dna甲基化试剂盒传递是什么样的过程

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-06-01 07:04 标签： dna甲基化
甲基化：给DNA戴上帽子_百度文库
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甲基化：给DNA戴上帽子
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你可能喜欢DNA的甲基化在遗传信息的传递,DNA复制和DNA损伤修复等过程中有什么重要意义?
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DNA甲基化是最早发现的修饰途径之一,大量研究表明,DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变,从而控制基因表达.因此目前研究的热点主要是集中在DNA甲基化与EPIGENOMICS之间的关系,可以第一时间得到表观组学上的改变与DNA甲基化之间的关系,从而在一些GENE调控网络和信号通路上发现新的东西
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甲基化检测
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是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-。DNA甲基化通常抑制，去甲基化则诱导了基因的重新活化和。
甲基化检测甲基化检测
是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-。DNA甲基化通常抑制，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。
甲基化检测检测程序
1．特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的被转化为，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2．亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而的胞嘧啶不变。随后设计BSP进行PCR，在扩增过程中全部转化为，最后对PCR产物进行就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3．法（High Resolution Melting，HRM）
在非位置设计一对针对氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的发生改变，从而导致的变化（图1）。
甲基化检测送样要求
细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。
企业信用信息DNA甲基化发生在什么位置?
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基因组中60%～90% 的CpG 都被甲基化,未甲基化的CpG 成簇地组成CpG 岛,位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点.有实验证明超甲基化阻遏转录的进行.DNA 甲基化可引起基因组中相应区域染色质结构变化,使DNA 失去核酶&限制性内切酶的切割位点,以及DNA 酶的敏感位点,使染色质高度螺旋化,凝缩成团,失去转录活性.5 位C 甲基化的胞嘧啶脱氨基生成胸腺嘧啶,由此可能导致基因置换突变,发生碱基错配:T2G,如果在细胞分裂过程中不被纠正,就会诱发遗传病或癌症,而且,生物体甲基化的方式是稳定的,可遗传的.
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标题: DNA甲基化测序问题集锦
摘要: [DNA甲基化测序问题集锦]DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表观。 DNA甲基化在维持细胞正常功能、传递基因组印记，胚胎发育、肿瘤发生等方面发挥重要作用，目前已经成为表观遗传学和表观基因组学的研究热点。
Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa…… [关键词:甲基化 测序 位点 基因组 全基因组 抗体 甲基化检测]……
DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表观。 DNA甲基化在维持细胞正常功能、传递基因组印记，胚胎发育、肿瘤发生等方面发挥重要作用，目前已经成为表观遗传学和表观基因组学的研究热点。
Roche GS FLX Titanium 、Illumina Solexa GA IIx和AB SOLID 4均可以进行大规模DNA甲基化测序分析，由于Illumina Solexa GA IIx测序仪具有数据读取量大、成本低等优势， Illumina Solexa GA IIx测序仪在DNA甲基化测序方面得到广泛应用。
DNA甲基化测序可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取甲基化状态信息和与基因表达调控的多重关系，可高效精确完成全基因组甲基化测序及高分辨DNA甲基化谱式绘制，并可对发现的靶点区进行甲基化特异性PCR验证。
甲基化测序对样品有什么要求？
答：（1） 请提供浓度≥10 ng/μg、总量≥200 ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次富集的DNA量不够，建议将2~3次免疫沉淀的DNA合并在一起。
（2） 样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管中，再将50 ml管放在封口袋中。为了防止低浓度样品黏附在离心管壁上，请使用non-stick tube运输DNA ；建议使用冰袋运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。
MeDIP富集DNA片段的流程？
答：甲基化DNA免疫沉淀法（Methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）是一种高效富集甲基化DNA的方法。主要通过与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀，形成富集。其流程如下（图1）：
（1）将基因组DNA超声打断成400-500bp片段；
（2）加热变性，使双链DNA片段解链形成单链DNA样品；
（3）向变性后的单链DNA样品中加入5’-甲基胞嘧啶抗体；
（4）使用亲和层析分离（3）步样品中的甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱。纯化得到甲基化DNA片段（MeDNA）。
甲基化测序文库构建方法？
答：通过使用5’-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段，并结合Solexa高通量测序平台进行甲基化测序，首先需要对所富集的DNA片段进行前处理，构建测序文库。其方法如下：（1）对富集的双链DNA进行末端修复；（2）将“A”碱基加入到DNA片段的3’末端；（3）使用特定的测序接头连接DNA片段两端；（4）纯化连接产物；（5）高保真聚合酶PCR扩增连上接头的DNA片段；（6）检测测序文库。
MeDIP-seq比其他的甲基化研究方法有什么优势？
? 答：灵活度高：能够直接对任意物种的高甲基化片段进行测序，无需已知的基因组序列信息；检测范围广：覆盖整个基因组范围的甲基化区域；精确度高：能够在实际结合位点50个碱基范围内精确定位；数字化信号：直接对甲基化片段进行测序和定量，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。各种方法的优缺点如下：
目前主要用途
整体基因组或特定位点甲基化检测
高通量，无需序列信息，可同时检测整个基因组和特定位点的甲基化
数据量大，需要大量的生物信息(bioinformation)分析工作。
甲基化敏感的限制性指纹技术（MSPF）
甲基化片段筛选
可检测全基因组所有CpG岛
少量样本间的比较
限制性标记基因组扫描（RLGS）
寻找差异甲基化位点
可检测全基因组CpG岛
需使用同位素，异常结果不易解释
甲基化间区位点扩增（AIMS）
印迹基因鉴定和差异甲基化片段筛选
可鉴定印迹基因，检测全基因组CpG岛
基因组CpG位点的覆盖率有限
CpG岛扩增结合代表性差异分析技术（MCA-RDA）
分离不同样本间差异甲基化片段
可分离不同样本间差异甲基化片段
不能同时比较多个样本，不能分离出差异的低甲基化片段
亚硫酸氢盐修饰结合直接测序法（Bisulfite sequencing）
特定位点甲基化水平检测
可精确检测每个CpG位点的甲基化状态
需要大量的克隆测序，过程较为繁琐且昂贵。
甲基化寡核苷酸芯片法（MSO）
特定位点甲基化检测
只能检测已知序列
染色质免疫共沉淀和芯片结合技术（CHIP-on-Chip）
整体基因组或特定位点甲基化检测
高通量，可同时检测整个基因组和特定位点的甲基化
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）
特定位点甲基化检测
价格昂贵，主要用于特定位点检测
?哪些因素会影响甲基化测序结果的质量？
答：由于进行DNA甲基化测序前，需要对样品进行DNA免疫沉淀富集，富集过程中反应条件是否合适，直接影响到富集甲基化DNA的量，另外还需要保证处理过程中测序样品无污染，否则会严重影响测序结果的质量；DNA免疫沉淀富集后，如果DNA的量过少，需要进行PCR扩增，PCR过程会产生偏差，影响样本甲基化结果的分析。
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