USE OF MEDICAMENT TARGETING CYSLT1 IN PREPARATION OF DRUG FOR PREVENTION OR TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
WIPO Patent Application WO/
Provided is a use of a medicament targeting a cysteine-leukotriene receptor CysLT1 in preparation of a drug for prevention or treatment of autoimmune diseases. The antagonists of CysLT1 include Montelukast, Zafirlukast and Pranlukast, and are used for treatment or prevention of multiple sclerosis, rheumatoid arthritis, lupus erythematosus or inflammatory bowel disease.
Inventors:
XIE, Xin (555 Zuchongzhi Road, Zhangjiang Pudong, Shanghai 3, 201203, CN)
谢欣 (中国上海市浦东张江祖冲之路555号, Shanghai 3, 201203, CN)
DU, Changsheng (555 Zuchongzhi Road, Zhangjiang Pudong, Shanghai 3, 201203, CN)
杜昌升 (中国上海市浦东张江祖冲之路555号, Shanghai 3, 201203, CN)
WANG, Liefeng (555 Zuchongzhi Road, Zhangjiang Pudong, Shanghai 3, 201203, CN)
Application Number:
Publication Date:
01/31/2013
Filing Date:
06/15/2012
Export Citation:
SHANGHAI INSTITUTE OF MATERIA MEDICA, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES (555 Zuchongzhi Road, Zhangjiang Pudong, Shanghai 3, 201203, CN)
中国科学院上海药物研究所 (中国上海市浦东张江祖冲之路555号, Shanghai 3, 201203, CN)
XIE, Xin (555 Zuchongzhi Road, Zhangjiang Pudong, Shanghai 3, 201203, CN)
谢欣 (中国上海市浦东张江祖冲之路555号, Shanghai 3, 201203, CN)
DU, Changsheng (555 Zuchongzhi Road, Zhangjiang Pudong, Shanghai 3, 201203, CN)
杜昌升 (中国上海市浦东张江祖冲之路555号, Shanghai 3, 201203, CN)
International Classes:
A61K31/41; A61K31/404; A61K31/47; A61P19/02; A61P37/00; A61P37/02
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Foreign References:
Other References:
REETTA HOLMA ET AL.: 'Acute effects of the cys-leukotriene-1 receptor antagonist, montelukast, on experimental colitis in rats.' EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY vol. 429, no. 1-3, 2001, pages 309 - 318
SIMON D CROWTHER ET AL.: 'Current treatment of asthama-focus on leukotrienes.' EXPERT OPINION ON PHARMACOTHERAPY vol. 1, no. 5, 2000, pages 1021 - 1040
Attorney, Agent or Firm:
KINGSOUND & PARTNERS (11/F, Block B KingSound International Center, 116 Zizhuyuan Road, Haidian District, Beijing 7, 100097, CN)
权 利 要 求
1、靶向半胱氨酸 -白三烯受体 CysLTl的药物在制备用于预防或治疗自 身免疫性疾病的药物中的用途。
2、 如权利要求 1 所述的用途， 其特征在于， 所述靶向半胱氨酸 -白三 烯受体 CysLTl的药物包括 CysLTl拮抗剂。
3、 如权利要求 2所述的用途， 其特征在于， 所述 CysLTl拮抗剂包括 孟鲁司特、 扎鲁司特和普仑司特。
4、 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述自身免疫性疾病为多 发性硬化、 类风湿关节炎、 红斑狼疮或炎症性肠病。
Description:
