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晶体生长方法
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晶体生长方法综述
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&&晶​体​生​长​是​一​门​重​要​的​材​料​科​学​技​术​。​本​文​档​详​细​介​绍​了​溶​液​生​长​、​熔​体​生​长​、​气​相​生​长​、​固​相​生​长​四​种​晶​体​生​长​方​法​!
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2015年执业药师继续教育答案(试题全)要点.doc206页
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1《抗菌药物临床应用管理办法》规定，医疗机构遴选和新引进抗菌药物品种，经药学部门提出意见后，由抗菌药物管理工作组审议，应当提交申请报告的科室是（?? ）
A.药剂部门B.临床药学部门 C.药品供应部门D.药学部门
正确答案：D
2《抗菌药物临床应用管理办法》规定几级以上医院应当设置感染性疾病科，配备感染性疾病专业医师 。
A.一级 B.二级C.三级D.诊所
正确答案：B
3《抗菌药物临床应用管理办法》规定，医疗机构应当对出现抗菌药物超常处方（?? ）以上且无正当理由的医师提出警告，限制其特殊使用级和限制使用级抗菌药物处方权。
A.2次B.4次C.5次D.3次
正确答案：D
4根据《抗菌药物临床应用管理办法》，有关抗菌药物的分级使用和越级使用，说法错误的是 。
A.因抢救生命垂危的患者等紧急情况，医师可以越级使用抗菌药物B.应当于48小时内补办越级使用抗菌药物的必要手续C.越级使用抗菌药物应当详细记录用药指证D.特殊使用级抗菌药物不得在门诊使用
正确答案：B
5某患者右半身痛温觉消失，考虑受损的传导束是 （ ）
A.左侧脊髓丘脑束B.右侧脊髓丘脑束C.左侧薄束和楔D.右侧薄束和楔束
正确答案：A
6人体最大、最复杂的关节是 （?? ）
A.肩关节B.肘关节C.膝关节D.腕关节
正确答案：C
7支配上臂肌前群的神经是 （??? ）
A.肌皮神经B.正中神经C.桡神经D.腋神经
正确答案：A
8肾的正确叙述是 A.右肾较左肾略高B.从腹前壁可触及肾外形C.肾皮质含有肾小体和肾小管D.肾髓质主要由肾柱构成
正确答案：C
9?个体化治疗中最重要的依据是（??? ）
A.生物利用度 B.表观分布容积C.药物半衰期D.治疗药物监测
正确答案：D
10?循证医学应用的统计学方法是（??? ）
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材料化学-晶体生长技术
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专利名称交联蛋白纳米晶体、交联蛋白纳米聚集体及其制备方法
技术领域本发明涉及交联蛋白纳米颗粒，以及生产交联蛋白纳米颗粒的纳米化方法。
背景技术基于蛋白的应用，主要但非必要地限制于酶、抗体、受体、激素和结构蛋白的使用， 其很好地建立在生物技术、生物医学、制药业、生物材料和化妆品产业中。通过交联蛋白晶体和聚集体的使用，至少部分地解决了涉及单个蛋白质应用的一些普遍性问题，例如半衰期短、稳定性差、可恢复性差、使用范围窄、成本高、水解不稳定以及生物利用度差。包括微米或更大尺寸的颗粒的所述晶体和聚集体提供了结构和化学上耐用的、寿命长的材料，其避免了单个蛋白质共有的许多限制，并且因此改善了一些主要的问题。尽管如此，所述材料的微米和更大的尺寸引入了单个蛋白质非原有的多种问题，例如传质限制，减少的接近催化中心的机会，由交联产生的受限的催化剂转换和差的生物吸收率。在一些情况中，尽管所述制备是可重复的，但是成本也很高。存在着持续的推动力以通过实施纳米技术来优化蛋白质产品的生物活性、稳定性、保存期限、使用范围以及生物利用度。作为在这里统称为蛋白质纳米颗粒(即在每个维度中的截面长度小于1微米的蛋白质材料)，至今被报导的少数例子包括蛋白质纳米聚集体(即包括二聚体和甚至更高联合体的非晶体蛋白质纳米簇)和蛋白质纳米晶体(即结晶的蛋白质纳米颗粒)。制备和使用尤其是交联类型的新颖的纳米尺寸的蛋白质聚集体和晶体仍处于学习阶段，成功的例子很少。由于基于蛋白质的产品的有限的利用率、范围和生产的限制，存在着能获得诸如新颖交联蛋白纳米颗粒的材料的需求。类似的，也存在对建立方便的制备方法的需求，以便能更好地利用所述交联蛋白纳米颗粒，从而大体上解决工业和医学上的许多当前问题。令人遗憾的是，新型交联蛋白纳米颗粒的发展和制备被一些技术问题所减缓，对于这些技术问题缺乏通用的和易实现的解决方案。显著存在于纳米级材料中的物理化学特征、例如固有的高表面能和反应性是引起这些难点的一项因素。在已建立的基于蛋白质的产品之中， 只有自下而上的策略已被用来制备交联蛋白纳米颗粒，其中将单个天然态蛋白质集合在一起，形成更大的联合体。相比而言，没有报导过通过在较大的交联蛋白材料上采用物理尺寸缩减方法(即自上而下的途径)来制备交联蛋白纳米颗粒的途径。实际上，纳米化(即较大材料的尺寸缩减至纳米级)或纳米碎裂(即较大材料碎裂至产生纳米尺寸的碎片或者“纳米碎片”)在交联蛋白上仍有待检验。普遍声称蛋白质容易被“非自然的”过程条件损害的看法是一项阻碍对尺寸缩减的优点的早期评估的因素。此外，已经知道使软材料(意指基于蛋白质的材料)碎裂的行为因颗粒的尺寸变小而变得愈加困难。这种普遍的观念很可能充当了另一个阻碍因素。在本发明中，制备交联蛋白纳米颗粒的挑战是通过对交联的微米或更大尺寸的蛋白质材料(以下称为前体材料)施加物理尺寸缩减方法来解决。此方法能产生出尺寸可控的、耐用的基于蛋白质的纳米颗粒材料。同样地，所述方法避免了涉及从溶液中的单个蛋白质直接制备交联蛋白联合体的已确定的或似然性的技术问题。所生成的交联蛋白是所述前体材料的纳米碎片或者纳米碎裂产品，其形成纳米级交联蛋白产品的全新种类，在此称为交联蛋纳米颗粒(即在每个维度中的截面长度小于1微米的交联蛋白纳米晶体和交联蛋白纳米聚集体)可能会被无心地误认为是所报导的相当产品(即依据相似的技术，例如为蛋白质纳米颗粒)的现有技术例子实际上描述了交联蛋白产品的另一种类。