高灵敏的细胞因子化学发光免疫分析新方法研究--《扬州大学》2013年硕士论文
高灵敏的细胞因子化学发光免疫分析新方法研究
【摘要】：第一部分基于顺磁性微珠的高灵敏度自动化化学发光免疫分析新方法检测鸡伽马干扰素
本文首次将顺磁微珠用于固定鸡伽马干扰素(chicken interferon-y, ChIFN-y)单克隆抗体,发展了一种高灵敏度的自动化化学发光免疫分析新方法用于快速检测ChIFN-γ。与费力、耗时的和灵敏度不高的生物测定法和酶联免疫分析法相比,该方法显示出明显的检测优势,如灵敏度高、检测速度快、线性范围宽、操作简单等。固定有ChIFN-γ单克隆抗体的顺磁性微珠,ChIFN-γ抗原和辣根过氧化酶标记的ChIFN-γ抗体被通入流通池,在线温育形成夹心复合结构,冲洗后通入辣根过氧化酶底物引发化学发光反应,通过发光信号和浓度之间的线性关系实现ChIFN-γ抗原的快速检测。该方法对ChIFN-γ抗原检测的线性范围为0.001-0.1ng/mL(R2=0.9976),检测限为0.87pg/mL。该检测限比目前ChIFN-γ检测的最低值(50pg/mL)小56.5倍,检测时间远小于目前报道的方法。此外,所建立的方法具有高的特异性和准确性、良好的重现性和稳定性,能实现实际样品中ChIFN-γ'决速自动化检测,并且有望应用于其它家禽细胞因子的测定,对临床诊断具有重要的应用价值。
第二部分基于氧化石墨烯的超高灵敏度鸡伽马干扰素流通式化学发光免疫分析
定量检测原位刺激后T细胞释放的鸡伽马干扰素(Chicken interferon-y, ChIFN-y),是评价鸡感染疾病或疫苗免疫后免疫应答的一个很好的途径。本文建立一个皮克水平伽马干扰素(Chicken interferon-y, ChIFN-y)流通式化学发光免疫分析新方法,能够超灵敏、快速、特异性地测定ChIFN-γ。生物相容性的氧化石墨烯首次引入到化学发光免疫分析领域,用于高效地固定捕获抗体。在3倍信噪比下,该方法对ChIFN-γ的检测限为0.36pg/mL,比目前ChIFN-γ的50pg/mL最低检测限值小138倍。结合流通式分析系统,整个免疫分析过程在25min内可以完成。该制作的ChIFN-γ免疫传感器展现了优良的检测和制作重现性、良好的特异性和稳定性。该方法对天然ChIFN-γ样品测定的结果,与参考方法获得的数值保持基本一致。与目前报道的ChIFN-γ测定方法相比,该方法灵活、简单、快速、灵敏。该研究工作旨在证明,超灵敏、强特异性和快速的化学发光免疫分析能够成为有潜力的模式定量测定ChIFN-γ,从而进一步研究其在禽类免疫应答中的作用。
第三部分基于棒状二氧化钛纳米材料的化学发光免疫传感器检测鸡白介素-4
本文将棒状的二氧化钛(TiO2)纳米材料用于固定鸡白介素-4(chicken Interleukin-4, ChIL-4)抗体,首次发展了一个高灵敏度的ChIL-4化学发光免疫传感器。将棒状Ti02-壳聚糖(CS)-ChIL-4单克隆抗体混合溶液滴涂于环氧硅烷化的玻璃片表面,可制备得到该ChIL-4化学发光免疫传感器。合成的棒状纳米Ti02具有大的比表面积和良好的生物相容性,可以有效地固定更多的ChIL-4抗体,且保持其生物活性。扫描电子显微镜(SEM)和电化学阻抗谱法(EIS)被用来表征构建的ChIL-4生物传感器。该化学发光免疫传感器对ChIL-4响应的线性范围为0.1-100ng/mL,检测限为0.045ng/mL (S/N=3).与目前的生物学分析方法相比,该检测方法灵敏度高,简单快速,成本低且实用性强。此外,该免疫传感器具有优良的特异性,良好的重复性和保存寿命,为鸡感染疾病或疫苗免疫后的免疫应答水平提供了一个具有应用前景的临床评价标准。