靶向 CysLTl的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途 技术领域 本发明涉及生物医药领域， 具体而言， 涉及靶向半胱氨酸 -白三烯受体 CysLTl的药物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。 背景技术 多发性硬化（Multiple sclerosis, MS)是人类常见的中枢神经系统（Central Nervous System, CNS ) 自身免疫性炎症， 病理表现为免疫炎症致中枢神经 系统脱髓鞘及神经退行性病变。 实验性自身免疫性脑脊髓炎 （Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE) 是 CD4+ T细胞介导的脱髓鞘疾病， 病理特征与 MS相似， 是研究 MS的发病机理、 治疗和预防的理想动物模型 ( 1-2)。 完全弗氏佐剂与髓磷蛋白、 蛋白脂质蛋白 （Proteolipid Protein)和髓 鞘少突胶质细胞糖蛋白 （Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG)乳化后 免疫相关易感鼠， 或将自激活 T 细胞继承转移至正常受体鼠即可诱导产生 EAE ( 5-8)。在 EAE动物模型中， 血脑屏障的完整性受到破坏， 外周 CD4+ T 细胞浸润进 CNS, 导致巨噬细胞和树突状细胞在 CNS的浸润和聚集， 激活 小胶质细胞， 最终导致神经脱髓鞘， 轴突受损， 影响神经冲动传递并可致瘫 痪 （3-5 )。 目前引起 EAE和 MS发病的介质并不是很清楚。
白三烯 （leukotrienes) 作为一重要的炎症介质， 与多种炎症疾病 （如哮 喘、 过敏性鼻炎及心血管疾病、 炎性肠病等）有关 (6-10)。在各种致病因子刺 激作用下， 磷酸甘油被磷酸酯酶 A2 (Phospholipase A2 , PLA2 ) 水解生成游 离的花生四烯酸 （Arachidonic Acid )。 花生四烯酸由 5-脂氧合酶 ( 5-lipoxygenase, 5-LO )催化生成白三烯 A4 ( Leukotriene A4， LTA4 )并由 LTA4 水解酶（leukotriene A4 hydrolase, LTA4H)水解生成白三烯 B4( Leukotriene B4, LTB4)， 或在白三烯 C4合成酶 （Leukotriene C4 synthase , LTC4S) 催化下， 生成半胱氨酸-白三烯 C4 (Leukotriene C4, LTC4) 并直至生成半胱氨酸 -白三 烯 D4 (Leukotriene D4, LTD4)及半胱氨酸-白三烯 E4 ( Leukotriene E4 , LTE4) (11)。 LTB4的生物活性是通过两个 G蛋白偶联受体（GPCR) 白三烯 B4受体 1和 2 (Leukotriene B4 receptor 1禾 Π 2， BLT1和 BLT2 ) (12)来实现的； 半胱 氨酸-白三烯（Cysteinyl leukotriene, CysLTs)也是通过两个 GPCR, 即半胱氨 酸 -白三烯受体 1和 2 (CysLTl和 CysLT2) 来介导生物活性的 (13)。 白三烯 信号通路的调节剂包括 5-LO抑制剂 （例如， 齐留通 （zileuton) ) 和 CysLTl 拮抗剂 （例如， 孟鲁司特 （montelukast)、 扎鲁司特 （zafirlukast) 和普仑司 特 （pranlukast) ) , 其位列 3类最广泛用于治疗哮喘药物之中， 并为唯一的口 服药 (14-17)。
微阵列分析显示， 作为合成白三烯的关键酶， 5-LO在 MS病灶部位及 EAE动物的 CNS中是表达上调的（18)。 Zileuton抑制 5-LO后， EAE发病推 迟，严重程度减轻 (19)。一些研究也显示基因或药物阻断 BLT1信号能抑制炎 症细胞被招募入 CNS从而抑制 EAE的诱导 (12,20)。但半胱氨酸 -白三烯和他 们的受体是否参与 EAE的发病从未见报道。 发明内容 针对现有技术中的不足，发明人致力于研究 EAE发病的介质和机理， 半 胱氨酸 -白三烯及其受体在 EAE发病中的作用， 以及半胱氨酸-白三烯受体能 否作为自身免疫病的治疗靶点， 并且完成了本发明。 在本发明的研究中， 发 明人发现在 EAE动物模型中，白三烯合成关键酶 5-LO及半胱氨酸-白三烯受 体 CysLTl表达水平明显上调， 半胱氨酸-白三烯水平也升高。 孟鲁司特和扎 鲁司特阻断 CysLTl后能减少 CNS的炎症细胞浸润， 减轻 EAE的临床症状。 本发明的研究表明， 半胱氨酸 -白三烯及其受体在 EAE发病中扮演了重要角 色， 主要通过增加 MOG特异性 T细胞的白介素 -17a (IL-17a) 的分泌， 调节 血脑屏障的通透性及诱导致敏 T细胞的趋化， 引起 EAE发病。 同时， 炎症 细胞的过度激活及对组织的浸润是许多自身免疫病 （包括多发性硬化、 类风 湿关节炎、 红斑狼疮、 炎症性肠病等） 的共同特征。
因此， 本发明的一个目的是提供靶向半胱氨酸 -白三烯受体 CysLTl的药 物在制备用于预防或治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
本发明中， 优选地， 所述靶向半胱氨酸 -白三烯受体 CysLTl的药物包括 CysLTl拮抗剂，更优选地，所述 CysLTl拮抗剂包括孟鲁司特（montelukast)、 扎鲁司特 （zafirlukast) 和普仑司特 （pranlukast)。
