 每天吸烟一支以上， 持续一年以上；B.偶尔吸烟者：每周吸烟超过 4 次，但平均不到每天一支；C. 从未吸烟者。本调查中“吸烟者”只包括经常吸烟者，不包括偶尔吸烟者。WHO 定义：被动吸烟是指不吸烟者，一周中有一天以上吸入吸烟者呼出的烟雾长于 15 分钟/天。 2.6. 质量控制 为了保证研究的质量， 尽可能的控制偏倚， 本研究采用了以下质量控制措施： 1、调查表的设计：在正式开展调查之前咨询专家意见，进行调查方案的设计、 论证、做好预调查，对调查表进行修订和完善。2、调查人员培训：流行学调查 研究中，原始资料的准确性是关系到成败的一个核心环节，它取决于调查员的调 查质量。本研究按统一的培训计划、培训内容对调查人员进行培训。让调查员不 但熟悉调查内容，而且掌握调查方法及调查技巧。3、加强核查：于调查当日对 资料进行复核，统一编号病做相应记录，对调查表中的漏填项目尽可能补查或予 以剔除。4、调查表采取人工过录、录入员双录的办法输入计算机，并在录入程 序中设置质量控制字段，对于双录入不一致的数据，对照原始数据进行核对。 2.7. 基因组 DNA 和 RNA 的抽提 2.7.1 基因组 DNA 提取的过程：采用 Axygen 公司的 AxyPrep 血基因组 DNA 小量提取试剂盒提取 DNA，具体试剂盒的组成、提取注意事项及步骤如下： 试剂盒组成、贮存、稳定性：1、耗材：DNA 制备管，2ml 离心管，1.5 ml 离心管。2、Buffer AP1:细胞裂解液，室温密闭贮存；Buffer AP2:蛋白沉淀液， 室温密闭贮存； Buffer W1A concentrate:洗涤液。 使用前， 根据瓶上数量加入乙醇， 混合均匀，室温密闭贮存；Buffer W2 concentrate：去盐液，使用前，根据瓶上 数量加入乙醇，混合均匀，室温密闭贮存，可用 100%或 95%的乙醇。Buffer TE:5mM Tris-HCL，0.1mM EDTA，PH 8.5。 实验准备： 第一次使用时， 1、 Buffer W2 concentrate 和 Buffer W1A concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。2、准备无核酸和核酸酶污染的 TIP 头、 离心管。18华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文操作步骤：1、加 500μl Buffer AP1 到 1.5ml 的离心管中。 2、加 250μl 抗凝全血到 Buffer AP1 中，用移液器来回地回吸注几次，以彻 底溶解残留在吸头上的血液。盖紧离心官盖子，涡旋振荡 10s。 （必须充分混合 或涡旋振荡以确保完全释放基因组 DNA，若从凝固的血或干血粉中提取基因组 DNA， 在研钵中收集凝固的血或干血粉， 加入 200μl 含 20 mM Tris, 10mM EDTA, 的缓冲液，快速研磨 30s。加入 500μl Buffer AP1，研磨充分后收集溶解产物到 1.5ml 的离心管中，50℃加热 1 分钟。旋涡振荡溶解可能存在的血块，在沐浴中 冷却后进入步骤 3 的操作） 3、加入 100μl Buffer AP2，涡旋振荡 10s。 4、12000×g 离心 10 分钟。 5、 将制备管置于 2ml 离心管中， 将步骤 4 中的滤液加入到制备管中， 12000×g 离心 1 分钟。 （如在制备管中仍残留溶液，适当升高离心速度，再离心一次，使 得所有的溶液过滤到 2ml 离心管中） 6、弃滤液，将制备管放回到原 2ml 离心管中，加入 700μl Buffer W1A，室 温放置 2 分钟，12000×g 离心 30s。 （确认在 Buffer W1A concentrate 中已按试剂 瓶上指定的体积加入无水乙醇；如在制备管中仍残留溶液，适当升高离心速度， 再离心一次，使所有的溶液过滤到 2ml 离心管中） 7、弃滤液，将制备管放回到原 2ml 离心管中，加入 800μl 已加无水乙醇的 Buffer W2，12000×g 离心 1 分钟。 （确认在 Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶 上指定的体积加入无水乙醇） 8、 （可选方案）将制备管置回到原 2ml 离心管中，加入 5000μl 已加无水乙 醇的 Buffer W2 到制备管中，1200×g 离心 1 分钟。 