这些产品是从单个的、天然的蛋白质(即非交联的前体)中制备的，其明显指的是相比于本发明的不同来源的前体。再者，本发明的产品是交联的和相对更大的结构的纳米碎片。本发明的所述交联纳米颗粒显示出高的生物利用度，这是因为其能通过医疗从业者熟知的多种常规方式容易地进入细胞内，并且相比于单个蛋白质其在体内的寿命更长。此外，因其有显著的水解稳定性，这些纳米颗粒是可摄取的，并因此它们为吸收进入体内提供了新的渠道，例如通过 GALT (肠相关淋巴组织)系统。所述纳米颗粒由于它们有利的表面和扩散/传质特性而显示出高的生物活性，以及本领域技术人员所知的因交联作用产生的改进的操作稳定性。交联蛋白纳米颗粒的前体材料可从商业上获得。备选的是，制备所述交联蛋白纳米颗粒的前体的方法对于本领域技术人员是可获得的。所述前体材料由两个步骤制备。首先，在目标蛋白质上实施合适的溶剂/抗溶剂沉淀或冻干方法，形成微米或更大尺寸的蛋白质聚集体，或者实施结晶化方法，形成微米或更大尺寸的蛋白质晶体；随后，实施任何常规的化学交联方法(即化学试剂引发、化学反应交联剂引发和/或酶引发)或去水热交联方法(即热引发缩合)，形成共价交联蛋白材料(即本发明的前体材料)。为制备交联纳米颗粒产品，所述前体的尺寸被物理性缩减，直接产生相应的交联蛋白纳米聚集体或纳米晶体，并且避免了典型地和已建立的自下而上方法联系在一起的任何问题。因此，本发明提供了一种共价交联的蛋白纳米颗粒，其大小为10-999nm且优选为 50-200nm，其适用于生物技术、化妆品、制药和生物医学的应用，其特征在于，所述纳米颗粒包含一种或多种蛋白质和至少一种零或更大长度的蛋白质间交联，并作为在每个维度中的最小长度为1微米、成分相同或近似相同的前体材料的纳米碎裂产品而获得。本发明的另一个实施方案涉及一种通过将购买的或容易地自制出的前体材料 (即交联的微米或更大尺寸的蛋白质聚集体或晶体)纳米化(即将物理尺寸缩减至纳米级)来制备交联蛋白纳米颗粒的非常简单的方法。本发明的另一个实施方案涉及由所述方法生产的交联蛋白纳米颗粒在提高通过任何局部的或全身的给药途径的性能中的应用，这些给药途径包括经皮式的、口服式的 (和最终GALT式的)、转化粘液质式的(例如口腔式的、舌下式的)、吸入式的和注射式的 (例如腹膜内式的、肌肉式的、皮下式的、鞘内式的、薄壁组织内的(intraparenchymal)和输液式的)。本发明的另一个实施方案涉及由所述方法生产的交联蛋白纳米颗粒在修复由任何一种已知的溶酶体储存紊乱所引起的新陈代谢失衡中的应用。如下所示，通过物理式地集合单个蛋白质单元、然后同时地或之后地调用化学式的、酶式的或去水热式的交联方法，已经可以得到交联蛋白联合体。交联的行为已被深入地探究，且它的作用已经改变。例如，在很多情况下蛋白质联合体形成纳米聚集体并不是自发的或可预测的过程。因此，共价交联方法已被用来物理性地驱动和微调蛋白质纳米聚集体
6的集合。美国专利4001401公开了溶液相血红蛋白的递增化学交联，其产生可溶性的纳米尺寸颗粒形式的“聚血红蛋白”(所述“聚血红蛋白”术语可视为一种误称，因为每一个簇形成至多13个蛋白质联合体)。可发现类似的例子和多蛋白质血红蛋白联合体，其作为潜在的血液替代品而处于研究中(F D' Agnillo和TMS Chang(1998) 〃 Polyhemog lobin-superoxide dismutase-catalase as a blood substitute with antioxidant properties " Nature Biotechnology 16,667-671;以及 Robert Winslow(2006)Blood Substitutes, Chp. 38, Elsevier, London, GB)。美国专利申请2008/(^96231Al公开了使用化学交联来在蛋白质联合完成后使微米尺寸的蛋白质颗粒减溶。J Lee等人公开了在无机载体媒介的孔内形成化学交联的酶聚集体("Simple Synthesis of Hierarchically Ordered Mesocellular Mesoporous Silica Materials Hosting Crosslinked Enzyme Aggregates" Small 1，744—753，2005)。在此，孑L的尺寸决定聚集体的尺寸。美国专利申请公开了酶交联的蛋白质纳米颗粒的制备，其用自下而上的方法获得。BL Simons等人公开了用于形成共价交联的蛋白冻干物的去水热方法 (“Covalent cross-linking of proteins without chemical reagents " Protein Science 11，，2002)。Rff Matin和KW Zilm用依赖于快速分批结晶化技术的自下而上的方法来制备蛋白质纳米晶体(艮口非交联的)(〃 Preparation of protein nanocrystals and their characterization by solid state NMR " Journal of Magnetic Resonance 165, 162-174,2003)。JC Falkner等人用自下而上的方法并随后与戊二醛进行化学交联来制备交联蛋白纳米晶体(“Generation of size-controlled, submicrometer protein crystals" Chem. Mater. 17，，2005)。如上所暗示的那样，现有技术的产品与本发明的产品不同。尤其是，所有现有技术的纳米级蛋白质材料可定义为单个蛋白质的群集和交联的产品。形成鲜明对比的是，本发明提供的交联蛋白纳米颗粒可定义为交联蛋白材料(即前体材料)的纳米碎片或纳米碎裂产品。本发明所描述的方法对比以上现有技术的区别在于，每个现有技术的例子均调用自下而上的定制方法来形成特定的交联纳米聚集体(无定型的纳米簇)或者非交联的纳米晶体，而本发明使用通用的尺寸缩减技术来缩减任何前体材料(同样在此定义为微米或更大尺寸的交联蛋白聚集体或晶体)的尺寸至纳米级。这样，在本发明中通过一种截然不同且概念相反的方法而获得了新颖的交联蛋白产品。本发明的一处主要新颖性是尺寸缩减步骤，其用于将大的前体材料转化成纳米尺寸的交联颗粒。