本发明中， 优选地， 所述自身免疫性疾病包括多发性硬化、 类风湿关节 炎、 红斑狼疫、 炎症性肠病 ( inflammatory bowel disease )。 经研究发现， 在 EAE小鼠中， CysLTl在免疫组织及脊髓中表达上调， 在血和脑脊液中， CysLTs水平明显增加。 CysLTl 的两个拮抗剂 （扎鲁司特 和孟鲁司特） 给药 EAE小鼠后， EAE小鼠发病时间推迟， 发病症状减轻， 发病率降低， CNS炎症细胞浸润减少。 近一歩研究发现， CysLTl 信号并不 影响致敏 T细胞的分化，很可能是通过增加 MOG特异性 T细胞分泌 IL-17a， 血脑屏障的通透性和诱导 T细胞的趋化导致 EAE的发病，而给予 CysLTl拮 抗剂后， 可以阻断 T细胞的趋化及降低血脑屏障的通透性。 也就是说， 抗哮 喘的 CysLTl 拮抗剂可以用于临床治疗多发性硬化等疾病， 本发明不仅揭示 了 MS发病的部分机制， 同时也为疾病的临床干预提供了新的治疗靶点。 附图说明 图 1为显示 EAE发病过程中 CysLT受体及合成酶的基因表达变化的图。 分别提取免疫后第 5天、第 9天、第 12天、第 15天、第 18天、第 21天 EAE 小鼠及对照小鼠的脾、 淋巴结、 脑及脊髓的 mRNA， 采用实时定量 PCR分 析基因表达。 将同一组织样品中特定基因表达与 β-actin ( β-肌动蛋白） 表达 的比值再与对照相比。 其中， A-D: 在脾 （Α)， 淋巴结 （Β)， 脑 （C ) 和脊 髓（D ) 中 CysLTl和 CysLT2基因表达变化； E-H: 在脾 （E)， 淋巴结 （F)， 脑 （G) 和脊髓 （H) 中 5-LO、 LTA4H和 LTC4S基因表达变化； I： 竞争性 酶免疫法检测脑、 脊髓、 血清、 脑脊液中 CysLTs浓度（免疫后第 10天）。 数 据表示为 mean士 SEM (每组有 6只小鼠：)， 结果为两次独立实验中一次代表 性数据，与对照比较， *p & 0.05, & 0.01 和 & 0.001, (Student's -test)。
图 2为显示 CysLTl受体拮抗剂减轻 EAE的病情的图。 MOG35_55免疫雌 性 C57/B6小鼠诱导 EAE, 从免疫后第 3天 （A和 B)、 第 10天 （C) 或第 14天 （D) 起每天一次腹腔给药 （孟鲁司特 (10mg/kg)、 孟鲁司特 (30mg/kg)、 扎鲁司特 (30mg/kg 至实验结束， 记录临床评分， 对照给予 0.9%生理盐水。 数据表示为 mean 士 SEM, 与对照相比较， 謹 p & 0.001 (双方向方差检验 (two-way ANOVA test)), *p & 0.05, & 0.01, (曼 -惠特尼检验 (Mann- Whitney test)) o E和 F为正常或免疫后给生理盐水及孟鲁司特 （10mg/kg， 第 3天给 药， 第 17天取组织） 的小鼠腰髓组织石蜡切片的 H&E染色 （E) 及快蓝染 色 （F) 图片。 G为正常或免疫后给生理盐水及孟鲁司特 （10mg/kg， 第 3天 给药， 第 17天取组织） 的小鼠腰髓组织冰冻切片的 CD4+ T免疫荧光染色图 片。 E-G左侧方框中的图片放大后置于右侧。 H-J为对 E-G中细胞浸润总数、 CD4+ T细胞浸染数及脱髓鞘面积进行的定量分析， 数据以 mean士 SEM表 示。 每组取 3只小鼠， 每只小鼠脊髓取 20块切片进行分析， 与正常组比较， ***;? & 0.001 ; 与生理盐水对照组比较， 翻;？ & 0.001 (Student's -test)。
图 3为显示孟鲁司特治疗减少 CNS中的致病性 T细胞浸润的图。 A: 用 37-70%硅石胶态悬浮液 （Percoll) 分离出 MOG-EAE免疫后第 17天小鼠的 CNS 浸润细胞总数并用流式仪分析； B : 在正常及 EAE 对照或给药组 ( 10mg/kg)小鼠 CNS中 CD4+ T细胞浸润的流式分析图； C : CNS中 CD4+ T 细胞绝对数的流式分析统计图； D :在正常及 EAE对照或给药组（孟鲁司特， 10mg/kg)小鼠 CNS中 TH1 (IFN-γ阳性)和 TH-17 (IL-17阳性)细胞浸润的流式 分析图； E和 F为流式分析统计图， 表示为 CNS浸润的 TH1和 TH-17的百分 比和绝对值。 数据来自三次独立实验 (mean 士 SEM) , 与正常组比较， *p & 0.05； 与生理盐水对照比较， #;? & 0.05， （Student's -test)。
图 4为显示孟鲁司特给药不影响 T细胞分化但减少 MOG-特异性 T细胞 中 IL- 17a生成的图。 用流式细胞仪分析免疫后第 10天 EAE给药组（孟鲁司 特， 10mg/kg)或生理盐水组小鼠白细胞的亚型。 A和 C : 总体白细胞、 CD4+ T细胞、 CD8+ T细胞和 B细胞的比例； B和 D : 在 CD4+T细胞亚群内 TH1、 TH-17和 Trcg细胞的比例。 E-G: 在分化因子及各种浓度 LTD4或孟鲁司特存 在下， 来源于 8-9周龄小鼠脾内的幼稚型 CD4+ T细胞在体向 ΤΗ1 (Ε)、 ΤΗ-17 (F)或 Treg (G)分化的状况， 数据来自三次独立实验， 表示为 mean士 SEM。 H-K:来自正常及 EAE给予生理盐水或孟鲁司特的小鼠的脾细胞用 MOG35_55 重刺激 48小时后收集上清， 用 ELISA检测 IL-17a、 IFN-γ, IL-4 和 TGF-β 等细胞因子的含量。 数据表示为 mean士 SEM (每组为 5只小鼠：)， 与正常组 对照， *;? & 0.05, ***;? & 0.001 ；与生理盐水对照组比较， mp & 0.01 , (Student's -test)。
图 5为显示 CysLTl拮抗剂阻断 LTD4导致的血脑屏障通透性的增加的 图。 A: 孟鲁司特减少 MOG-EAE小鼠的血脑屏障的渗漏。 如试验方法所述， 利用荧光素钠进入 CNS 量检测血脑屏障的通透性。 小鼠为正常组或 MOG-EAE免疫后第 14天给予孟鲁司特 (10 mg/kg)或生理盐水组。 数据表示 为 mean士 SEM (每组为 3只小鼠）。 与正常组比较， ** &0.001； 与生理盐水 对照组比较， O-Ol o B:在体外共培养血脑屏障模型中，孟鲁司特阻断 LTD4 导致的血脑屏障通透性的增加， 其中， bEnd.3细胞培养在 Transwell穿膜小 室夹层培养体系的上层小室的膜上， 大鼠胶质瘤 C6细胞培养在下层多孔板 内 4-5天。用 LTD4 (100 ?Μ) 或 LTD4 (100 ?Μ) +孟鲁司特（1 μΜ)处理 24小时 后再把荧光素钠加入上层小室内，检测各时间点渗漏入下层孔内的荧光素钠， 数据表示为 mean士 SEM ，数据来源于三次独立实验，每次三复孔。 C: LTD4 减少 bEnd.3 细胞中致密连接蛋白 ZO-1 的蛋白水平， 数据表示为 mean 士 SEM, 数据来源于三次独立实验， 与对照组比较， &0.05。 D， 孟鲁司特抑 制 LTD4引起的 bEnd.3细胞 ZO-1的蛋白水平减少，数据表示为 mean士 SEM, 数据来源于三次独立实验， 与对照组比较， &0.05; 与 LTD4处理组比较， #p & 0.05 (Student's -test)。