9、将弃滤液，将制备管放回到原 2ml 离心管中，1200×g 离心 1 分钟。 10、将制备管置于另一洁净的 1.5ml 的离心管中，在 silica 膜中央加入 80-200μl Buffer TE, 室温静置 1 分钟。1200×g 离心 1 分钟洗脱 DNA。 （将 Buffer TE 预热到 65℃有利于提高 DNA 的洗脱效率。 ） 注意事项：为了保持基因组 DNA 的性能的完整性以及 PCR 扩增的特异性， 纯化的 DNA 应用含有 0.1 mM EDTA 的低盐浓度的 Tris 缓冲液洗脱和贮存。 2.7.2 DNA 模板纯度和浓度测定19华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文用两种方法测定 DNA 模板纯度和浓度 琼脂糖凝胶电泳： 1、称取 0.2g 琼脂糖，加入 20mlTBE 缓冲液中，在微波炉加热 1 分钟使之 熔化，冷却至 55℃左右，在凝胶和电泳缓冲液中加入 1.5μlGold ViewDNA 荧光 染料，混匀，倒入已装好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，制成 1%的琼脂糖凝 胶。 2、待胶凝固后，拔出梳子，将制胶平台放入加有足够的 TBE 缓冲液的电泳 槽中，缓冲液高出凝胶表面约 1mm。 3、取 5μl DNA 与 1μl 上样缓冲液 （10×loading buffer）混合后用移液枪将 样品加入点样孔中，同时在另一个点样孔中加入 6μl DNA 标准分子量 Marker 作 为对照，100V 电泳 30min。 4、取出凝胶，在凝胶成像系统上观察结果，可粗略估计 DNA 的浓度与质 量。 紫外分光光度计检测 取 1μldH2O 溶解的 DNA 原液， dH2O 稀释至 100μl， 加 混匀后紫外分光光度 仪检测，可直接读出 DNA 模板的纯度和浓度。OD 值（260nm/280nm）在 1.8-2.0 之间，认为 DNA 纯度合格，可用于后续的 PCR 实验。 2.7.3 RNA 的抽提 试剂准备：Trizol reagent BD, 氯仿，异丙醇，75%乙醇（DEPC H2O 配置） ， 冰醋酸（5mol/l）和 DEPC H2O。 操作步骤：1、取 0.3ml 全血置于 1.5ml 离心管中，加入 0.75ml Trizol reagent BD 及 20μl 冰醋酸充分混匀，室温静置 5 分钟。 2、加入 0.2ml 氯仿，剧烈上下混匀 15 秒，室温静置 3 分钟，4℃ 12000 rpm 离心 15 分钟，溶液分为 3 层，上层水相为 RNA，中层为 DNA，下层为蛋白质， 取上清。 3、 加入 0.5ml 异丙醇， 将管中液体轻轻混匀， 室温静置 5-10 分钟， 12000 4℃ rpm 离心 10 分钟，沉淀。 4、弃上清液，加预冷却的 75%乙醇 1ml，4℃ 9000 rpm 离心 5 分钟，弃上 清，用枪头去上清，重复冲洗一次，再离心。20华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文5、室温放置风干 3-5 分钟，不可过干，加 20μl DEPC H2O 于管中，用中指 弹几下加速 RNA 溶解（65℃促溶 10-15 分钟） ，分两管备用，放在-80℃冰箱保 存。 注意事项：1.样品量和 Trizol 的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随 意增加样品量或减少 Trizol 量， 否则会使内源性 RNase 的抑制不完全， 导致 RNA 降解。 2.实验过程必须严格防止 RNsae 的污染。 2.7.4 RNA 模板纯度和浓度测定 用两种方法测定 DNA 模板纯度和浓度 紫外分光光度计检测 取 1 uldH2O 溶解的 RNA 原液，加 dH2O 稀释至 100μl，混匀后紫外分光光 度仪检测， 可直接读出 RNA 模板的纯度和浓度。 值 OD （260nm/280nm） 1.8-2.0 在 之间，认为 RNA 纯度合格，可用于后续的 PCR 实验。若比值较低，说明有残余 蛋白质存在；比值太高，则提示 RNA 有降解。 