第四部分壳聚糖-铂纳米粒子复合物为固定载体的牛伽马干扰素化学发光免疫传感器研究
本文提出了一个基于铂纳米粒子的高灵敏度化学发光免疫传感器测定牛伽马干扰素(bovine interferon-y, BoIFN-y)。首先将铂纳米粒子分散于壳聚糖溶液,然后与BoIFN-γ单克隆抗体混合均匀,最后将获得的混合物滴涂于环氧硅烷化的玻璃片表面,即制得该BoIFN-γ化学发光免疫传感器。铂纳米粒子具有大的比表面积和良好固载能力,能固定更多的牛伽马干BoIFN-抗体,从而提高检测的灵敏度。利用透射电子显微镜(TEM)、紫外光谱(UV)和电化学阻抗谱法(EIS),对合成的铂纳米粒子和构建的生物传感器进行了相应的表征。该BoIFN-γ免疫传感器对BoIFN-γ检测的线性范围为0.1-120ng/mL,检测限为0.026ng/mL (S/N=3).与传统的BoIFN-γ分析方法相比,该化学发光免疫传感器具有线性范围宽、灵敏度高和分析速度快等优点。此外,该传感器表现出优良的选择性、良好的重现性和稳定性。该研究工作提供了一个具有前景的分析方法检测牛感染疾病或疫苗免疫后的BoIFN-γ水平。
【关键词】：
【学位授予单位】：扬州大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：O657.3【目录】：
摘要6-8Abstract8-11第一章 绪论11-27 1.1 免疫分析概述11-16
1.1.1 免疫分析11-13
1.1.2 免疫传感器13
1.1.3 免疫传感器的基本原理13-14
1.1.4 免疫传感器中抗原抗体的固定方法14-15
1.1.5 免疫传感器的应用15-16 1.2 流动注射化学发光免疫分析16-18
1.2.1 流动注射分析16-17
1.2.2 化学发光免疫分析17-18 1.3 纳米材料概述18-20
1.3.1 纳米材料的特性18-19
1.3.1.1 表面与界面效应18
1.3.1.2 量子尺寸效应18-19
1.3.1.3 小尺寸效应19
1.3.1.4 宏观量子隧道效应19
1.3.2 纳米材料的应用现状19-20 1.4 免疫传感器在细胞因子检测中的应用20-23
1.4.1 细胞因子概述20-21
1.4.2 免疫传感器在细胞因子检测方面的研究现状21-23 1.5 本文的主要研究工作23 1.6 参考文献23-27第二章 基于顺磁性微珠的高灵敏度自动化化学发光免疫分析新方法检测鸡伽马干扰素27-38 2.1 实验部分28-31
2.1.1 试剂与仪器28-29
2.1.2 免疫传感器的制备29
2.1.3 分析步骤29-31 2.2 结果与讨论31-35
2.2.1 化学发光检测条件的优化31
2.2.2 动力学特征和温育时间的影响31-32
2.2.3 HRP标记的抗体的浓度影响32-33
2.2.4 分析性能和临床样品的检测33-34
2.2.5 特异性研究34-35
2.2.6 免疫传感器的重现性和稳定性35 2.3 结论35 2.4 参考文献35-38第三章 基于氧化石墨烯的超高灵敏度鸡伽马干扰素流动注射化学发光免疫分析38-50 3.1 实验部分39-41
3.1.1 材料与试剂39
3.1.2 装置与设备39-40
3.1.3 氧化石墨烯的合成40
3.1.4 ChIFN-γ免疫传感器的制备40-41
3.1.5 免疫分析步骤41 3.2 结果与讨论41-47
3.2.1 免疫传感器的表征41-43
3.2.2 化学发光反应的动力学特征43
3.2.3 温育时间43-45
3.2.4 HRP标记的ChIFN-γ抗体的最佳浓度45
3.2.5 ChIFN-γ的工作曲线45-46