图 6为显示孟鲁司特抑制 LTD4对免疫细胞的趋化作用的图。 A: 免疫后 第 10天小鼠脾细胞加入到 Transwell穿膜小室夹层培养体系的上层小室内， 上下层小室以带微孔的膜隔开， 各种浓度的 LTD4加入到下层小室内。 在阻 断实验中， 1 μΜ 孟鲁司特加入到上层及下层小室， 而 100 nM LTD4只加到 下层小室内； 1.5小时后，从上层小室迁移到下层小室的细胞通过流式细胞仪 计数。 B，迁移至下层小室的细胞经表面 CD4染色后流式分析，表述为 CD4+ T细胞的迁移指数。数据来源三次独立实验 (mean士 SEM), 与空白对照组比 较， & 0.001； 与 LTD4 (It)-7 M) 处理组比较， p & 0.01, 漏 p & 0.001 (Student's Mest)。 具体实施方式 下面的实施例和附图用于清楚、 详细地描述本发明的技术方案， 但不以 任何形式限制本发明。
材料与方法
试验动物：
C57BL/6雌鼠购自上海实验动物中心 （上海， 中国） 并饲养于同济大学 实验动物中心 SPF级实验室， 至 8-9周开始实验并维持光-暗 12小时循环交 替， 给以充足的食料和洁净饮水。 所有实验均获得批准， 并按照同济大学的 动物保健委员会的指引进行。
试剂： MOG35 5(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)购自吉泰生化 （上海， 中 国）， 纯度 &95%。 孟鲁司特购自 Merck, 扎鲁司特购自 3B Scientific (武汉， 中国）， M-MLV逆转录酶和 Rnasin核糖核酸酶抑制剂购自 Promega (Fitchburg, WI)。 S YBR Green JumpStart(TM) Taq ReadyMix(TM)试剂盒和荧光素钠购自 Sigma (St.Louis, MO)。 Percoll(TM)购自 GE healthcare。 异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)抗小鼠 CD45， FITC抗小鼠 CD8a, phycoerythrin (PE) 抗 小鼠 CD45R (B220)和别藻蓝素 (Allophycocyanin, APC)抗小鼠 /大鼠 Foxp3 staining set购自 eBioscience (San Diego, CA)。 PE-Cy7抗小鼠 CD4, PE 抗小 鼠 IL17a, APC抗小鼠 IFN-γ, PE抗小鼠 Foxp3和 BD Cytofix/Cytoperm试剂盒 购自 BD bioscience (Franklin Lakes,NJ)。 Dynal(R) 小鼠 CD4细胞负分选试剂盒 购自 Invitrogen (Carlsbad,CA)。 IL-17a、 IFN-γ (γ干扰素）、 TGF-β (转化 生长因子 -β? ) 和 IL-4 (白介素 -4) 的 ELISA试剂盒购自达科为 （深圳， 中 国）。
试验方法：
ΕΑΕ诱导及小鼠给药
8-9周龄雌性 C57BL/6小鼠皮下注射 200μ§ MOG35_55辅以完全弗氏佐剂 及热灭活结核杆菌 (H37Ra菌株， 5 mg/ml, BD Biosciences。 免疫当天为第 0 天。 第 0天及第 2天每只小鼠腹腔注射百日咳毒素 200ng (Calbiochem) o 采 取"双盲法 "（双盲法是指建模和给药是第一个人操作，而评价的是第二个人， 双方在实验未结束前不交流实验结果） 每天为小鼠评分， 评分按 "5 分制" 标准如下： 0分， 无临床症状； 1分， 尾部瘫痪； 2分， 轻度瘫痪 （单侧或双 侧后肢无力， 不完全瘫痪）； 3分， 截瘫（双侧后肢完全瘫痪）； 4分， 截瘫并 前肢无力或瘫痪； 5分， 濒死状态或死亡。
小鼠给药： 从免疫后第 3天、 第 10天或第 14天起经腹腔注射给予孟鲁 司特和扎鲁司特（10-30mg/kg， 溶于生理盐水中）， 直至研究结束。 生理盐水 为阴性对照 （每只 100μ1)。
组织病理与免疫荧光分析
为分析 CNS浸润， 小鼠麻醉后经 PBS灌流及 4%多聚甲醛灌流固定。脊 髓组织样品在 4%多聚甲醛中固定过夜。石蜡包埋后用 Η&Ε染色分析炎症细 胞浸润，用快蓝染色分析脊髓脱髓鞘现象。冰冻切片用抗小鼠 CD4—抗及相 应荧光二抗染色。 实时 -定量 PCR
根据产品说明， 利用 TRIzol (Invitrogen) 提取脊髓、 大脑皮质、 脾细胞 和淋巴结细胞总 RNA, 用六碱基随机引物和 M-MLV逆转录酶 （Progema)逆 转录至 cDNA。利用 SYBR Green JumpStart(TM) Taq ReadyMix(TM)试剂盒 (Sigma) 及各基因引物序列在 LightCycler定量 PCR仪 (Stratagene)上进行实时 -定量 PCR检测各基因表达情况。 引物序列如下：
CysLTl上游弓 1物： 5，-CTCCAAGGCACCAAGCAGAC-3， ，
CysLTl下游弓 1物： 5，-TGCCAAAGAAACCCACAACAG-3， ；
CysLT2上游引物： 5，- CGAAGGCAGAGGCACAGATT-3， ，
