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第六章酶与细胞固定
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固定化酶反应器及其在蛋白质组研究中的应用
日 22:01:27 Tuesday&&
作者：马俊锋
【关键词】& 固定化酶反应器,蛋白质组,综述
　　摘要& 综述了近年来国内外酶固定化载体的研究进展, 侧重于无机材料和有机聚合物材料上的固定化酶方法；此外，也介绍了固定化胰蛋白酶反应器与分离系统联用在蛋白质样品分析中的应用，并展望了固定化酶反应器的研究方向及其在蛋白质组中的应用前景。
　　关键词& 固定化酶反应器，蛋白质组，综述
　　1& 引言
　　人类基因组计划的完成，标志着生命科学研究进入了后基因组时代。生命科学研究的重点已从以基因结构为主的结构基因组转向以功能为主的功能基因组。作为功能基因组研究的主要内容之一，蛋白质组学已成为21世纪生命科学研究的焦点之一。蛋白质组是指一个基因组所编码的全部蛋白质，或者一个细胞、一种组织或一种生物体所表达的全部蛋白质。过去几年里，蛋白质组研究普遍采用的方法是，基于二维凝胶电泳对数千种蛋白质进行分离、染色获得蛋白质谱，将蛋白质斑点转移、酶解后通过生物质谱鉴定获得结构信息。但是，由于蛋白质二维凝胶分离、染色转移等环节操作困难，且费时费力，已成为蛋白质组研究的技术“瓶颈”之一。 为此，人们又发展了蛋白质组研究的其它新技术。其中最引人注目的方法之一就是基于多维色谱的“鸟枪法”（shotgun method），即总蛋白提取、蛋白酶切后用二维液相色谱串联质谱联用来鉴定蛋白质的方法。将整体蛋白转化为肽段，综合离子交换色谱和反相色谱的分离能力和质谱的质量分辨及序列分析能力，显著提高了蛋白质鉴定的通量和自动化程度[1]。 然而,“鸟枪法”也不能完全满足蛋白质组分析的需要。近年来，一条技术路线得到了高度重视，即蛋白质经多维色谱分离后直接流经固定化酶微反应器，这样分离后的蛋白质得以快速酶解后再直接用质谱鉴定。该技术路线的核心和瓶颈技术就是固定化酶微反应器，一旦得以突破，这一技术路线将是shotgun技术的有力补充或替代方法。
　　作为化学酶工程的一个重要分支，酶的固定化是指通过吸附、包埋、交联、共价接合等方法使目标酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化作用[2]。与溶液中的蛋白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、更高的酶解效率、可重复使用并能减少酶的自身降解等优点[3]。因此，蛋白的在线酶解使得蛋白的鉴定可以更快速、更自动化地完成。此外，使用固定化酶反应器还可以避免样品的手工处理，从而也就减少了蛋白样品被污染的可能性。所以，固定化酶反应器在科学研究与生产实践中得到了越来越多的应用。目前，胰蛋白酶、脂肪酶、酪氨酸酶、鸡肝酯酶和纤维素酶等已被固定化后用于生命科学和药学的研究中[4～6]。其中，胰蛋白酶因为具有高度特异性的切割位点（精氨酸和赖氨酸的羧基参与形成的肽键），而被广泛用于多肽和蛋白质的分析研究中。
　　本文针对固定化胰蛋白酶反应器的制备及其在蛋白组学研究中的应用进行了系统的评述。
　　2& 固定化胰蛋白酶反应器的制备
　　固定化酶有很多优点，但其性能与固载材料和固定化方法密切相关[7]。固定化酶所使用的载体材料大致可以分为无机材料、有机聚合物材料和其它材料３大类[８，9]。
　　2.1& 无机材料上的胰蛋白酶固定化