本发明的交联蛋白纳米颗粒的新颖前体材料可通过如文献中详细说明的用于制备交联的微米或更大尺寸的蛋白质晶体或交联蛋白聚集体的任何常规方法获得。备选的是，合适的前体材料可以购买得到。美国麻塞诸塞州剑桥的Vertex Pharmaceuticals Inc.的CLEC 和AlthusBiologicalsdnc.的CLEC均有售嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、酯酶、脂肪酶、溶菌酶、天冬酰胺酶、尿素酶、腈水解酶、海因酶和卵白酶的交联的微米尺寸晶体；类似地，荷兰代尔夫特的CLEA Technologies BV已出售作为交联聚集体的减溶的卵白酶和脂肪酶。本发明的方法显著地区别于现有技术，并产出具有明显不同的物理化学性能特点的交联蛋白纳米颗粒。本发明的许多纳米颗粒特性、例如在交联中的失活程度很容易根据前体材料来预知；所述交联蛋白纳米颗粒在操作条件下通常是长寿的，并且其储存如干燥粉末一样简单。其前体材料也具有延长的保存期限。现有技术的前体不存在这样的优点， 因为现有技术是始于单个蛋白质经自下而上的方法来提供产品的。在现有技术中，在交联之前并未使用蛋白质沉淀的技术来产生大尺度的聚集体。相反，溶剂环境内的单个溶解的蛋白质分子连接起来，形成纳米尺寸的蛋白质联合体，其或保持在悬浮液中，或因其微小的尺寸而容易分散开。因此，在前体材料的历程中先于交联的大量蛋白质沉淀限定了相对于现有技术的一项界定步骤，以及本发明的一个最终实施方案。本领域的技术人员知道，被适当操控的从溶液中析出蛋白质的行为具有能细微改变蛋白质结构、最终聚集体的组织和蛋白质间的空间的效果。因此，交联处于溶液中的单个蛋白质(或最好是纳米簇)的行为并不能等同于交联已沉淀的大聚集体的动力学。后者的例子被用来形成本发明的前体材料，遵循完全不同的交联动力学、交联分布和空间依赖性， 并在反应完成后显示出本质上不同的产品成分。这两种交联方法还存在概念上的区别，因为其中一种描述了均相的过程(即现有技术)，而另外一种确实为非均相的过程(即本发明)。蛋白质和交联剂的成分、蛋白质-蛋白质堆积的密度、交联的密度和空间分布(即整体上可量化为空间密度分级的交联非均一性)、交联的化学本质(化学的、酶的或脱水热化的)，以及每个蛋白质的交联的精确位点，在本发明和现有技术之间都有不同。即使是相同基础蛋白质构成每一种材料，情况也是如此；颗粒的最终化学组成、颗粒内部的蛋白质间连接性以及蛋白质的相对空间方位将会不同。这样，本发明所描述的交联蛋白纳米颗粒的特性不同于现有技术中描述的纳米尺寸的交联蛋白材料。因此，由自下而上的和自上而下的策略得到的交联纳米聚集体实际上限定了两种截然不同的、可区别的产品种类。在本发明的交联蛋白纳米晶体产品的情况中，空间密度分级的交联非均一性、颗粒形状及其表面拓扑性和能量(由纳米化引起)、材料应力(其改变材料的性质)以及可能的多态性(结晶化过程的特点)与现有技术中所描述的纳米尺寸的交联蛋白质材料相比将会不同。关于微米尺寸的交联蛋白聚集体和晶体，本发明提供了改善的生物活性(归因于高表面区域，其允许更好的交互作用和适用之处的传质)和优良的生物利用度(已知纳米颗粒可通过各种途径被吸收并进入体内)的明显益处。实际上，本发明的交联蛋白纳米颗粒的特性显然不同于其前体材料。鉴于以上两个段落的描述，本发明提供了新型的交联蛋白纳米颗粒产品，其显示出一套有益的特点。所述纳米颗粒是交联的微米或更大尺寸的蛋白质聚集体和晶体的纳米碎片产品。
图1显示了交联蛋白纳米颗粒(描述中的纳米晶体)在溶酶体储存紊乱的治疗/征兆处理中的应用。图2显示了爱尔卡酶(Alcalase)交联酶纳米聚集体以及所述纳米颗粒与碘化钾颗粒的再聚集体的图像(白色碘化钾背景上的黑色纳米颗粒和再聚集体)。所述图像用设置在背散射模式(5kV)的SEM拍摄。在碘化钾存在下用机械剪切将前体(爱尔卡酶CLEA) 在干态下纳米化。图3显示了赛威蛋白酶(Savinase)交联酶纳米聚集体以及所述纳米颗粒与碘化钾晶体的再聚集体的图像，碘化钾晶体在湿态纳米化期间先充当稳定剂。用设置在背散射电子模式GkV)的SEM拍摄的所述图像示出了赛威蛋白酶的纳米颗粒(白色碘化钾背景上的黑色纳米颗粒)和再聚集的纳米颗粒(参考DLS结果部分)。使用均化器装置使悬浮在碘化钾水溶液中的前体(赛威蛋白酶CLEA)纳米化。图4显示了赛威蛋白酶纳米聚集体和所述纳米颗粒的大量再聚集体的图像。用设置于二次电子模式OkV)的SEM拍摄的所述图像显示了以碳背衬为背景的纳米颗粒和再聚集体。使用均化器装置使悬浮在水中的前体(赛威蛋白酶CLEA)纳米化。不加入稳定剂。图5显示了赛威蛋白酶纳米聚集体以及所述纳米颗粒与碘化钾颗粒的少量再聚集体的图像。用设置于背散射电子模式GkV)的SEM拍摄的所述图像显示了一种被非常有效地纳米化的材料。在研钵中无防湿地手动研磨前体。在存在作为助磨剂、载体和纳米颗粒稳定剂的碘化钾的情况下实现机械粉碎。前体材料是赛威蛋白酶CLEA。图6显示了采用设置于二次电子模式在2kV下的SEM所拍摄的以碳为背景的赛威蛋白酶CLEA(非纳米化控制)的图像。图7显示了交联血红蛋白纳米聚集体和潜在地包括所述材料的再聚集的纳米颗粒或微米尺寸的交联血红蛋白聚集体(意味着不完全纳米化)的一种或两种可能性的图像。该图像是用设置于背散射电子模式(5kV)的SEM拍摄。前体是自制的，如在实施例部分中所详细说明的那样。图8显示了与碘化钾一起在Gelimat G-I仪器中研磨的爱尔卡酶CLEA的平均数尺寸分布图(参考实施例1)。数据用Malvern Instruments公司的纳米系列粒度仪(即配置有633nm激光的NanojS品牌)收集。图9显示了与碘化钾一起在研钵中被手动研磨的的赛威蛋白酶CLEA的平均数尺寸分布图(参考实施例4)。同样，数据通过使用所述Malvernlnstruments公司的纳米系列粒度仪收集。本发明的详细描述本发明的新颖性涉及微米或更大尺寸的交联蛋白材料的物理尺寸缩减，以及所述纳米化(即尺寸缩减至纳米级)方法实现新型交联蛋白纳米颗粒产品的制备的事实。与溶液相蛋白质和非交联蛋白晶体相比，交联蛋白晶体(微米尺寸的)因其性能的稳定性而尤其闻名。因交联而改善的耐用性在微米或更大尺寸的交联蛋白聚集体(即交联蛋白沉淀物和冻干品)的情况中也已有所体现。所述交联蛋白产品在有机溶剂和接近 100°C的温度下还有生物活性。