CysLT2下游引物： 5，-GAACCAAATCACTGAAGTATGCCT-3， ； 5-LO上游引物： 5，-CACGCATCTGGTGTCTGAGG-3， ，
5-LO下游引物： 5，-CCTTAGTGTTGATAGCAATGGTGA-3， ；
LTA4H上游引物： 5，-CCTATGAGAAGGGCTTTGCG-3， ,
LTA4H下游引物： 5，-CGTAGAGCCAGGTGTTCCAAT-3， ；
LTC4S上游引物： 5，-CCTGTGCGGACTGTTCTACCT-3， ，
LTC4S下游弓 1物： 5，-GCCATCGCCACCAGCA-3， ；
β- actin上游引物： 5，-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3， ，
β- actin下游引物： 5， -CC AGTTGGTAAC AATGCCATGTT-3， 。
半胱氨酸-白三錄酶免疫分析法
使用竞争性酶免疫分析法 （EIA, Cayman chemical) , 根据产品说明检测 脑、 脊髓、 血清及脑脊液中的半胱氨酸-白三烯含量。 对于脑及脊髓样品， 组 织在甲醇中匀浆后离心去除沉淀蛋白， 上清真空干燥后用于检测。 血样采自 眼眶， 取血后在 4°C静置 30分钟， 4500g离心 10分钟后收集上清即为血清。 毛细管自枕骨大孔收集脑脊液。脑及脊髓样品中， 半胱氨酸-白三烯含量表述 为每毫克 （mg) 组织样品中的匹克 （pg)数， 然后与正常对照小鼠的数值相 比； 血清和脑脊液样品中， 半胱氨酸 -白三烯含量表述为每毫升（ml)液体中 的匹克 （pg) 数， 并与正常小鼠数值相比。
CNS浸润白细胞分离及分析
用组织匀浆器在冰上将脊髓及脑组织匀浆后用 70μιη细胞过滤器滤过， 细胞悬液在 4°C 500g离心 10分钟后， 用 8ml 37% Percoll试剂重悬， 小心加 入到 4ml 70% Percoll试剂中， 在 25 °C 780g条件下离心 25分钟。 收集位于 37%?70% Percoll 中间层细胞并进行流式检测。
CD4+ T细胞分离和体外分化
用磁珠分离 8-9周龄 C57BL/6小鼠脾中幼稚型 CD4+ T细胞， 分离后的 CD4+ T细胞加入抗 CD3 (2 g/ 145-2C11; BD Pharmingen)和抗 CD28 (2 μ^ιη?; 37.51; BD Pharmingen)抗体激活后分别加入 IL- 12 (10 ng/ Peprotech) 和抗 -IL-4 (10 g/ 11B11; BD Pharmingen)诱导分化为 TH1 细胞， 及加入 TGF-βΙ (5 ng/ Peprotech)、IL-2 (50 U/ Peprotech) 和 抗 -IFN-γ (10 μ^ιη?; XMG1.2; BD Pharmingen)诱导分化为 Trcg细胞， 或加入抗 -IL-4、 抗 -IFN-γ及 含 TGF-βΙ (3 ng/ml)、 IL-6 (30 ng/ eBioscience)、 月中瘤坏死因子 (tumor necrosis factor) (10 ng/ Peprotech) 禾口 IL-Ιβ (10 ng/ Peprotech)的 TH-17 "分化因子组合"来诱导分化为 TH-17细胞。 各种浓度的 LTD4及孟鲁司特同 时加入以评估其对 T细胞分化的影响。
流式细胞检测
脾细胞或 CNS 浸润细胞与 12-十四酸佛波酯 -13-乙酸盐 (phorbol 12-myristate 13 -acetate) (50 ng/ Sigma), 伊屋诺霉素 (ionomycin) (750 ng/ Sigma)和布雷菲德菌素 A(brefeldin A) (1.0 μ^ιη?; Sigma) 混合后在 37°C孵育 5小时， 用相应抗体染细胞表面标记物。 表面染色后细胞重悬于固定 /通透液 (Cytofix/Cytoperm试剂盒； BD Pharmingen)中， 胞内染色按产品说明操作。对 于 Foxp3染色， 细胞不用 phorbol 12-myristate 13-acetate 禾 Π ionomycin朿 lj激， 而是使用 Foxp3染色试剂盒并按产品说明操作。结果用 Guava easyCyte(TM) 8HT 流式细胞仪和 GuavaSoft软件进行分析。
MOG-特异性细胞因子 ELISA检测
正常对照小鼠或 EAE给生理盐水或孟鲁司特的小鼠在免疫后第 10天处 死， 脾取出后用红细胞裂解液处理， 然后 1000g离心 3分钟收集白细胞。 白 细胞在含 10% FBS的 DMEM培养基中重悬， 以 2 X 105/孔 /100 μ?铺在 96孔 板中， 用 MOG35_55 (20 μ8/ιη1) 重刺激细胞 48小时， 收集上清后根据特定的 ELISA试剂盒，按照产品说明，分别检测其中的细胞因子 IL-17a、 IFN-γ, IL-4 和 TGF-β 的含量。
在体血脑屏障通透性检测 按照文献描述的方法， 以荧光素钠为示踪分子在体内检测血脑屏障通透 性 (21)。 简言之， 小鼠腹腔注射 ΙΟΟμΙ 10%的荧光素钠， 45分钟后， 心脏抽 血， PBS灌流。 脑与脊髓称重后在 1.5ml冷 7.5%三氯乙酸匀浆后 10,000g离 心 10分钟去除可溶性沉淀。 上清再用 7.5%三氯乙酸中以 1： 10稀释。 加入 0.25ml 5N NaOH 后， ΙΟΟμΙ 上清样品荧光值由 Flexstation 多孔板酶标仪 (Molecular Devices)测定， 激发波长为 485nm， 发射波长为 530nm。 荧光素纳 标准品（0.064— 10(^g/ml)用于绘制标准曲线以计算样品中荧光素钠的含量。 CNS 的荧光值先与同只动物中的血清荧光值相比后再与正常对照鼠进行比 较。
体外血脑屏障实验