　　2.1.1& 颗粒材料上的胰蛋白酶固定化& 在以无机材料作为胰蛋白酶固定化载体的研究中，硅胶具有重要的地位。长期以来，硅胶基质一直是高效液相色谱（HPLC）常用的固定相。在硅胶基质上固载胰蛋白酶使样品的在线酶解与分离成为可能。Thelohan等[10]首次将胰蛋白酶固定在硅基质上。他们先将一种疏水性的聚合物共价键合于１５ μm粒径的硅颗粒（孔径３０ nm）上，随后用戊二醛的一端连接于聚合物而另一端用来固定胰蛋白酶。采用该方法可以保持固定化胰蛋白酶的催化活性。
　　2.1.2& 整体材料上的胰蛋白酶固定化& Tanaka等[11，12]在硅胶基质整体材料的研究方面做了大量的工作。他们的实验表明，在聚乙二醇存在的情况下，四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷在醋酸溶液中水解即可形成具有网络结构的硅胶基质整体材料。当硅骨架网络结构形成以后，在适当条件下再用氨溶液处理即可形成中孔结构。与颗粒填充柱相比，硅胶基质整体材料的硅胶骨架更小、通孔更大，因此传质速率更快。 Tanaka等[13]制备了一种十八烷基甲氧基硅烷化的多孔硅胶基质整体材料，该材料含有约1.7 μm 的通孔和1 μm的中孔硅骨架。Calleri等[14]发展了一种以该材料为载体的胰蛋白酶反应器。他们先将制备的硅基质整体柱进行环氧化衍生，再用胰蛋白酶对环氧基团进行化学修饰。此外，他们还计算了环氧基的表面覆盖率和固定化的酶量，并探讨了流速、接触时间、温度、缓冲液类型以及缓冲液浓度等多种参数对胰蛋白酶活力的影响。Calleri等[15]又以商品化的、还氧基修饰的Chromolith Flash硅胶整体柱（4.6 mm i.d.×25 mm）为载体，通过共价作用将胰蛋白酶固定于其上。
　　2.1.3& 毛细管内壁的胰蛋白酶固定化& 邹汉法等[16]制备了一种纳升级酶反应器。通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）分析酶解产物, 获得了蛋白质的肽谱。实验结果表明，以毛细管为反应器，10-13mol甚至10-15mol的量就可满足分析要求，从而可以大大减少蛋白质肽谱分析所需样品量。Kuhr等[17]充分利用生物素与抗生物素蛋白之间的特异性相互作用，也制备了一种基于毛细管内壁的胰蛋白酶反应器。他们先用（3氨丙基）三乙氧基硅烷将毛细管内壁的硅羟基活化，然后通过生物素抗生物素蛋白生物素的作用将生物素标记的胰蛋白酶固定于毛细管内壁。使用该方式可以获得具有高度稳定性和催化活性的酶反应器。&&& 　　2.1.4& 纳米材料上的胰蛋白酶固定化& 随着钠米技术的快速发展，钠米材料作为一类新颖的载体的研究也受到了研究人员的密切关注[18]。现在，已用作蛋白酶固定化载体的钠米材料主要有钠米颗粒、钠米纤维、中孔硅材料等。Chen等[19]用苯乙烯、异丙基丙烯酰胺、N羟基琥珀酰亚胺合成了一种核壳型乳胶颗粒，而后将胰凝乳蛋白酶通过共价作用固定到该颗粒上。实验发现，由于单位质量的钠米颗粒有较大的表面积，因此酶的固载量可达10%。Kim等[20]以戊二醛为交联剂，使钠米纤维上包被了胰凝乳蛋白酶的聚集体。实验表明，通过这种方式制备的酶反应器的活性比仅在钠米纤维上键合了一层胰凝乳蛋白酶分子的酶反应器活性高9倍。Diaz等[21]将酶固定到了一种中孔材料MCM41上，他们发现，以该材料为载体时，酶的固定化与酶的分子大小有关，较小的酶分子更容易得以固定。由于MCM型材料通常仅适合较小的酶分子，Zhao［２２］及SchmidtWinkel等[23]发展了SBA15、MCF型材料，使介孔材料更适合进行酶的固定化。Wang等[24]在吸附硅基质介孔材料外包被了有机无机复合壳，使酶的固载量和稳定性都得以提高。