依据观察到的伴随交联的“韧化”作用，特别惊奇地表明了交联蛋白聚集体比相应的未交联材料更易于纳米化。更系统地评定，发现共价交联蛋白聚集体和晶体的行为直接促进了尺寸缩减过程。较小的颗粒不仅通过交联的材料形成，而且这些颗粒也能在同样的力和碎裂条件的场合下在较短的时间内形成。当使用本发明所述的前体材料时，甚至手动研磨(即用手的)也很容易产生交联蛋白纳米颗粒。纳米化情况包括施加机械或水力剪切、粉碎机械力和/或声波或水力空化，应用低温以减少材料的塑性和化学降解，添加清除剂分子以减少化学降解，加入固体以帮助尺寸缩减(如果是有利的)，以及添加稳定剂分子以防止/限制碎裂后的再凝聚。通过对前体材料施加物理应力，使宏观尺寸的交联蛋白颗粒碎裂，产生理想地处于50-200nm范围内的亚微米尺寸的颗粒分布。存在于纳米化媒介中的化学品可被针对性地调整，以促进可控的颗粒碎裂，防止纳米化颗粒的再联合，以及保持构成每个颗粒的单个蛋白质组分的生物完整性。用所述方法得到的产品将展示出生物活性、提高的生物利用度和突出的传质特点。 任选地，通过用各种物理方法可将这些交联的纳米尺寸的蛋白质产品归类到更加具体的尺寸范围中。同样地，可在随后的任务中将所述蛋白质产品表面功能化。如前所述，通过调节加工选项可以微调尺寸缩减过程。在纳米化媒介中使用附加的化学品、尤其是可磨碎但化学上惰性的固体，可以促进可控的颗粒碎裂。在例如交联蛋白粉末的干燥研磨的一些情况中，这些附加的固体应比交联蛋白在物理学上更坚硬。理想地， 它们应足够坚硬以促进交联蛋白的纳米化，但并不过度坚硬而破坏蛋白质组分或减缓纳米化过程。当研磨很少量的蛋白质时，惰性固体的加入是特别有益的；在这种情况中，所述固体具有三重作用，即向系统中加入额外材料(具有载体的作用)、辅助研磨过程以及使形成的纳米颗粒稳定。在液氮中冷却、随后手动研磨蛋白质和所述粉末状研磨添加剂(在玛瑙研钵中)也可以产生纳米颗粒。所述方案尤其适于容易被破坏的蛋白质。有趣的是，冷却并不是必须需要的，因为在室温中的手动研磨也能在非常短的时间内产出纳米颗粒。在例如交联蛋白颗粒的“湿”研磨(如悬浮在水相或有机相媒介中的颗粒的机械均质化作用)的一些情况中，需要使用稳定剂来限制再聚集。这些试剂应该存在于水力剪切诱导的研磨过程的期间和之后，从而优化以纳米颗粒的形式重新获得的碎片。若供给足够的功率密度，则空化方法也可以促进所述前体材料的湿“研磨”(即尺寸缩减)。在所述条件下特别推荐自由基清除剂，因为空化会从溶剂分子中产生起反应性化学物种。作为在连续流过程中实现微米尺寸的交联蛋白颗粒的碎裂的技术，水力空化尤其引人关注。从生物利用度的角度来看，本发明的所述产品优于非涂布的非交联蛋白颗粒、交联的微米或更大尺寸的蛋白质颗粒和单个蛋白质。首先，该交联蛋白纳米颗粒可以通过肠和GALT系统吸收，然而交联的微米尺寸的颗粒太大。其次，胃酸将不能显著地破坏该交联纳米颗粒，然而被重新溶解的单个蛋白质无法在到达小肠的行程中幸存。图1描述了通过所述方法生产的特定的交联酶纳米晶体，作为用以修复溶酶体储存紊乱的新陈代谢平衡的疗法，如酶替换策略领域的技术人员所熟知的机理那样。也就是说，本发明实施方案的潜在应用不限于药物。本发明还有许多其他的优点。研磨前体材料的能力允许能够微调颗粒尺寸。与自下而上的方法相比较，尺寸缩减过程的变量要少得多，以至于一种完善的体系能容易地产生具有可重现的尺寸分布的纳米颗粒。对于自下而上的方法而言，不容易获得同样的效用。 溶液中的自下而上过程在颗粒尺寸的控制上通常会遭受固有的限制。就像许多溶质分子， 在溶液中偶然形成纳米簇的非交联蛋白会趋于进一步集合，产生高分子量的、微米级的复合体。稳定剂的使用在保持新形成的蛋白质联合体的纳米尺寸上取得了一些成功。相反，已使用了原位化学交联剂来促进缓慢集合的蛋白质分子的直接溶液相集合；令人遗憾的是，这些试剂也促进了非常高分子量的复合体的形成，即便是在稳定剂的存在下。制备交联蛋白纳米颗粒有类似的挑战，在其中化学交联剂只有在蛋白质纳米颗粒形成后才被引入；如先前所暗示的，纳米级蛋白质复合体进一步联合(或重新溶解)的固有趋向会在开始此下一步操作之前所消逝的时间段内改变颗粒的尺寸。最后，当使用化学交联剂时，颗粒间交联一直是需要考虑的风险；在许多情况下，颗粒间交联与颗粒内交联竞争(即一个颗粒内的蛋白质间交联和蛋白质内交联)，产生无法控制的尺寸增长，其超过纳米级并产生交联的微米级颗粒。如前面所讨论的，前体材料历程中的交联过程给出惊人的和显著有效的易磨性特点，证明其比非交联蛋白材料更具优势。交联似乎产生了顺应性更差的蛋白质颗粒。颗粒的顺应性更差的事实允许碎裂能够在更小长度的尺度上有效地延续。对于被高度溶剂化的结晶蛋白质来说，交联有助于在碎裂时保护结晶性。交联也保护构成纳米颗粒的蛋白质单元的结构稳定性，因此在碎裂阶段中促进生物活性的保留。交联蛋白纳米晶体尚未被工业化制备，但在现有技术中有一篇用自下而上方法的出版文献。类似的，对于一些非常特殊的应用，已经仅使用自下而上集合的方法制备了交联的纳米尺寸的蛋白质联合体，例如纳米聚集体。本发明的实施方案解决了可用的交联纳米颗粒及其生产技术的这种匮乏。特别是，本发明的实施方案扩展了尺寸缩减的原理，并具体地描述了采用基于施加应力以导致碎裂的物理手段的交联蛋白纳米颗粒的制备。用容易制备的起始材料，本发明的尺寸缩减方法是通用的、工业上可采用的、容易拓展的以及便于控制的。因此，大量的交联蛋白纳米颗粒可通过本发明来可控地和方便地制备。当将交联的微米尺寸的蛋白质材料和在溶液中的相应单个蛋白质的性能相比较时，前者表现出更长的寿命，易于复原，对水解和蛋白酶更稳定，并且更耐受温度、有机溶剂和PH极端条件。本发明的交联蛋白纳米颗粒展示出类似的、优于单个蛋白质的优点。这些颗粒还拥有优于已建立的微米级颗粒的特定优点，例如增强的传质，增强的反应性，以及改善的生物利用度和效能。根据已观察到这些颗粒的纳米尺寸会直接影响性能特点，可以合理推断的是，这种纳米颗粒可以替代多种单个蛋白质和多种微米尺寸的交联蛋白颗粒的作用。在此描述的实施例部分的试验将显示根据尺寸缩减的生物活性的显著改善。更重要的是，这些颗粒的纳米尺寸在例如酶替代疗法的治疗应用中表现出非常有用。此断言的基本原理建立在基于其他纳米颗粒的文献的研究结果上，其鲜明地提出被适当处理过的酶纳米颗粒将保持其生物活性，适应于多种摄入途径，并在与单体酶或可溶性酶衍生物相比时具有良好的系统生物利用度、改进的大脑进入、快速的细胞内在化、向溶酶体的定向传递，以及大大改善的体内稳定性。