体外共培养血脑屏障实验采用 0.4μιη 孔径， 12mm 大小的穿膜小室 (Transwells, Corning) (22-23)。 小室隔膜用层粘连蛋白（laminin) (sigma) 包 被 30分钟后， 将鼠脑微毛细管内皮细胞 bEnd.3以 6.0 X 104个细胞 /cm2的密 度铺入每个小室内， 大鼠胶质瘤 C6细胞 P.O X IO4)铺于下层 12孔板内。每两 天培养液换液， 4-5天后移去培养液，上层小室用 PBS洗后加入 0.5ml含 1% BSA 的缓冲液，并分别加入 LTD4 (100 nM) 或 LTD4 (100 nM) + 孟鲁司特 (1 μΜ) ο 甲醇 (0.1%)为阴性溶剂对照。 下层孔内液体与上层小室内液体一样。 孵育 24小时后， 上层小室内加入 20 ^ 10 mg/ml 荧光素钠，按固定时间点从 下层孔内取出 ΙΟΟμΙ 液体进行荧光检测后再放回孔内。 样品荧光值由 Flexstation多孔板酶标仪 （Molecular Devices)测定，激发波长为 485nm，发射 波长为 530nm。
Western blot
培养 48小时后， bEnd.3细胞用阴性溶剂对照（0.1%甲醇）， LTD4 (100 ?Μ), 或 LTD4 (100 nM) + 孟鲁司特 (1 μΜ)处理后， 细胞用 PBS洗后在裂解液 (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Chaps, 1 mM EDTA, 1 mM NaF, 1 mM Na3V04 和蛋白酶抑制剂:)中裂解， 冰上超声 30秒， 用二辛可宁酸蛋白定量 法 （BCA法） 定蛋白浓度。 等量蛋白样品上样， SDS-PAGE电泳分离后电转 到 PVDF膜。 Western blot采用鼠抗 ZO-1抗体及相关 HRP-标记的二抗。
体外趋化实验采用 5 μιη孔径穿膜小室 （Transwells, Corning) , 免疫后 第 9天 EAE小鼠脾细胞分离后用含 1% BSA的 RPMI-1640培养液预孵 0.5 小时， 细胞洗后用含 20 mM HEPES和 0.5% BSA的 RPMI-1640培养液稀释 成密度为 1 X 107细胞 /ml悬液。 各浓度 LTD4加入到下层孔内而 100 μ?细胞 悬液加入到上层小室内。 对于趋化阻滞实验， 1 μΜ 孟鲁司特分别加入到下 层孔及上层小室内， 100 nM LTD4 则加入至下层孔内。 正常培养 1.5小时后 迁移至下层孔内的脾细胞用流式细胞仪计数。
数据表示为 mean± SEM， EAE 小鼠处理组间统计学差异用 two-way ANOVA test分析，时间点内 EAE评分统计学差异用 Mann- Whitney test分析。 其他数据分析如基因表达， 细胞因子生成后病理学统计分析用 Student's t-test 分析。 p & 0.05为有统计学意义。
EAE发病过程中 CysLT信号通路的关键蛋白表达上调
本发明用 MOG35_55免疫 C57BL/6小鼠诱导 EAE。为阐明 CysLTs是否与 EAE发病有关， 本发明检测了与 CysLTs生成及信号转导有关的几个蛋白质 的基因表达情况， 包括 2个受体 （CysLTl 和 CysLT2 ) 和 3个酶 （5-LO , LTA4H禾 n LTC4S)在 EAE免疫后第 5、 9、 12、 15、 18和 21天的表达水平。 在脾和淋巴结 （图 1A和 1B)， CysLTl从免疫后第 5天， 也就是发病临床前 期就出现了明显上调。 在脾内， CysLTl在 EAE开始发病 （免疫后第 12天） 时表达致最高点， 然后慢慢下降 （图 1A)。 在淋巴结， CysLTl表达上调并维 持在一个平台。 而在脑组织 CysLTl的表达只在 EAE发病后 （第 15天， 图 1C) 出现一轻微但有明显差异的上调。 在脊髓组织中， CysLTl随着 EAE发 病开始表达上调， 并在整个发病过程中持续升高 （图 1D)。 相反， CysLT2 只在脑中第 5天及第 9天有过轻微但有明显差异的上调， 而在其他时间点及 其他组织中均未见表达变化 （图 1A-D)。 由于 CysLTs是由游离花生四烯酸 经 5-LO和 LTC4S水解而来，接着发明人分析了 5-LO和 LTC4S的表达情况。 在脾内， 5-LO mRNA水平从免疫后第 5天开始增加， 到第 9天达到平台（图 1E)。 在淋巴， 5-LO从第 9天开始表达上调， 免疫第 12天后表达上调到一 个相对稳定的水平（图 1F)。在脊髓， 5-LO 随着病情进展表达平行升高（图 1Η) ο 与之相反， LTA4H只在脾内有明显上调 （图 1E)， 而 LTC4S在所有组 织中均未见有明显改变。 而在脑内， 所有酶均未见有明显改变 （图 1G) 接下来发明人用竞争性酶免疫检测法检测了 CysLTs的水平，与对照鼠比 较， EAE鼠免疫后第 10天 CysLTs在血清及脑脊液中的水平有明显升高。 在 脑及脊髓组织中 CysLTs的浓度变化虽未见明显差异，但也有增高的趋势（图 11)。 MOG免疫后受体及配体均升高表明 CysLTs与其受体 CysLTl 可能在 EAE发病过程中扮演某种角色。
CysLTl 剂减轻 EAE的临床症状及 CNS浸润
为进一歩评价 CysLTs信号通路在 EAE发病过程中的作用， 我们利用 CysLTl受体的两个拮抗剂（孟鲁司特和扎鲁司特， 目前主要用于哮喘临床治 疗） 来治疗 MOG诱导的 EAE小鼠。 腹腔注射给药从免疫后第 3天 （图 2A 和 2B )、第 10天 (图 2C)或第 14天 (图 2D)开始直至实验结束，对照组注射 0.9% 生理盐水。 免疫后第 3天或第 10天开始给予孟鲁司特可剂量依赖性地抑制 EAE的病情并出现 （图 2A和 2C)。 扎鲁司特 （30mg/kg) 也显著减轻 EAE 的病情 （图 2B和 2C)。 并且即使在发病后给药， 孟鲁司特 pO mg/kg)仍能减 轻 EAE的病情， 显示该药具有预防及治疗 EAE的作用。