　　2.2& 有机聚合物上的胰蛋白酶固定化
　　2.2.1& 聚合物颗粒上的胰蛋白酶固定化& PerSeptive Biosystems Inc.( Framingham, MA)发明了一种新型的有机聚合物填料（PorosTM）。其成分是同时具有大的通孔和小的扩散孔的共价交联的聚（苯乙烯二乙烯基苯）。该公司生产的PoroszymeTM就是通过在20 μm的PorosTM颗粒上固定胰蛋白酶制成的。他们进一步推出了填充PoroszymeTM的卡盒用于蛋白质样品的在线快速酶解和表征。目前，这种材料已在蛋白样品的分析中得到了一些应用[25，26]。
　　2.2.2& 聚合物膜上的胰蛋白酶固定化&&&& Michaels首次提出了酶膜反应器的概念[27]。酶膜反应器能将酶的催化特性与膜材料的优良分离性能相结合，使酶解反应和产物分离同时进行。从而有效地加速反应，突破化学平衡限制，提高转化率。邹汉法等[28]通过在甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生化纤维素膜上结合胰蛋白酶的方法，制备了固定化胰蛋白酶微升反应器，并通过与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱联用进行了蛋白质的肽谱分析。研究结果表明，反应1 h后样品中未被水解的蛋白质已很少。随后，他们[29]又用HPLC系统研究了这种胰蛋白酶反应器的相关性质。发现在最适条件下，固定化胰蛋白酶每克干膜的活力达17800 U/g干膜，蛋白固载量为3.6 mg/g干膜。在40℃下固定化酶在24 h内活性没有显著变化；在4℃下保存100 d仍有90%以上的水解活力。此外，他们[30]还用高效前沿分析法对这种酶反应器的酶活性及酶动力学进行了表征。实验结果表明，固定的胰蛋白酶的水解活性是自由溶液中酶活性的55.6%；测得的表观米氏常数和最大反应速率分别为 0.12 mmol/L及每毫克酶0.079 mmol?L－１?min－1。前者与静态或离线测得的数值很接近，后者比静态测得的值高大约15%。
　　微型酶反应器不仅可以提高蛋白质酶解反应速率，而且也有利于发展高通量的样品处理方法[31]。因此，将胰蛋白酶反应器集成到微流控芯片等微全分析系统的研究越来越受到人们的关注。Gao等[32]搭建了一个微型化膜反应器与瞬间等速电泳毛细管区带电泳质谱（CITP/CZEESIMS）在线分析平台。他们利用聚偏二氟乙烯（PVDF）与蛋白分子强烈的相互作用，将胰蛋白酶吸附在多孔PVDF膜上，而PVDF膜又与PDMS基质的微流控通道相连接。样品被注射器泵推过膜时被胰蛋白酶水解，得到的肽段经CITP聚焦后再被CZE分离，最后进入ESIMS分析。使用该装置可以在几分钟内进行蛋白质的鉴定，而且消耗的蛋白量在纳克级。Cooper等[33]将微型化的胰蛋白酶PVDF膜反应器（2 mm×5 mm）缠绕于聚合物套箍（一种毛细管组件）上制备了胰蛋白酶反应器。该反应器可在几秒钟内完成蛋白质的酶解，消耗的蛋白质的量少于5 fmol，而且毛细管接口使其可以容易地与各种分离方法及质谱检测器联用。