由于溶酶体储存紊乱凸显出细胞器官内的酶缺乏，本发明可修复体内平衡，并作为已建立的药物输送策略的改善的和更通用的备选方法。图1说明了此疗法的基本原理。本发明的实施方案可改良用于多种形式的酶疗法。酶缺乏可以直接被补偿，正如在已建立的替代疗法中的情况，或者酶缺乏可以简单地通过封锁额外底物的供给路线来进行处理，正如在底物缩减/抑制疗法中的情况。可以将这些疗法延伸到溶酶体储存紊乱的范围以外，因为交联纳米颗粒可以抵抗酸性蛋白质水解的作用和其他出现在胞液和细胞间液中的水解过程。所述纳米颗粒的小尺寸意味着容易注射，通过舌下的、口腔的和GALT (与肠关联的淋巴组织)粘膜途径的良好吸收，以及无限制地进入诸如染病血管和受损胞间隙的流动受限区域。接着可以推断的是，交联蛋白纳米颗粒在医治多种如溶酶体储存紊乱和囊胞性纤维症的罕见病中能展示出优点。同样地，它可用来帮助消化失调、酶响应癌症、糖尿病和缺氧症状、与再灌注相关的损伤和慢性创伤。在充分考虑以上罗列的固有潜在优点后，多种关键的疗法可以遵循此方法，尤其是以大脑为靶向的基于蛋白质的药物。产品详沭本发明提供一种共价交联蛋白纳米颗粒，大小为10-999nm并优选为 50-200nm，适用于生物技术、化妆品、制药和生物医学的应用，其特征在于，所述纳米颗粒包含一种或多种蛋白质、吸附物和至少一种零或更大长度的蛋白间交联，并且以在各空间轴上有至少1微米的物理长度的、成分上相同或近似相同的前体材料的纳米碎裂产品(即其是纳米碎裂产品)的形式获得。术语“近似相同”的使用是考虑到可能在尺寸缩减期间产生的微小变化，例如溶剂交换、溶剂替代或改变的蛋白质间堆积。术语“纳米碎裂”用来传达这样的思想，即本发明的微米或更大尺寸的前体材料被碎裂或再细化成纳米尺寸的碎片 (因此捏合成该术语“纳米碎裂”)。蛋白质组分可包含酶、激素、受体、结构类、传输类或抗体类的蛋白质中的一种或多种。更具体地说，蛋白质组分可包括水解酶、水解酶原、异构酶、 转移酶、氧化还原酶、裂解酶、连接酶、胰岛素、胰增血糖素、胰高血糖素样肽、促胰岛素分泌素(extendin)、促胰岛素分泌素衍生物、普兰林肽、胰岛素样生长因子、胰岛素抗体、胰岛素原抗体、干扰素、抗癌单克隆抗体、抗癌疫苗、奈西立肽、抗血小板剂、细胞因子、肿瘤坏死因子α、白介素1受体拮抗剂、HIV-I抑制肽Τ20、人造蛋白质5H_eX、促生长素抑制素、HIV融合抑制剂T-1M9、抗菌蛋白质、溶菌酶、乳铁传递蛋白、细菌素、白介素_2、血管紧缩素原、 血管紧缩素、血管紧缩素转化酶抑制剂、明胶、胶原质、原骨胶原、壳聚糖、丝蛋白、角蛋白、 肌浆球蛋白、肌动蛋白、生长激素、清蛋白、球蛋白、血红蛋白、肌球素和/或细胞色素。留心制备的方法，显然在尺寸缩减方面，每一个交联蛋白纳米颗粒将反映出其前体材料的化学成分和交联历程。前体是后来被交联的微米或更大尺寸的蛋白质聚集体(来自蛋白质沉淀的情况或冻干的情况)或蛋白质晶体。前体的交联本质可以是化学的、酶的或去水热的，并且在各种情况中都是共价的。交联可从零长度，正如在用碳化二亚胺或真空下加热(去水热地)处理的直接连接的蛋白质的情况，变化到使用2-、3_或聚合连接物的20或更大碳单元的蛋白间交联。在前体材料中构成或促进交联形成的化学试剂能溶于或分散于水或有机溶剂中。化学试剂不限于下列物质并可为其中的任何一种碳化二酰亚胺、右旋糖酐醛、二烃基二酰亚胺盐 (dialkyl diimidates)和拥有多达20个桥碳原子的其他双功能或三功能的交联剂，和/或戊二醛聚合体、淀粉醛、聚胺、有机硅化合物以及有至少5个功能基团的其他聚合连接物。 在酶法形成交联的情况中，前体可用任何合适的水解酶、转移酶和/或氧化还原酶，以及可能的转移酶例如转谷酰胺酶来处理。在去水热法形成交联的情况中，前体材料可于真空条件下在70-120°C下加热6-48h。然而，希望交联蛋白纳米颗粒和主要基于蛋白质的前体沿着表面容纳吸附物。吸附物的本质会反映前体材料的制备历程和导致纳米颗粒的加工历程。纳米颗粒和前体将负载吸附物，其包含水、有机溶剂、盐、冻干保护剂、冷冻保护剂和/ 或表面活性剂中的一种或多种。方法详沭本发明公开了一种制备交联蛋白纳米颗粒的方法。其步骤包括制备微米或更大尺寸的蛋白质聚集体或晶体，以及交联该聚集体或晶体以产生前体材料。然后对该前体进行实现纳米化的尺寸缩减过程，产生交联蛋白纳米颗粒。尺寸缩减过程可沿着前体材料施加机械剪切力。例如，必需的机械剪切力可用在100-15000rpm、优选在 rpm下运行的常规的高剪切混和器/复合装置产生，其在低于120°C的温度下的作用时间为30s-10min。尺寸缩减过程也可施加水力剪切应力，其中所述的水力剪切应力使用例如均质器作为分散/混合仪器而施加到水或有机介质中的前体材料上。在均质的情况中，规定的操作条件是100-500rpm并优选rpm、5min-3h并优选30min_l. 5h，以及低于100°C的温度。未预料到的是，仪器并不是必须需要的，因为通过本发明，使用研钵和研杵在过量碘化钾存在下的手动研磨(粉碎机械力)也能产生交联蛋白纳米颗粒。前体/粉末(即助磨剂)的重量比例处于从2
1000 (以重量计)的范围内。最后，纳米化也可使用压力梯度应力来实现，其可在低于80°C的温度下通过音波或水力空化产生。尺寸缩减方法的又一个方面是研磨过程之前和期间选择性使用冷却，其可使前体材料变脆并减少不需要的分解。冷却的一种方便来源是液氮。尺寸缩减方法的又一个方面是在适当的情况下选择引入清除剂分子，以便减少由自由基过程、异裂反应过程以及氧化过程引起的蛋白质分解。加入这样的预防措施在已知会产生大量自由基的空化过程中证明是有用的。 所加入的清除试剂的有益量是相对于前体材料的0. 01-2%重量。所述清除剂无需限于以下物质且可包含其中的一种或多种α -生育酚、柚皮素、视黄醇、碘化物、辅酶Q10、褪黑激素、类胡萝卜素萜类化合物、黄酮类多酚、酚酸和酯、谷胱甘肽、N-乙酰基半胱氨酸、植酸、草酸、柠檬酸、丁子香酚、氧杂蒽酮、姜黄色素、黄酮并木脂素、右旋硫辛酸、尿酸、胡萝卜素、对苯二酚、抗坏血酸、丁基羟基甲苯、重亚硫酸盐和/或硫代硫酸盐。也推荐用固体粉末添加剂来促进物理尺寸缩减的过程。前体和固体粉末可在尺寸缩减之前以各自的重量比例从 2