在免疫第 17天的脊髓组织中，与对照组相比，孟鲁司特可明显减少白细 胞对脊髓的浸润。快蓝染色显示生理盐水对照组的 EAE小鼠脊髓白质出现广 泛的脱髓鞘现象， 而给予孟鲁司特后脱髓鞘现象明显减少 （图 2F和 21)。 原 位免疫荧光染色的结果显示， 孟鲁司特给药后能明显减少 EAE 小鼠脊髓中 CD4+ T细胞的数量。
发明人利用流式分析技术对免疫后第 17天 CNS白细胞浸润情况进行了 进一歩验证。 孟鲁司特给药后总的 CNS浸润数 （图 3A) 和 CD4+ T细胞在 CNS的聚集都减少了（图 3B和 3C)。 TH- 17 和 TH1是 EAE主要的致病 CD4+ T细胞（24)。 孟鲁司特给药后， TH1的绝对数及百分比均明显下降 (图 3D和 3E)。 虽然 TH-17在浸润的 CD4+ T细胞的百分比没变， 但 TH-17细胞的绝对 数明显减少 （图 3D和 3F)。 综上所述， 给予 CysLTl拮抗剂阻断 CysLTl信 号通路后， 能明显减少 CNS 的炎症细胞浸润及脱髓鞘现象， 从而显著减轻 EAE的病情。
CysLTl信号不影响体内及体外 T细胞的分化
接着发明人检测 CysLTl信号转导是否影响 T细胞的分化。在 EAE小鼠 中， 孟鲁司特并不明显改变脾及血中白细胞 (CD45+细胞：)、 CD4+ T细胞、 CD8+ T细胞和 B细胞的比例 （图 4A和 4C)。 EAE小鼠给予孟鲁司特或生理盐水 后， TH1、 TH-17或 Trcg细胞在 CD4+细胞中的比率也无差异 （图 4B和 4D)。 利用体外分化实验发明人进一歩检测 CysLTs 或孟鲁司特是否直接影响 TH1、 TH-17或 TRCG分化。 从 8-9周龄雌性 C57BL/6小鼠脾细胞中用免疫磁珠分选 出幼稚型 CD4+ T细胞， 用抗 -CD3和抗 -CD28抗体激活后加入不同分化因子 及各种浓度的 LTD4 (0.1, 0.3和 1 μΜ)和孟鲁司特（1, 3和 10 μΜ)， 将细胞 诱导分化为 TH1、 TH-17或 TRCG细胞。三天后收集细胞进行胞内 IFN-Y、 IL-17a 或 Foxp3的染色。 流式分析后发现 LTD4和孟鲁司特并不影响 TH1 (图 4E)、 TH-17(图 4F)或 Treg细胞 (图 4G)的体外分化。
接着发明人想检测孟鲁司特是否影响 MOG重刺激时脾细胞的细胞因子 分泌能力。 给予孟鲁司特或生理盐水的 EAE鼠在免疫后第 10天处死， 脾细 胞分离后用 MOG35_55 (20 μ^ιη?) 在 37°C重刺激 48小时。上清收集后用 ELISA 测定 IL-17a、 IFN-γ, IL-4 和 TGF-β含量（25-26)。 如图 4H所示， 孟鲁司特 可明显减少 IL-17a的分泌， 而 IFN-Y、 IL-4 和 TGF-β等因子的水平无明显影 响。 综上所述， CysLTl信号不影响炎症 T细胞或调节 T细胞的增殖或分化， 但能减少 MOG特异性 TH-17细胞因子生成。
孟鲁司特减轻 LTD4诱导的血脑屏障损伤
发明人的实验结果显示孟鲁司特可以抑制白细胞浸润， 但同时发明人并 未发现外周免疫组织中 T细胞数量有明显变化， 基于以上观察， 发明人推测 孟鲁司特可能影响白细胞的浸润过程。 由于血脑屏障的通透性的改变与 EAE 临床症状的严重程度有相关性 (3)， 且已有报道 CysLTs能增加微血管的通透 性 （27-28)， 发明人推测是否 CysLTl受体激活后会导致 EAE血脑屏障的通 透性增加。 发明人采用荧光素钠作为一种示踪分子用于检测血脑屏障的完整 性（3 )。 与正常小鼠相比， 荧光素钠可以明显从外周血渗漏入到免疫后第 14 天 EAE小鼠的脊髓（9.3倍）和脑（1.95倍）， 而孟鲁司特可明显减少荧光素 钠从外周血至脊髓的渗漏 （图 5A)。
随后发明人用 bEnd.3和 C6体外共培养的血脑屏障模型检测 CysLTs对 血脑屏障的影响（22-23 )。与对照组相比， LTD4明显增加荧光素钠的通透性， 即增加体外血脑屏障模型的通透性。 与体内观察一致， 通透性的增加可以被 孟鲁司特抑制 （图 5B)。 CNS毛细血管内皮细胞形成致密连接， 有助于维持 血脑屏障的低通透性（29)。致密连接的完整性直接决定了血脑屏障的通透性 (30)。 根据 western blot分析发现， LTD4处理 24-36小时后， bEnd.3细胞上 致密连接蛋白 ZO-1的水平明显减少（图 5C)。给予孟鲁司特后，减少的 ZO-1 水平几乎完全恢复 （图 5D)。 这些结果表明 LTD4可以通过减少致密连接蛋 白 ZO-1 , 从而增加血管通透性。 而孟鲁司特可阻断 LTD4导致的体内或体外 血脑屏障渗漏。
孟鲁司特阻断 LTD4诱导的白细胞趋化
血脑屏障通透性是影响白细胞浸润的一个重要因素， 而趋化也有可能在 白细胞浸润中扮演重要角色。 已有报道阻断白细胞趋化可以减轻 EAE病情 (31-32)。 而有报道 CysLTs对嗜酸性粒细胞（33 )及单核细胞（34)具有趋 化活性， 发明人想知道是否它也能诱导 EAE中的致敏 T细胞的趋化活性。 利用穿膜小室实验， 发明人发现 LTD4对免疫第 10天 EAE小鼠的脾细胞具 有明显的剂量依赖的趋化活性。而 LTD4在 100 nM浓度具有最高趋化活性（图 6A)， 这种钟形的剂量反应曲线在许多趋化剂中可见。 正如预期， 孟鲁司特 给药可以减少 LTD4诱导的脾细胞趋化活性 （图 6A)。 而且， 对趋化入下层 孔板的脾细胞进行表面染色分析， 发现与全脾细胞相比， LTD4对 CD4+ T细 胞有更强的趋化活性（2.7倍对 1.6倍）。 孟鲁司特给药几乎完全抑制了 LTD4 对 CD4+ T细胞的趋化。 这些结果与发明人观察到 CysLTl受体在 EAE小鼠 脾及血中上调， CysLTs在脑脊液中明显增加是相吻合的。 结果表明 LTD4对 白细胞，尤其是 CD4+ T细胞的趋化，有助于 CNS浸润及最终参与 EAE的发 病。