3.2.6 特异性研究46-47
3.2.7 免疫传感器的重现性和稳定性47
3.2.8 ChIFN-γ样品的检测47 3.3 结论47 3.4 参考文献47-50第四章 基于棒状二氧化钛纳米材料的化学发光免疫传感器检测鸡白介素-450-63 4.1 实验部分51-54
4.1.1 试剂与材料51
4.1.2 仪器51-52
4.1.3 棒状纳米二氧化钛的合成52
4.1.4 免疫传感器的制备52
4.1.5 免疫分析步骤52-54 4.2 结果与讨论54-60
4.2.1 免疫传感器的表征54-55
4.2.1.1 扫描电镜54
4.2.1.2 阻抗表征54-55
4.2.2 化学发光检测条件的优化55
4.2.3 免疫分析过程的优化55-60
4.2.3.1 动力学特征55-56
4.2.3.2 温育时间的影响56-57
4.2.3.3 HRP标记的抗体的浓度影响57-58
4.2.3.4 特异性研究58-59
4.2.3.5 免疫传感器的重现性和稳定性59-60
4.2.3.6 分析性能和临床样品的检测60 4.3 结论60-61 4.4 参考文献61-63第五章 壳聚糖-铂纳米粒子为固定载体的牛伽马干扰素免疫传感器研究63-75 5.1 实验部分64-67
5.1.1 试剂与材料64
5.1.2 仪器64-65
5.1.3 纳米铂的合成65
5.1.4 免疫传感器的制备65
5.1.5 免疫分析步骤65-67 5.2 结果与讨论67-73
5.2.1 Pt纳米粒子的TEM表征67
5.2.2 Pt纳米粒子的紫外表征67-68
5.2.3 免疫传感器的阻抗表征68-69
5.2.4 免疫分析过程的优化69-73
5.2.4.1 动力学特征69-70
5.2.4.2 温育时间的影响70
5.2.4.3 HRP标记的抗体的浓度影响70-71
5.2.4.4 特异性研究71-72
5.2.4.5 免疫传感器的重现性和稳定性72
5.2.4.6 分析性能和临床样品的检测72-73 5.3 结论73-74 5.4 参考文献74-75攻读硕士研究生期间发表及待发表的论文75-76致谢76-77
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化学发光检测试剂盒应用介绍
来源：科端生物 点击数：
在生命科学研究中应用最广泛的化学发光当属来自于各种自然界生物中的荧光素酶，它们可以催化特定类型的荧光素而发光，人们称之为生物发光。最常见的是萤火虫的荧光素酶，也是最典型的昆虫生物发光。
化学发光的催化特性：
&&&& 1.&& 低检测极限 (10-18 mol 或更低)；
&&&& 2.&& 检测方法简单(混合和测试)；
&&&& 3.&& 成本低(并可以微量化)；
&&&& 4.&& 仪器简单。
萤火虫的luciferin-luciferase系统是最常用的生物发光反应体系。 它可以应用在分析ATP和任何酶或有ATP形成或降解反应参与的生理过程。 ATP是生物物质存在的标志物，可以用于快速微生物、卫生学检测。编码荧光素酶的基因已成为分子生物学中常用的报告基因，研究基因的转录和表达。同样的道理，细菌的荧光素酶组合氧化还原酶可以检测NADH和NADPH。HRP和luminol可以用于检测H2O2的产生。一些酶和其他的底物参与发光反应可以作为免疫分析的标记物。因此化学发光分析在不同的领域具有广泛的应用，并且所有的这些分析可以在同一设备上来进行。
1. 萤火虫荧光素酶
&&& 提供检测荧光素酶和ATP的发光试剂。试剂盒中具有ATP内标，以防不同仪器、或来自不同样品的抑制或光淬灭而引起的误差，并保证试剂的灵敏度。