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 质量： 1、用 DEPC H2O 处理要用的电泳池，放在 3%过氧化氢的水中处理 15 分钟 后用清水冲洗干净。 2、配置 0.5%×MOPS 液：取 50ml 5×MOPS 液，然后加入 450 mldH2O 后混 匀后待用。 3、称取 0.9g 琼脂糖，加入 50ml0.5%×MOPS 缓冲液中，在微波炉加热 1 分 钟使之熔化，冷却至 55℃左右，在凝胶和电泳缓冲液中加入 3.0ulGold View 荧 光染料，混匀，倒入已装好的凝胶灌制平台上，插上样品梳，制成 2.0%的琼脂 糖凝胶。 4、待胶凝固后，拔出梳子，将制胶平台放入加有足够的新配置的 TBE 缓冲 液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面约 1mm。 5、取 8ul RNA 与 1μl 上样缓冲液 （10×loading buffer）混合后用移液枪将 样品加入点样孔中，同时在另一个点样孔中加入 8μl RNA 标准分子量 Marker 作 为对照，150V 电泳 10-15 分钟。 6、取出凝胶，在凝胶成像系统上观察结果，可粗略估计 RNA 的浓度与质21华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文量。 2.7.5 RNA 逆转录 cDNA 采用大连宝生物公司 PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real Time)试剂 盒，该试剂盒是大连宝生物公司推荐的 Real TimeRT-PCR 用的最佳反转录反应 试剂， 它使用具有较强延伸能力 PrimeScript RTase 可以在较短时间内高效合成的 Real Time PCR 用的 cDNA。 该试剂盒的主要内容为： 10μl 反应×200 次量 5×PrimeScriptTM Buffer (for real time)1 PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer (50μM) Random 6 mers (100μM) RNase Free dH2O Easy Dilution (for Real Time PCR)2 1.含有 dNTP Mixture 和 Mg2+ 具体操作步骤如下： 1、20μl 反应体系按下列组份配置 RT 反应液（反应体系在冰上配制） 5×PrimeScriptTM Buffer (for real time) PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer (50μM)*1 Random 6 mers (100μM)*1 RNase Free dH2O Total RNA 4μl 1μl 1μl 1μl 11μl 500-1000ng (大约 2μl)*2 400μl 100μl 100μl 100μl 1ml 1ml*1 Oligo dT Primer 和 Random 6 mers 同时使用时，可有效地将全长 mRNA 反转 录成 cDNA。 *2 反应体系可以按需求相应扩大，20μl 反应体系最大使用 1000 ng Total RNA。 2、反转录反应如下条件 37℃ 15 分钟（反转录反应） ，85℃ 5 秒 （反转录酶的失活反应）22华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文2.8. 统计分析策略 1. 全部流行病学调查资料及实验室资料应用 Epidata3.0 输入并建立数据库，统 计学检验均假设病例与对照都是来自源人群的随机独立样本， 且双尾检验 P&0.05 被认为有统计学意义。各组间频率比较用 χ2 检验，计量资料用 x ± s 表示，不同 组间的计量资料的比较采用 t 检验或单因素方差分析。 2. Logistic 回归 Logistic 回归是分析危险因素的常用工具。 Logistic 回归允许进行多因素分析 以评价病例和对照中分布不同的因素引起的混杂， 并且对效应修饰或统计交互作 用进行估计。当各分层样本数不是很大(但格子频数大于 5)时，条件 Logistic 回 归是理想的。 