1000地相混合。固体粉末的选择可包括碘化钾、碘化钠、氯化钠、其他碱金属盐、碱土金属盐、活性炭、二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、甲壳质、角蛋白和/或聚酰亚胺。尺寸缩减方法的另一个方面是添加以重量计2-100倍过量的稳定剂分子以防止/限制再凝聚。稳定剂分子的选择无需限于以下物质并可以是其中的一种或多种碘化钾、碘化钠、氯化钠，或任何碱金属或碱土金属盐，铵盐、糖类、多羟基化合物、聚乙烯基吡啶、聚乙烯吡啶烷酮、聚酰胺、柠檬酸、抗坏血酸、清蛋白、羟丙甲纤维素和/或明胶。用本发明的方法生产的交联蛋白纳米颗粒将通过改善生物活性和生物利用度来改善基于蛋白质疗法的性能。几乎所有的给药途径均可从本发明中受益，包括口服的、 口腔的、舌下的、GALT的、腹膜内的、肌肉的、皮肤的、皮下的、鞘内的、薄壁组织内的和静脉内的。本发明的一个特殊目的是修复由溶酶体储存紊乱引起的新陈代谢失衡。纳米颗粒进入细胞内的事实和外来材料引入溶酶体的事实用于提议一种对所述缺陷细胞器官的有效疗法。交联能阻止快速蛋白质水解的事实将有助于促进所述交联蛋白纳米颗粒的口服药物输送(对幼童尤佳)。所述纳米颗粒的蛋白质水解阻力也将允许在溶酶体内或在其他染病区域内的长期体内活性。实施例实施例1 爱尔卡酶CLEA (CLEA即交联酶聚集体)的纳米化。将爱尔卡酶CLEA (化， CLEA Technologies BV)以及作为助磨剂和稳定剂的碘化钾(69g)缓慢地混合。用从美国新泽西州Mahwah的Draiswerke，Inc.获得的G系列的GELIMAT Gl搅拌器/混合器将混合物在机械剪切下研磨。为此，将材料通过带有闭锁滑块的顶部进料斗送入腔室内。这个机器具有带中心轴的水平延伸的圆柱形腔室，在中心轴上设有错列的、大致径向延伸的混
13合件。该腔室装备有可测量能量输入或功率消耗的电表轴驱动器和温度传感器。使轴旋转 (5000rpm,5min)并使样品温度不超过63°C。一旦完成，将精磨过的混合物在离心力的作用下从腔室中快速排出。使用设定在背散射电子模式(5kV)的LEO Supra 35VP仪所进行的 SEM微观分析(图2)示出了爱尔卡酶的纳米颗粒(白色碘化钾背景上的黑色颗粒)和再聚集的纳米颗粒(参考DLS结果部分)。所述混合物被发现保留有生物活性。在未处理的前体材料中未观察到纳米颗粒(图像未示出)。实施例2 :赛威蛋白酶CLEA的纳米化。将赛威蛋白酶CLEA(10mg， CLEATechnologies BV)放入50ml的Falcon管中，并悬浮在含有预溶的碘化钾(200mg) 作为稳定剂的蒸馏水(IOml)中。使用配备PT-DA 6050/2TM分散头的1600WPT-MR 6100Polytron均质机(Kinematica的分散和混合技术)将水力剪切应力施加到悬浮液 (1500rpm,1.5h,30-35°C )中。将样品取出，在液氮中瞬间冻结，然后冻干。使用设定在背散射电子模式(4kV)的LEO Supra 35VP仪的SEM样品微观分析(图3)示出了赛威蛋白酶的纳米颗粒(白色碘化钾背景上的黑色颗粒)和再聚集的纳米颗粒(参考DLS结果部分)。 所述混合物展示出相对于来自原料瓶的未经处理的赛威蛋白酶的340%的生物活性。在未处理的前体材料中未观察到纳米颗粒(图像未示出)。实施例3 赛威蛋白酶CLEA的纳米化。重复实施例2的步骤，不同之处是未加入碘化钾作为稳定剂，并且SEM分析是以碳背衬为背景在二次电子模式(2kV)下进行。获得很少的自由纳米颗粒。事实上，大部分的产品由微米尺寸的再聚集的纳米颗粒组成(图4)。有趣的是，即便这些聚集体也只是微弱地联合，正如DLS结果所暗示的那样(见DLS部分)。而且，观察到相对于未处理过的微米尺寸前体的590%的令人震撼的生物活性(SEM未显示)， 证实了所述纳米颗粒的存活和有益特征。实施例4 赛威蛋白酶CLEA的纳米化。在玛瑙研钵中无防湿地手动研磨(20min， RT)赛威蛋白酶CLEA (20mg，CLEA Technologies BV)。使用碘化钾(400mg)作为助磨剂和稳定剂。一旦肉眼不再能看到参差的区域就停止碾压机械作用。用背散射电子(4kV)的SEM 微观分析(图5)示出了赛威蛋白酶的纳米颗粒(白色碘化钾背景上的黑色颗粒)。观察到很少的再聚集纳米颗粒(参考DLS结果部分以进一步讨论)，证实了手动研磨方法的潜在效用。相对于未处理的CLEA原料，定量了 265%的生物活性(在图6中显示，其以碳为背景， 使用在2kV下的二次电子模式)。实施例5 交联血红蛋白聚集体的纳米化。所有的交联和检杳的步骤都在4°C下完成。将牛血红蛋白(Sigma)与戊二醛交联。将溶液(5ml，IOOmg Hb/ml)倒入硫酸铵溶液(45ml，3M)，然后静置(Ih)以产生不溶性聚集体。将新制的戊二醛溶液(lml，25%)加入反应容器中，施加涡旋(3s)，然后在温和的摇动下培养混合物(20h)。其后加入三羟甲基氨基甲烷(TRIS)缓冲液(2ml，2M，pH8)，并在机械摇动器上缓缓地培养反应(2h)。通过离心作用(10min，7000rpm)重新获得蛋白质样品，用0. IM TRIS缓冲液(pH8)清洗三次，用水清洗一次(清洗表示15-20min的摇动；每次清洗完成后将样品在7000rpm下旋转IOmin)。 将交联血红蛋白聚集体产品在真空条件下干燥(RT)。蛋白质(0.5g)和碘化钾(69g) —起被筛分。使用如实施例1中所述的Gelimat混合器将混合物在机械剪切下研磨。SEM分析 (图7，背散射电子模式，5kV)示出了纳米颗粒(白色碘化钾背景上的黑色颗粒)和微米尺寸的颗粒或纳米尺寸的聚集体的存在。对照品和机械加工过的交联血红蛋白样品具有生物活性，后者略强。蛋白酶牛物检验。用明胶(磷酸盐缓冲的盐水(PBS)缓冲液中的Iwt% )作为底物检验尺寸缩减的赛威蛋白酶CLEA和爱尔卡酶CLEA(2h，37°C，550rpm)。在检验之前未进行脱盐。将被检验的蛋白质在水中再生，使得最后浓度为lmg/ml。将相同体积的蛋白质悬浮液和明胶-PBS溶液相结合以开始检验。类似地检验未处理过的CLEA。零蛋白质的对照品由水(实施例3)或适当制备的碘化钾溶液(其余实施例)组成。随后将检验介质在 Eppendorf微型离心机中进行离心(12000rpm)，以移除所有不溶性材料，然后通过输送异丙醇茚三酮溶液(lwt% )到上清液上以得到2