　　2.2.3& 聚合物整体材料上的胰蛋白酶固定化& 目前，在聚合物整体材料上固定化胰蛋白酶已成为酶固定化的研究热点之一。早在上世纪80年代，Hjerten等[34]采用“连续聚合物床层”来描述由甲基丙烯酸和N，N′甲叉双丙烯酰胺形成的大孔凝胶。Petro等[35]首次在聚(甲基丙烯酸酯乙烯基二甲基丙烯酸酯)整体柱材料上固定化胰蛋白酶，并将其与在以同样材料制备的微珠上固定的胰蛋白酶进行了比较，发现前者具有更高的酶解活性。他们还发展了将胰蛋白酶固定于其它多孔聚合物整体柱上的方法[36]。他们的研究表明，由丙烯酰胺单体合成的亲水性基质很适合作为高通量生物反应器中酶的固定化载体。此外，当吖内酯功能基引入到整体材料后，与蛋白质的氨基或巯基的反应更容易进行，从而使酶的固定化过程更快、更有效。 Palm等[37]采用另一种方法制备了多孔聚合物整体柱酶反应器，即将含有N羟基琥珀酰亚胺的丙烯酰胺聚合溶液注入6cm长的、经过活化的石英毛细管柱中进行聚合。他们还讨论了酶解柱的重现性和稳定性。实验发现，20星期内酶解活性几乎没有变化。Ｄuan等[38]采用二元致孔剂，在毛细管内以丙烯酰胺、N羟基琥珀酰亚胺和乙烯基二甲基丙烯酸酯为原料原位合成了一种新型的胰蛋白酶固定化载体。二元致孔剂使得整体材料反压较小，不仅可以加快蛋白质的酶解，而且也使该胰蛋白酶反应器能够和分离鉴定系统在线联用。他们又在毛细管内原位合成了聚（丙烯酰胺甲基丙烯酸缩水甘油酯乙烯基二甲基丙烯酸酯）整体材料，经氨处理、戊二醛活化后固定胰蛋白酶[39]。与传统溶液中的酶解反应相比，该酶反应器可使标准蛋白的酶解速率提高230倍。实验结果表明，丙烯酰胺对于提高胰蛋白酶的固定化效率和酶的活性是十分重要的。黄家贤等[40]通过反相悬浮聚合，以乙烯撑碳酸酯为反应性单体，亲水性N , N′亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，分别选用N乙烯基吡咯烷酮和丙烯酸β羟乙酯两种亲水性单体为合成酶载体的成分，以二甲基甲酰胺和线型高分子聚乙二醇400为复合致孔剂合成了两种性能优越的、固载胰蛋白酶的大孔交联高分子载体。
　　杨原等[41]在聚二甲基硅氧烷（PDMS）基质上先在紫外光照射下嫁接丙烯酸单体，然后用聚二烯丙基二甲基氯化铵将胰蛋白酶固定在微流控芯片微通道中。蛋白质样品在芯片上酶解后,经基质辅助激光诱导电离飞行时间质谱检测。Frechet等[42]将痕量样品预处理重要的方法之一――固相萃取技术与固定化酶反应器集成起来，制作了双功能微流控芯片。他们先在25 μm内径毛细管中制备了25 mm长的多孔聚（丁基甲基丙烯酸酯乙烯基二甲基丙烯酸酯）整体柱，其中20 mm长的整体柱部分经光刻活化后用以固定胰蛋白酶，其余未经修饰的疏水部分作为微固相萃取器（SPE）。毛细管的末端被拉制成一个9～12 μm的纳升电喷雾器。蛋白样品经SPE酶解MS和经酶解SPEMS后得到的肽段序列覆盖率一致，均高达80％。Peterson等[43]发展了一种可用于高通量分析的微芯片。他们将胰蛋白酶固定化在10 cm长的多孔聚合物整体柱上。在样品反应时间小于1 min的情况下，获得的酶解肽段经质谱鉴定，也可得到较高的肽段序列覆盖率。
　　2.3& 其它材料上的胰蛋白酶固定化
　　复合/耦合固定化技术能克服单一固定化方法的缺陷，具有良好的应用和发展前景[44]。周蕊等[45]将壳聚糖与硅胶搅拌均匀，同时用戊二醛进行活化制成活化载体。再通过交联反应将胰蛋白酶固定至复合硅胶载体上，并用正交法进行优化。结果制得的固定化胰蛋白酶的活力单位可以达到 5990.5U/g。 邱广亮等[46]研究了磁性载体的吸附交联法固定酶的方法。磁性载体具有两亲性，并可通过简单的磁场作用力实现酶的回收。采用戊二醛交联增强了磁性载体的耐热和耐酸碱性，同时也提高了存储和操作的稳定性。王乐勤等[47]以硅烷化磁铁粉为载体制备了固定化胰蛋白酶反应器。他们的实验结果表明，通过此种方式固定化的胰蛋白酶酶学性质明显优于游离状态的胰蛋白酶。
　　3& 固定化酶微反应器与分离分析方法联用及其在蛋白质组中的应用