回归方程的比数比 OR 可解释为具有某属性或暴露者与无此属性或 非暴露者相比缺血性脑卒中发病的相对危险度。 如果回归系数的 P&0.05 或 OR 值 的 95%可信区间不包含无效假设值 1，就可认为关联是有统计学意义的。本研究 采用多因素条件 Logistic 回归分析方法，分析多态性基因型及单体型与缺血性脑 卒中发病的相关性及关联的强度，探讨基因多态性与缺血性脑卒中发生的主效 应。并进一步采用相加模型，探讨基因-基因、基因-环境因素的交互效应。 3.Hardy-Weinberg 平衡 Hardy-Weinberg 平衡(HWE)群体遗传学中的一个基本法则，1908 年由英国 数学家 Hardy 和德国医生 Weinberg 同时提出，是以随机分配条件下的群体或家 系为特征， 描述了进化演变或发生新的突变后基因型频率和等位基因频率之间的 函数关系趋势。处于平衡时，对于某―等位基因频率为 p，另一等位基因频率为 q(p+q=1)的野生型两等位基因多态性，用二项式 p2 计算野生型纯合子基因型频 率，2pq 计算杂合子，q2 计算另一种纯合子。背离 HWE 提示由于移民、新近突 变、近亲交配、选择或遗传漂移等原因，单个基因座上的等位基因是相互关联或 非独立的。 4.基因型分析 根据等位基因暴露水平(0, 1 或 2)汇总的基因分型数据来检验某一给定基 因座上等位基因数目与缺血性脑卒中发病风险之间的趋势或剂量效应关系， 有时 也称为基因相加作用。以野生型纯合子作为参照组，用 Logistic 回归模型计算杂23华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文合型及另一纯合型的 ORs 值。 5.交互作用的估计 交互作用：简单地说，交互作用指当两个因素都同时存在时，它们的作用大 于（协同）或小于（拮抗）各自作用的和。交互作用目前有两种模型：相加模型 和相乘模型。下面以缺血性脑卒中发病率为例，分析吸烟与饮酒对缺血性脑卒中 发病率的影响的两种情况。 I. 相加模型：不饮酒 不吸烟 吸烟 II.相乘模型 不饮酒 不吸烟 吸烟 I0 I0*S I0 I0+Is饮酒 I0+Ia I0+Ia+Is+Isa饮酒 I0*A I0*S*A*B相加模型检验 Isa 是否为零，相乘模型检验 B 是否等于零，可以想象 Isa 等 于零时，B 不一定等于 1，因此会出现按不同的模型检验的出的结论不同。究竟 该用相加模型还是相乘模型呢？这属于病因学理论研究上的问题， 所以在做交互 作用研究的过程中，必须清楚所得出的结论是采用什么模型。一般的线性回归的 回归系数直接放映因变量的变化，是相加模型，而 logistic 回归的系数反映比值 比的变化属于相乘模型。 6.单体型构建 单体型是指同一条染色体上紧密相连的一些位点或基因的组合，不同位点间排列距离越近，在减数分裂时发生重组的可能性就越小，以同一单倍 体型整体传递给子代的可能性就越大。 单体型分析可以帮助研究者进一步验证在 连锁分析中所取得的数据，排除假阳性。通过多个位点的单体型排列，还可以使 得某些多态性不够充分的单个位点的信息得以应用。 本研究单体型构建采用 PHASE2.0 软件，采用 EM（最大期望法）算法估计 所研究的人群（病例组和对照组）的单体型及其频率。然后采用 χ2 检验检验两24华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文组估计的单体型频率差异得出 P 值， 但该 P 值不宜作为两组比较的 χ2 检验 P 值； 然后采用置换法，随即分配每个研究对象是病例还是对照，用假定的病例对照数 据重复上述的单体型的构建及两组单体型频率的 χ2 检验，得出 P 值；进而重复 置换 1000 次，得出 1000 个 P 值。这个 P 值表示如果病例组与对照组的单体型 无差异，则观察到两样本的单体型频率差异如此大或更大的频率。 7、分类树：它是由 Brieman, Friedman, Olshen 和 Stone 1984 年提出的，如果一 个人必须去选择在很大范围的情形下性能都好的、 同时不需要应用开发者付出很 多的努力并且易于被终端用户理解的分类技术的话， 那么分类树分析方法具有很 强的竞争力。