& 通过以下等式计算样品中ATP含量(pmol):
& ATP 样品 = 1* I 样品 / ( I 样品 + 标准 - I样品)
1）荧光素酶检测
&&& 萤火虫荧光素酶基因（luc）是一个可以用在真核生物和原核生物表达体系的绝佳的报告基因，它发射出来的光稳定持续，并可以达到最大化，光强度与荧光素酶成比例关系。
*& 无任何背景噪音
*& 简单、快速
*& 灵敏度高(10-19 moles)
*& 稳定的发光，可适用于手动或全自动和高通量进行
*& 适用于in vivo & in vitro 分析测试
2） 生理途径和酶的检测分析
* 所有ATP产生或降解的酶反应或生理途径都可以用萤火虫荧光素酶体系来进行检测；
* 可以通过终点法或动力学分析来测试分析物；
* ATP Reagent SL简单通过测试反应产生出来的光强度能够持续检测ATP的水平。
*& 氧化磷酸化过程，如诊断先天的代谢疾病；
*& 三酰甘油中的脂降解，如用于肥胖的研究；
*& Ppi 分析, 如DNA/RNA聚合酶活性分析；
*& 肌氨酸激酶同功酶活性分析，如诊断急性心血管梗塞；
*& ATP/ADP/AMP比率分析，如研究 ；
*& ATP/磷酸计算，如肌肉生理代谢研究。
3）快速细胞计数
ATP存在于所有的活细胞中，可以用于生物物质的预测，通过不同的处理可以分辨来自不同细胞类型的ATP。
4）细胞增殖和细胞毒理
细胞活力的促进或抑制可以通过在中ATP水平的变化来获得，定量分析细胞对外来物质的反应可以通过测试在加外来物质之前和之后的ATP含量变化而获得。
*&& 快速；
*&& 高灵敏；
*&& 可高通量进行适合于大规模药物筛选；
*&& 稳定的发光，可以使用于手动或全自动的化学发光仪。
5) 卫生学检测
所有的活细胞都有ATP存在，萤火虫荧光素酶反应中产生的光强度与样品中生物污染所含有的ATP成正比。没有完全清洗干净/消毒的表面是生长最佳的媒介，如空气中的微生物。
* &个人卫生学检测，如护士、外科医生；
*& &医院、老人监护和临床中的接触表面；
* &工业食品生产工厂和CIP(清洁地) ；
* &食品工业的HACCP；
* &工业清洗洗衣店；
*& 液体表面。
*& 可检测到不可培养的微生物或其它类型的生物污染残留；
*& 高灵敏度(10-17 moles ATP 或大约 5个细菌)；
*& 简单快速分析(&1 min) ，可日常使用/检测；
*&& 可以直接以ATP的mol来表示结果；
*& 可通过棉签擦拭收集样品，简单快速；
*& 手持的化学发光仪。
2，& KSL Pholasin自由基检测
化学发光法是自由基测定中灵敏度最高的方法之一，其原理是化学发光试剂与活性氧自由基反应生成激发态的产物，产物中的电子经非辐射性跃迁回到基态，放出光子。常用的化学发光试剂有鲁米诺、光泽精、甲壳动物荧光素等。其中Luminol已被公认为在碱性介质中既可以与OH自由基反应引起发光，也可以与超氧阴离子自由基或者单线态氧以及H2O2发生化学发光反应。
化学发光法操作简便，不需昂贵设备，测定快速；相比于传统的比色法，化学发光法又具有灵敏度高，无有色背景干扰，可以检测动力学反应等特点KSL ABEL自由基检测试剂盒利用来自海洋岩石中生长的生物发光软体动物Pholas dactylus中的光蛋白Pholasin，Pholasin自身不能发光，需要有“开关”。由活性白细胞（和其它的细胞类型）或其他来源的自由基和其他的反应氧自由基可以使Pholasin发光。
Pholasin可以超灵敏检测到自由基，在：
&*& 自由基: 超氧阴离子，单氧分子，羟基自由基；
&*& 氧化物: 次氯酸和次溴酸, 氯胺, bromamines 和过氧亚硝基阴离子.