1的水/有机体积比(45min，7(TC )来分析上层清液。在显色之后，将反应冷却并在570nm下用分光光度法定量。在超出比耳定律的情况(即A & 1. 5)中，在测量之前用异丙醇准备稀溶液。所有的对照都是相对的，并且是针对未处理过的CLEA原料。基于底物N-乙酰甘氨酸乙酯的其他生物检验可在pH7. 5和 40°C下进行，正如用于检验枯草杆菌蛋白酶的任何一种已建立的方法。交联血红蛋白聚集体牛物检验。以邻苯二胺为显饩剂来实施基于K Zhang 等人(“Stopped-flow spectrophotometric determination of H2O2 with Hb as catalyst" Talanta 51，179-186，2000)的改进的检验方法。使用磷酸钠(10mM,pH8)代替规定的缓冲系统。在培养(lh，450rpm，RT)之后，通过离心作用将任何颗粒材料从反应溶液中分离。颜色的分光光度法检测完全按照该文献所规定的进行。使用动杰光散射(DLS)的尺寸缩减的前体材料(即从实施例1-5获得的)的颗粒尺寸分析。将纳米颗粒样品(在实施例2-3的情况中为储存而预先被瞬间冻结和冻干) 在蒸馏水中再生。得到的悬浮液可根据需要通过加入更多的盐而被稳定。在优化样品制备后，分析物之后被转移到300μ 1的试管中，并置于马尔文仪器公司的纳米系列粒度仪(即配置有633nm激光的Nano-ZS品牌)内。每一个样品在制备后立即读数，因为过多的延迟通常导致聚集(一般产生1-3微米的颗粒)并甚至沉积(如在延长的时间段之后的信号损失所证明的那样_颗粒溶解，信号损失的另一原因对CLEA来说并不是一种选择)。对从产生通常不大于500nm(具有合理的尺寸分布)的颗粒尺寸的实施例1_5中获得的样品进行三次分析。图8和图9分别明确显示了两种分析的平均数尺寸分布谱图，即与碘化钾一起在Gelimat G-I仪中研磨的爱尔卡酶CLEA(即实施例1)和与碘化钾一起在研钵中手动研磨的赛威蛋白酶CLEA(即实施例4)。出于分析的目的，将分别为0.3A(lmg CLEA/ml)和 0. 024A(0. 25mg CLEA/ml)的颗粒吸光度读数输入到分析程序中。在实施例1_4中，在多个 SEM图像中的局部区域似乎描绘的是微米尺寸的颗粒；但是，这些较大的颗粒事实上是如 DLS结果所证明的交联纳米颗粒的再聚集簇。DLS结果因此对本发明相当重要，因为其指向一种能基本上定量的、产生具有生物活性的纳米尺寸材料的纳米碎裂过程。实施例1-3的 DLS分布图是单峰的，而实施例4是双峰的。实施例5的DLS分布图也是双峰的；但是在此实施例中，纳米颗粒、以及微米尺寸的或再聚集的纳米颗粒这二者均被观察到。总的来说， 每一张SEM显微图的纳米颗粒的尺寸分布与相应的DLS读数相一致(光散射分布图通常指示大约40-50%更大直径的颗粒)。在整个文件中给出了示例性的实施方案。本领域的技术人员可以理解，本发明能以其他特定形式来实施。本领域的技术人员不需要过度的实验即可以实施类似的其他实施方案。出于本专利文件的目的，本发明的范围不仅仅限制于特定的实施例或上述描述的备选方案。
1.一种共价交联蛋白纳米颗粒，大小为10-999nm并优选为50-200nm，适用于生物技术、化妆品、制药和生物医学的应用，其特征在于，所述纳米颗粒包含一种或多种蛋白质、一种或多种吸附物和至少一种零或更大长度的蛋白间交联，并且是在每个维度中最小长度为 1微米的、成分相同或近似相同的前体材料的纳米碎裂产品。
2.根据权利要求1所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，蛋白质组分包含酶、激素、 受体、结构类蛋白质、运输类蛋白质或抗体类蛋白质中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，蛋白质组分包括下述中的一种或多种水解酶、水解酶原、异构酶、转移酶、氧化还原酶、裂解酶、连接酶、胰岛素、胰增血糖素、胰高血糖素样肽、促胰岛素分泌素、促胰岛素分泌素衍生物、普兰林肽、胰岛素样生长因子、胰岛素抗体、胰岛素原抗体、干扰素、抗癌单克隆抗体、抗癌疫苗、奈西立肽、抗血小板剂、细胞因子、肿瘤坏死因子α、白介素1受体拮抗剂、HIV-I抑制肽Τ20、人造蛋白质 5H-ex、促生长素抑制素、HIV融合抑制剂T-1249、抗菌蛋白质、溶菌酶、乳铁传递蛋白、细菌素、白介素-2、血管紧缩素原、血管紧缩素、血管紧缩素转化酶抑制剂、明胶、胶原质、原骨胶原、壳聚糖、丝蛋白、角蛋白、肌浆球蛋白、肌动蛋白、生长激素、清蛋白、球蛋白、血红蛋白、 肌球素和/或细胞色素。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒反映了所述前体材料的化学成分、交联历程和加工历程。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述前体是交联蛋白聚集体(沉淀物或冻干物)或晶体。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，共价交联通过以化学方式、酶方式或去水热方式处理所述前体材料来实现。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，零或更大长度的蛋白质间交联通过以化学方式、酶方式或去水热方式处理所述前体材料来实现。
8.根据权利要求1到7中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，在所述前体材料中形成交联的化学试剂能溶于或分散于水或有机溶剂材料中，并且包含碳化二酰亚胺； 右旋糖酐醛；二烃基二酰亚胺盐和拥有多达20个桥碳原子的其他双功能或三功能的交联齐U;和/或戊二醛聚合体、淀粉醛、聚胺、有机硅化合物以及有至少5个功能基团的其他聚合连接物。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，在所述前体材料中形成交联的酶是水解酶、转移酶和/或氧化还原酶。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，在所述前体材料中形成交联的酶是转氨酶。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，所述前体材料通过在真空条件下在70-120°C下加热蛋白质粉末6-4 来去水热式地交联。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒，其特征在于，前体材料中的所述吸附物包含水、有机溶剂、盐、冻干保护剂、冷冻保护剂和/或表面活性剂。