目前多采用诸如传统的多元线性回归，Logistic 回归、Cox 回归模 型等，但以上这些模型的一个共同缺陷是不能有效克服变量之间的共线性的问 题，因而所得的分析结果有时难以解释的现象，分类树与回归树 (Classification and Regression Trees, CART)分析方法的问世， 较好的解决了多变量分析数据之间 共线性问题。本研究采用分类树分析方法，探索缺血性脑卒中的主要危险因素及 构建缺血性脑卒中发病风险的预测模型。 2.9. 本研究的技术难点 1.标准统一及质量控制问题 高质量的病例－对照设计是疾病关联研究成功的核心环节。 对于脑卒中这样 的异质性很强的疾病，严格的“疾病”和“对照”定义标准、标准的统一、检测 指标的标准化及质量控制等都是至关重要的。 本研究在研究设计中充分考虑这些 因素，拟通过课题组统一培训等手段来做到标准统一和质量监控。 2. SNP 基因分型技术平台的建立 本研究采用 Taqman 荧光定量 PCR 技术建立准确、快速、灵敏度高、高通量 的 SNP 基因分型技术平台，其中关键是引物和双标记探针的设计。 3. 多个基因－基因以及基因－环境因素的交互作用分析 在复杂疾病发生过程中，基因-基因、基因-环境之间存在复杂的非线性交互 作用，具有多样性和不确定性，很难用预设的模型去拟合，本研究将根据所获取 的资料选取适当的数据分析方法，以期对这些复杂关系做出正确的分析。3.本研究的创新性和局限性25华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3.1.创新性 (1)本研究在国内首先探讨 GH1-IGF-1 轴中 GH1 基因 T1663A 和 IGF-1R 基 因 G→A(rs2229765)和 A→G(rs951715)基因多态性与缺血性脑卒中易感性关系。 (2)在资料的分析过程中应用分类树分析方法初步构建缺血性脑卒中发病风 险的预测模型，并对其在缺血性脑卒中发病风险预测中的应用进行了系统地评 价，这也是本研究的特色和创新处。 (3)从基因-基因、 基因-环境、 单体型的角度探讨 eNOS 基因 T-786C、 A-922G 及 G894T 多态性与缺血性脑卒中的关系。 3.2.局限性 本研究的候选基因数目和突变位点有限， 不能排除其它微效基因之间的相互 作用；还可能存在许多其他危险因素的联合作用，未列出的基因-环境之间的交 互作用，在本次研究中并未发现，但不能排除他们之间有交互作用的可能性，随 着样本量的扩大以及交互作用统计分析方法的日趋完善， 对交互作用的研究将更 加深入和全面。4.后续深入研究方向首先，要探讨与验证 SNPs 与缺血性脑卒中发病的关系必须进一步研究多态 性对基因表达功能的影响，如采用荧光素酶报告基因检测、染色质免疫沉淀等方 法研究 SNPs 对基因表达调控的影响。 其次，除了扩大样本量，还必须扩大样本的地域代表性。纳入本次研究的样 本主要是中国南方汉族人群，而北方人群在生活、饮食及气候等因素方面与南方 不同，因此有必要把北方缺血性脑卒中病例纳入研究，只有这样才能真正揭示中 国汉族人群基因多态性与缺血性脑卒中遗传易感性的关系。 此外，目前缺血性脑卒中的发病风险预测主要是依据临床症状、CT 或 MRI 检查和血清学检查，这种预测方法主要是针对晚期防御而非早期预测与预警，只 有从缺血性脑卒中的易感基因入手， 将患者的特异性分子遗传信息与临床表现相 结合，才有可能达到早期诊断和个体治疗的目的，才有可能使得缺血性脑卒中的 防线大大前移。 最后，对于关联研究结果的评价和验证需要综合 SNPs 所在序列信息、进化26华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文保守性的有无、人群遗传学、实验室功能学证据、暴露评价（如基因型-环境交 互作用研究）和流行病学证据，这也是今后在探讨 SNPs 与缺血性脑卒中遗传易 感性关系中的重要研究方向。27华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文第三部分 缺血性脑卒中影响因素的病例对照研究 1 前言急性脑血管病是一组以脑部缺血及出血性损伤症状为主要临床表现的疾病, 又称脑卒中或脑血管意外,具有极高的病死率和致残率,主要分为出血性脑卒中 (脑出血或蛛网膜下腔出血) 和缺血性脑卒中(脑梗死、脑血栓形成) 两大类,以 脑梗死最为常见。脑卒中发病急，病死率高,为发达国家前三位死因之一[1]。