　　蛋白质组的复杂性，对分离分析方法的高效、快速、高通量、集成化和自动化提出了更高的要求。蛋白质组研究涉及肽和蛋白质的分离、生物分子的鉴定和定量以及海量数据的生物信息学处理。目前，质谱（MS）已经成为蛋白质结构表征的重要工具，其中一个重要原因是两种新的离子化方法有效地解决了从不挥发或挥发性差的大生物分子产生出离子的难题[48]。 蛋白质组研究面临的巨大挑战就是待分析的肽段和蛋白质数目很多。因为高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）具有分离模式多、分析速度快、样品用量小、易于自动化等优点，所以它们与MS的联用受到了人们的广泛关注[49，50]。由于固定化胰蛋白酶装填于柱中或交联于分离柱内壁，可与流动体系联用且可多次使用，从而大大缩短了蛋白质的酶解时间。更重要的是固定化酶反应器不仅可以减少样品污染的可能性，而且可与分离检测系统在线偶联。所以，固定化酶反应器(IMER)与HPLC/MS或CE/MS在线联用近年来发展很快，并开始在蛋白质组研究中发挥作用。
　　3.1& IMERHPLCMS联用
　　商品化的PoroszymeTM卡盒不仅可以通过调节流速来控制蛋白质的酶解程度，而且也易于与LCMS联用[25，26]。Hsieh等[25]以商品化的PoroszymeTM卡盒为酶解单元，发展了一种自动化的色谱分离、在线酶解和与ESIMS/MS联用系统。他们将20μm的PoroszymeTM颗粒填充到2.1×30 mmPEEK柱中构成反应器，并通过切换阀与多柱分离系统连接。经过免疫亲和、混合阴/阳离子交换、固定化胰蛋白酶水解、捕集物稀释、肽段反相色谱柱分离和在线质谱鉴定后，从含有大量人血浆蛋白的混合物中识别了Hb及HbS，并能确认HbS上的突变位点。Riggs等[26]将胰蛋白酶固定在POROS AL 20上，并填充于100×4.6 mm内径的柱中，构建了一种自动化的分离鉴定平台。该系统可进行以下操作：（1）在自动进样器中，进行蛋白质的还原和烷基化；（2）胰蛋白酶解柱上水解蛋白质；（3）固定化金属亲和色谱（IMAC）柱与肽段选择性的作用；（4）肽段转移到反相色谱柱上进一步分离；（5）色谱柱流出物进入ESIMS进行分析。他们用牛奶作为待分析样品，总分析时间少于2 h。Vecchione等[51]应用一个带有PoroszymeTM胰蛋白酶柱的自动化LCMS/CIDMS系统对人纤维蛋白原生物合成的产物进行了检测。通过在线酶解，反应时间可缩短到20 min。酶解产物分离后进入MS系统进行二级扫描，发现了纤维蛋白原的一种罕见修饰方式。Hara等[52]使用PoroszymeTM卡盒对neu分化因子表皮生长因子（EGF）的结构域先进行快速胰蛋白酶解，再经内源性蛋白酶GluC水解、RPHPLC分离、手工收集洗脱的肽段、Edmann序列分析和MALDITOFMS鉴定，获得的肽谱有了明显改善，有助于二硫键连接位点的指认。Samskog等[53]用PoroszymeTM 固定化胰蛋白酶基质材料制备了微反应器，并实现了与填充毛细管LCMS系统的偶联。与溶液中的酶解相比，在线酶解分离分析系统可将肽段序列覆盖率从25%提高到55%。Hedstrom等[54]构建了一个微柱LC蛋白酶解ESIMS分析平台。蛋白质的在线脱盐、分离、酶解和鉴定可在40 min内完成，蛋白质序列覆盖率达到78%~95%。