作为一种器官特异性自身免疫性疾病， MS主要表现为 CNS慢性炎性脱 髓鞘病变， 是目前年轻人中非创伤致神经功能障碍的最主要原因（35)。 由于 MS病因不明， 治疗仍存在很多困难， 急需确定新的治疗靶点 （36)。 G蛋白 偶联受体（GPCRs)是最大的受体超家族， 成员超过 1000， 它们广泛参与各 种生物活动并与许多人类疾病相关（37)。由于其重要的生理作用及定位于细 胞表面， GPCRs 是目前市场上最重要的药物作用靶点 （38)。 最近， 芬戈莫 德 (FTY720), —种 1-磷酸-鞘氨醇受体激动剂， 已被美国 FDA批准为第一种 口服、 治疗复发性 MS的一线药物。 在一个一年期的三期临床研究中， 其疗 效好于一线药物 IFN-pia (39)。 也有报道其他许多 GPCRs参与了 MS的发 病，包括前列腺素 E2受体 EP2和 EP4(40)，血管紧张素 II型 -la受体 (ATlaR) (41 ) 和激肽受体 Bl(Bdkrbl) ( 31 ) 及许多趋化因子受体 （42-43 )。 在此， 本发明人发现， 在 EAE小鼠中， CysLTs信号转导的关键蛋白， 包括受体及配体生成关键酶均表达上调， 两个 CysLTl 受体拮抗剂 （孟鲁司 特和扎鲁司特） 可有效减轻 EAE病情。
CysLTs主要由肥大细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞产生。 CysLTs在哮喘、 过敏性鼻炎及其他呼吸道疾病中扮演重要角色。 有少量报道 显示，抑制白三烯合成的相关酶（例如 cPLA2a或 5-LO)并不会减少 IFN-γ 或 IL-17a 的生成 （19 )， 这些研究正与发明人的研究结果是一致的， 即阻断 CysLTl能减轻 EAE的病情，但不影响 TH1 或 TH-17的细胞分化。相反， BLT1、 LTB4的受体可能对 TH1/TH-17的生成是必须的， 因为 BLTT 鼠显示 EAE发 病延迟， EAE症状减轻， TH1和 TH-17细胞因子水平减少 （12)。
虽然孟鲁司特阻断 CysLTl并不影响 T细胞的分化， 而发明人确实发现 该药能明显减少 TH1和 TH-17浸润入 EAE小鼠 CNS中， 因此推测 CysLTl 信号应该影响 T细胞浸润过程，而在炎症反应中趋化作用对 T细胞聚集起关 键作用 （44)。 在 EAE小鼠中， 效应 T细胞起源于外周淋巴结中， 必须迁移 进 CNS激发炎症， 而趋化因子及其受体参与 T细胞的浸润及 EAE的发病是 已知的。 如 TAK-779、 CCR5的拮抗剂并不影响 T细胞功能， 而是通过减少 炎症细胞迁移入 CNS而减轻 EAE病情 （45)。 特定抗体阻断 CXCR3也抑制 T细胞迁移， 从而抑制 EAE继承转移模型的发病 （42)。 也有报道称 CCR6 对于 TH-17进入 CNS及 EAE发病是需要的 （46)。 在研究中， 发明人发现 LTD4对 MOG-EAE小鼠脾细胞显示出剂量依赖的趋化活性，而且与全脾细胞 相比， LTD4对 CD4+ T细胞的趋化活性更强。 这些结果与 CysLTl受体在免 疫组织中表达上调及 CysLTs在 EAE小鼠脑脊液中明显升高吻合。也就是说， 孟鲁司特能阻断 LTD4诱导的 T细胞迁移， 有助于治疗 EAE。
另一个影响浸润过程的是血脑屏障的通透性。 血脑屏障通透性与 EAE 的临床表现之间有明显关联 （21 )。 已有报道表明高浓度的 CysLTs在酵母多 糖引起腹膜炎发病初期可增加血管通透性（47)。 其他研究也显示 CysLTl拮 抗剂， 包括孟鲁司特， 可能通过抑制毛细血管的通透性从而抑制肿瘤代谢 (27)。 因此发明人设想 CysLTl信号可能在 EAE发病时有助于血脑屏障的 破坏， 这种破坏可被孟鲁司特所阻断。确实， 发明人发现 EAE小鼠血脑屏障 的通透性明显增加， 特别是在脊髓， 这与前人报道是一致的 （3 )， 而孟鲁司 特给药可以抑制 EAE小鼠血脑屏障通透性的增加。利用体外血脑屏障模型实 验， 发明人直接证明 LTD4可以增加血脑屏障的通透性， 并且这种现象可以 被孟鲁司特阻断。
CNS毛细血管内皮细胞间的致密连接是血脑屏障重要的结构组分（48)。 致密连接是由密封链组成的分支网络， 密封链是由纤维状蛋白质结构植入脂 质双分子层构成的。致密连接相邻细胞膜并消除胞间隙，避免物质自由扩散。 完速描膜蛋白如 claudins, 和细胞质斑块蛋白 ZO-1/ZO-2 之间的相互作用， 对于致密连接的稳定是至关重要的 （49)。 鼠内皮细胞 ZO-1基因靶向破坏及 ZO-2 蛋白 RNAi敲除可导致致密连接形成缺失 （50)。 发明人也发现 LTD4 处理导致 bEnd.3 鼠大脑内皮细胞 ZO-1 蛋白的明显减少， 这可能导致 EAE 小鼠血脑屏障通透性的增加， 而且在 EAE小鼠的血清及脑脊液中 CysLTs水 平升高。 孟鲁司特治疗能阻断 ZO-1 蛋白的丢失， 保证血脑屏障的完整性， 但是 LTD4如何介导 ZO-1蛋白的丢失还有待研究。前人研究显示 PKC和 p38 信号通路激活能导致 ZO-1蛋白的丢失， 增加血脑屏障的通透性（51-52)。其 他人也报道内源性 CysLTs能增加胞内钙流， 激活 PKC、 p38和 PI3K ( 53 )， 因此 CysLTs可能是通过激活 PKC和 p38导致 ZO-1蛋白的减少。
迄今，累见 CysLTs涉及呼吸性和炎症性疾病，但很少提及其在自身免疫 性疾病中的作用， 在此， 发明人发现了 CysLTs在 EAE发病时调节 T细胞趋 化及血脑屏障的通透性， 同时也证明了两个目前用于治疗哮喘的 CysLTl 拮 抗剂能减少 CNS炎症细胞浸润， 减轻 EAE临床症状， 并且发现即使在疾病 进程中给药， 孟鲁司特也表现出明显的治疗疗效。 目前老药新用是创新药物 发现的重要来源， 本发明不仅揭示了 MS发病的部分机制， 同时也为疾病的 临床干预提供了新的治疗靶点及新的药物。
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