据 WHO 近期公布的全球最大的心血管病 10 年协作研究结果表明，中国脑卒中的 发病率为 250/10 万，仅次于前西伯利亚地区（300/10 万） ，居世界第 2 位，且每 年约有 100 万人死于脑卒中，75%的病人有不同程度的后遗症。由此可见脑卒中 是严重危害我国人群健康的主要公共卫生问题之一。 为了有效地预防和控制脑卒 中的发生，必须进一步阐明脑卒中的发病危险因素，以期为积极有效地开展脑卒 中的防治工作提供科学的依据， 同时为进一步探讨环境与基因之间可能存在的交 互作用奠定基础。2 材料与方法2.1 资料收集方法 本研究采用自行设计的流行病学调查表， 对全部研究对象采用统一的调查问 卷和询问方式，由研究组成员及经过培训的调查人员共同完成。 2.2 主要变量定义和编码 在资料的统计学处理中，对是否罹患缺血性脑卒中，以及文化程度、职业、 收入、体质指数、腰臀比、吸烟、饮酒、病史、家族史、体力活动等调查表项目 和血液生化指标等主要变量进行了定义及编码，见表 3-1。 2.3 统计分析 本研究共调查 618 人，病例组和对照组各 309 人，经审核后全部有效，采用 Epidata 3.0 录入数据库，进行双机录入。本部分组间均数比较用 t 检验，组间率 比较用 χ2 检验，计算 OR 值及其 95%的可信区间。由于 SPSS 没有专门的 1:1 配 对的 Logistic 回归模块，我们采用生存分析中的 Cox 模型进行分模拟。28华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3 结果表 3-1变量 是否患缺血性脑卒中 年龄 定义编码 病例=1； 对照=0 连续变量 年龄=调查表日期-出生日期 分类变量 &45=1; 45～54=2; 55～64=3；65～74=4；&74=5 文化程度 月收入（人民币） 居住条件 体质指数 初中及以下=1； 高中、中专=2 ；大学、大专及以上=3 &4000=0； ≥4000=1 不好=1； 一般=2； 好=3 BMI=体重（kg）/身高（m2) 分类变量 腰臀比 &25=0； ≥25=1主要变量定义及编码WHR=腰围（cm）/臀围（cm） 分类变量：男性≤0.9=0 ；&0.9=1 女性≤0.8=0 ； &0.8=1吸烟 饮酒 饮茶 体力活动 不良气候条件 打鼾 生活负性事件 收入导致的压力程度 日常生活自主程度 高血压 糖尿病 心脏病 其他血管病 父亲高血压史 父亲糖尿病史 母亲高血压史 母亲糖尿病史 甘油三酯（mmol/L）否=1； 否=0； 否=0；已戒烟=2； 是=3 是=1 是=1 轻、中度=1不太活动=0； 无=0； 否=0； 无=0； 有=1 是=1 有=1轻微或无=0； 无=1； 否=0； 否=0； 否=0；中等或严重=1 高=3中等=2； 是=1 是=1 是=1否=0； 是=1 否=0； 否=0； 否=0； 否=0； 连续变量 分类变量 是=1 是=1 是=1 是=1 实验室检测值 ≤1.70=0； &1.70=1 实验室检测值 ≤5.72=0； &5.72=1 ≤6.10=0； &6.10=1 实验室检测值 &1.04=1; ≤1.04=029胆固醇（mmol/L）连续变量 分类变量空腹血糖(mmol/L) HDL-C (mmol/L)数值变量 连续变量华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文3.1 研究对象基线资料比较 本研究对象均为中国汉族人。 纳入本次研究每组的男性 190 例 （占 61.49%） ， 女性 119 例（占 38.51%） ，男女之比为 1.60:1。病例平均年龄为 61.34 ±0.584 岁， 对照平均年龄为 61.03±0.582 岁，两组差异无统计学意义(t=0.15，P=0.706)。缺 血性脑卒中高发年龄段为 55~64 和 65~74 岁，分别占全部病例的 35.24%和 36.08%(见表 3-2)。 3.2 缺血性脑卒中的影响因素分析 3.2.1 单因素条件 Logistic 回归分析 单因素条件 Logistic 回归分析可以粗略估计单个危险因素与缺血性脑卒中的 关联强度。 单因素比数比 OR&1 表明该因素为缺血性脑卒中的保护因素， OR&1 则 为危险因素。 3.2.2 研究对象的一般人口学特征 表 3-2 显示，月收入和居住条件在病例组与对照组中分布没有差异，P 值分 别为 0.550、0.188 和 0.238。