　　对于在多孔微珠/球上固定化胰蛋白酶制备的酶反应器而言，大分子只有扩散到载体的孔中才可能与酶分子的活性位点接触，因此扩散速率决定了底物分子与固定化酶分子的传质速率。 在HPLC领域中，聚合物整体柱是一种较新颖的固定相。Frechet及其同事[35]将胰蛋白酶固定化于聚(甲基丙烯酸酯乙烯基二甲基丙烯酸酯)整体柱材料上，并通过切换阀将其与反相分离柱偶联，分离洗脱后的肽段用紫外检测器检测。 Novotny等[37]利用自制的聚丙烯酰胺胰蛋白酶反应器将几种标准蛋白酶解，然后进行MALDITOFMS分析。 Foret等[55]在75 μm内径的毛细管中以聚（缩水甘油基甲基丙烯酸酯乙烯基二甲基丙烯酸酯）为载体固定了L1甲苯磺酰氨基2苯乙基氯甲基酮胰蛋白酶（TPCK胰蛋白酶），并通过液液连接（liquid junction）接口与ESITOFMS偶联。在25℃时，标准蛋白的酶解可在30 s内完成，且肽段的序列覆盖率达到80%。 段继诚等[38]将标准蛋白的水溶液和水乙腈混和溶液分别注入毛细管酶反应器，并通过在线联用的HPLCESIMS进行分离鉴定。结果表明，两种溶液中胰蛋白酶解的肽段有相似的序列覆盖率，但在水乙腈混和溶液中酶解时间明显缩短。他们还将[39]微型酶反应器与纳升高效液相色谱质谱系统在线偶联。蛋白样品在7 s内迅速酶解，肽段序列覆盖率可达54.81%。
　　3.2& IMERCEMS联用
　　90年代初，Kuhn等[56]尝试了酶解柱与CE系统的偶联，并将其应用于蛋白质的在线酶解与分离。他们以电绝缘的Teflon池为接口单元，把胰蛋白酶解柱与内径相同的分离毛细管柱连接起来，并通过微定位装置减少样品扩散。酶解反应2 h后，在两根毛细管的自由端加一电压使酶解产物进入分离毛细管，而后在分离毛细管两端施加分离电压进行CZE分离及紫外或荧光检测。Kuhn等用该装置对pmol量的标准蛋白进行了成功的在线酶解与分离。 在此基础上，Kuhn等[57]又发展了一种集胰蛋白酶解、CZE分离、ESIMS检测为一体的在线系统，用1 h即可得到标准蛋白的肽图。Ye等[58]制作了一个30nL的固定化胰蛋白酶微反应器，通过液液连接接口与CE在线联用。结果显示，标准蛋白经酶解、分离后，绝大部分峰的柱效均在120000N/m以上，且整个分析时间仅需16 min。
　　对于IMERCE系统，确保电路和液流路的通畅至关重要。Kato等[59]提出了一种将胰蛋白酶解与CE分离在同一根毛细管中进行的新方法。 他们将胰蛋白酶通过溶胶凝胶法包埋于熔硅毛细管的进样端，毛细管柱余下部分用于酶解肽段的CE分离。该系统所需样品的体积比传统方法的酶解低3个数量级。Kato等[60]在文献［５９］的工作基础上，通过在毛细管内壁由光诱导聚合法形成的多孔聚合物基质上涂布包埋胃蛋白酶的凝胶的方法实现了蛋白酶解、CE分离和ESIMS分析的在线偶联。
　　4& 展望
　　综上所述，近年来胰蛋白固定化技术的研究及其在蛋白质组中的应用都得到了长足发展。与自由溶液中的酶解反应相比，固定化胰蛋白酶反应器不仅提高了反应速率，而且可以与HPLC、CE及MS在线联用，从而使得构建蛋白质样品的在线酶解、分离和鉴定的平台成为可能。今后，开发新型的固定化载体材料，尤其是新型整体材料，仍将是一个研究热点。固定化胰蛋白酶反应器和HPLCMS或CEMS系统的兼容性也有待于进一步改善。此外，芯片上微型蛋白酶反应器的集成也是一个很有意义的发展方向。有理由相信，在不久的将来固定化酶反应器必将会在蛋白质组等生命科学领域发挥重要作用。
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　　本文系国家自然科学基金资助项目（Ｎo.435020）
　　(中国科学院大连化学物理研究所, 国家色谱研究分析中心, 大连 116023）
　　(中国科学院研究生院,北京 100039)
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