13.一种制备根据权利要求1所述的交联蛋白纳米颗粒的方法，包括制备微米或更大级的蛋白质聚集体或晶体的步骤，以及交联该聚集体或晶体以提供所述前体材料的步骤， 其特征在于，对所述前体进行会引起纳米化的尺寸缩减过程，产生最终产品。
14.根据权利要求13所述的纳米化方法，其特征在于，对所述前体材料施加机械剪切力。
15.根据权利要求13或14所述的纳米化方法，其特征在于，使用在100-15000rpm且优选在rpm下运行的常规高剪切搅拌器/混合装置来对所述前体材料施加机械剪切力。
16.根据权利要求13到15中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，机械剪切力在低于120°C的温度下施加到所述前体材料上30s-10min。
17.根据权利要求13到16中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，对所述前体材料施加水力剪切应力。
18.根据权利要求13到17中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，使用在 100-5000rpm且优选在rpm下运行的均质器作为分散/混合仪器来将水力剪切应力施加到水或有机介质中的所述前体材料上。
19.根据权利要求13到18中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，水力剪切应力在低于100°C的温度下施加到所述前体材料上5min到汕，优选为30min到1.釙。
20.根据权利要求13到19中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，将粉碎机械力施加到所述前体材料上。
21.根据权利要求13到20中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，通过使用研钵和研杵的手动研磨来施加粉碎机械力以便粉碎所述前体材料，以按重量计的从2
1000的各自比例来供给前体和作为助磨剂固体粉末。
22.根据权利要求13到21中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，在低于80°C的温度下通过音波或水力空化将压力梯度应力施加到所述前体材料上。
23.根据权利要求13到22中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，对所述前体材料施加冷却，以使其变脆并减少分解。
24.根据权利要求13到23中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，尺寸缩减之前和期间的冷却用液氮来完成。
25.根据权利要求13到M中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，加入清除剂分子以减少蛋白质分解，加入量为相对于前体材料的0. 01-2%重量。
26.根据权利要求13到25中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，清除剂分子为 α -生育酚、柚皮素、视黄醇、碘化物、辅酶Q10、褪黑激素、类胡萝卜素萜类化合物、黄酮类多酚、酚酸和酯、谷胱甘肽、N-乙酰基半胱氨酸、植酸、草酸、柠檬酸、丁子香酚、氧杂蒽酮、姜黄色素、黄酮并木脂素、右旋硫辛酸、尿酸、胡萝卜素、对苯二酚、抗坏血酸、丁基羟基甲苯、 重亚硫酸盐和/或硫代硫酸盐。
27.根据权利要求13到沈中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，加入固体粉末以促进物理尺寸缩减的过程，以按重量计的从2
1000的各自比例来供给前体和所述固体粉末。
28.根据权利要求13到27中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，所述固体粉末为碘化钾、碘化钠、氯化钠或其他碱金属盐或碱土金属盐、活性炭、二氧化硅、氧化铝、二氧化钛、甲壳质、角蛋白和/或聚酰亚胺。
29.根据权利要求13到观中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，加入以重量计2-100倍过量的稳定剂分子以防止/限制再凝聚。
30.根据权利要求13到四中任一项所述的纳米化方法，其特征在于，稳定剂分子为碘化钾、碘化钠、氯化钠，或任何碱金属或碱土金属盐，铵盐、糖类、多羟基化合物、聚乙烯基吡唆、聚乙烯吡啶烷酮、聚酰胺、柠檬酸、抗坏血酸、清蛋白、羟丙甲纤维素和/或明胶。
31.通过如权利要求13到四中任一项所述方法制备的如权利要求1到12中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒在提高经由任何给药途径的治疗性能中的应用，所述给药途径包括口服的、口腔的、舌下的、GALT的、腹膜内的、肌肉的、皮肤的、皮下的、鞘内的、薄壁组织内的和静脉内的。
32.通过如权利要求13到四中任一项所述方法制备的如权利要求1到12中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒在修复由溶酶体储存紊乱引起的新陈代谢失衡中的应用。
33.通过如权利要求13到四中任一项所述方法制备的如权利要求1到12中任一项所述的交联蛋白纳米颗粒在罕见病、囊胞性纤维症、消化失调、酶响应癌症、糖尿病和缺氧症状、与再灌注相关的损伤、慢性创伤和大脑病状的治疗中的应用。
本发明涉及交联蛋白纳米颗粒及其生产方法。所述方法包括通过机械的或去水热的剪切、机械粉碎、音波空化和/或水力空化来制备和纳米化(即尺寸缩减至纳米级)蛋白质纳米颗粒前体材料，即微米或更大尺寸的交联蛋白。
文档编号A61K9/51GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者阿尔佩·塔拉尔普 申请人:萨班哲大学