病例组中文化水平偏低者比对照多，文化水平高是 缺血性脑卒中发病的保护因素，以初中及以下文化水平作为参照，大专及以上者 缺血性脑卒中发病风险显著降低，OR 值为 0.20（95%CI：0.09~0.42） ，P&0.01。 按体质指数 BMI≥25 为标准分析，43.00%的病例体重超常，而对照中超重者占 29.80%。与体重正常者相比，超重者缺血性脑卒中的发病风险增加 54.00% (OR=1.54；95%CI: 1.10~2.15)。腰臀比 WHR&0.9(男性)或 0.85(女性)的向心性肥 胖者在病例和对照中分别占 76.10%和 57.00%，向心性肥胖者罹患缺血性脑卒中 的风险是正常者的 2.4 倍(OR=2.40；95%CI: 1.70~3.39)。 3.2.3 环境行为心理特征 表 3-3 显示的是缺血性脑卒中传统危险因素中一些环境行为心理因素在病例 与对照两组中分布差异的比较。与前瞻性研究结果一致，同对照相比病例较多吸 烟和较少体力活动。饮茶和日常生活自主程度高多见于对照，而生活负性事件和 因收入问题导致的压力大在病例中所占的比重较大。 其它因素如日常生活自主活 动等在两组中的分布差异无显著性。30华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 3-2 研究对象一般人口学特征 特征变量 性别 男 女 年龄 &45=1 45～54=2 55～64=3 65～74=4 &74=5 学历 大专及以上 高中、中专 初中及以下* 月收入 ≥* 居住条件 好 一般 不好* 体质指数 ≥25 &25* 腰臀比 男性&0.9，女性&0.85 男性≤0.9，女性≤0.85 30 34 109 112 24 61 133 115 51 258 93 197 19 122 187 235 74 30 34 109 112 24 152 115 42 43 266 104 197 8 92 217 176 133 0.20（0.09~0.42） 0.48（0.24~0.98） 0.000 0.044 190 119 190 119 病例组 n 对照组 OR(95%CI)Pn1.27（0.58~ 2.80）0.5500.38（0.09~1.60） 0.44（0.11~1.71）0.188 0.2381.54（1.10~ 2.15）0.0112.40（1.70~3.39）0.000注：*为各相关变量的参比对照3.2.4 既往史及家族史特征 相比对照，病例较多高血压史及糖尿病史（见表 3-4） ，与缺血性脑卒中关联 的强度分别为 OR=5.26（95%CI: 3.49~7.94）和 OR=1.73（95%CI: 1.18~2.54） 。心 脏病史在病例与对照间差异无显著性。 家族史中父亲有糖尿病者或母亲有糖尿病31华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文表 3-3 研究对象环境行为心理学特征 病例组 对照组 OR 95% CI n (%) n (%) 88(28.50) 221(71.50) 78(25.24) 231(74.76) 74(23.95) 235(76.05) 91(29.45) 218(70.55) 186(60.19) 123(39.81) 102(42.39) 207(57.61) 189(61.17) 120(38.83) 35(11.33) 229(74.11) 45(14.56) 53(17.15) 256(82.85) 37(11.97) 272(88.03) 38(12.30) 271(87.70) 52(16.83) 257(83.17) 175(56.63) 134(43.37) 246(79.61) 63(20.39) 130(42.07) 179(57.93) 40(21.68) 269(78.32) 75(24.27) 234(75.73) 101(32.69) 168(54.37) 40(12.94) 14(4.53) 295(95.47) 22(7.12) 287(92.88) 1.85（1.06~3.25） 0.029 1.72（1.34~2.21） 0.000 0.31（0.11~0.86） 1.22（0.52~2.87） 0.025 0.651 4.