&*& 酶: 过氧化物酶和某些氧化酶。
这些物质存在时，Pholasin 会发光。 KSL 的ABEL 试剂盒的灵敏度比 Luminol 体系要高 100倍以上，其检测所需样品量，如只需1ul 全血；并且得到信息要比 Luminol 体系更快，可以避免Luminol体系没有采集到的信息；ABEL试剂盒针对各种不同应用开发出了应用不同的检测试剂盒。
ABEL试剂盒主要包含以下三大类：
细胞活力测试试剂盒：能够检测从少量细胞（如来自2ul全血）的NADPH氧化酶的活力。这个试剂盒也能检测绿过氧化物酶的脱粒和测试氧化物，如次氯酸和次溴酸，过氧亚硝基阴离子。因为 Pholasin 的超灵敏度，此试剂盒对检测来自各种细胞类型的或组织类型的（包括血管和神经细胞）自由基和 ROS 产物非常有效。
抗氧化剂测试试剂盒有四种，测试特定类型的抗氧化剂。例如Rapid High Concentration Superoxide Antioxidant 试剂盒特异性测试维生素C类的抗氧化剂，而Halogenated Oxidant 试剂盒测试液体样品中拮抗绿过氧化酶和嗜曙红过氧化物酶（次氯酸和次溴酸）。Peroxynitrite Antioxidant 试剂盒，主要用来分析样品抗氧化剂的能力，如血清或血浆抗自由基对血浆蛋白攻击的能力，此试剂盒有许多的临床应用，包括评估食物和养分，化妆品和其他个人护理用产品，包括伤口康复治疗。
超氧化物测试试剂盒具有超低的检测极限，可以检测细胞产生的f mol 水平的超氧化物，并可以进行抗氧化剂测试。
Pholasin可用于很多方面，它对自由基和其他氧化物的超敏感性，使得它成为可以用于很多的氧化胁迫研究应用。大约有150种氧自由基介导的疾病，包括癌症、和心血管疾病。
3，发光细菌检测生物毒性
&&&&&&& 毒性是一项综合的生物学参数，它是衡量样品对活性生物体所产生的影响，不能以化学分析的方法进行测定，一些生物测试方法如鱼类、浮游动物试验、类试验等则较为复杂，且必须使用高等生物进行试验，从而引起众多的争议。发光作用是发光细菌正常生理状态下所具有的性质，它是细胞呼吸作用的副产物，而呼吸作用则是细胞和生物代谢的基本过程，细菌的发光直接和其呼吸相关，当细胞活性受到毒性物质作用后，其活性将受到抑制，从而使呼吸速率下降，进而导致发光降低，样品的毒性越强，发光细菌的光损失越多，以细菌发光法测定样品的生物毒性已经被证明是一种可靠的生物传感方法，并且具有快速、简便的特点，同时又有很好的灵敏度。
&&&&&& 该系统使用冻干的发光细菌制剂，通过15分钟的暴露试验，测定其代谢的抑制情况，从而计算出样品（水样、土壤样品）的毒性。该方法以通过工业、研究和政府的试验被证实有效。同时该测试方法已在多个国家（包括中国）被认可为官方标准，中国国家标准 (GB/T ) 和国际标准(ISO11348)。并可以利用荧光素酶报告基因体系，构建重组的含有特定检测物质感应元件的发光细菌/细胞可以特异性地检测某些特定物质的生物毒性。
发光细菌生物毒性测试方法是标准认证的，用发光细菌VrFischeri进行急性毒理测试。
发光细菌闪烁测试是一个改良的方法用于测试固体和有色样品。此系统包括化学发光检测仪，程序，试剂冷却/孵育器和冷冻干粉状态的测试用发光细菌。
重金属发光细菌测试法是革命性地运用重组生物发光细菌的方法来特异性地测试环境样品，此重组发光细菌能够特异性地感受某种特定重金属的存在，如来自固体或液体样品的ppb水平的铅、汞、砷和镉。此方法具有很高的灵敏度，并且测试简单快速，可高通量进行。
1) 发光细菌生物毒性、清洗剂残留测试
&&&&&&& 发光细菌方法测试化合物或污水的毒性（ISO 113483），通过测定水样对Vibrio fischeri （发光细菌测试）的光发射抑制效果。
&&&&&&& 标准发光细菌的测试过程是：把样品和细菌混合在一起，经过短暂的孵育，测试发光强度。检测仪器只需要化学发光仪（管式、板式或手持式化学发光检测仪）。
&&&&&&&& 此测试系统包括仪器和试剂（冷冻干粉），并且使用此系统可以监测清洗剂和消毒剂的残留检测食物加工过程中化学物质的危险包括在加工过程中不充分的清洗而导致的清洗剂和消毒剂的残留。这些残留可以用 BioTox 的毒性筛选系统很容易检测到，即使是很低浓度的残留。这个检测过程仅需要5 分钟。这个方法是非特异性的，可用于清洗的水或处理的表面。一般的检测范围为洗涤剂浓度（使用）的1/17到1/9615。如果这些化学物质与它的效应是已知的，可以对化学物质污染的结果进行判断。测试原理为发光细菌与样品混合，经过一段时间的孵育，检测发出的光信号强度。
2) 发光细菌闪烁测试&& -- 改良的 Vibrio Fischeri 快速测试水样和沉积物
&&&&&&& 生物发光Vibrio fischeri广泛应用于测试水样和化学物质的急性毒性。这个测试方法是标准认证的(EN 11348)，目前已有几种商业化的测试系统。测试样品与细菌混合孵育15或30分钟，在孵育后测试光强度，并与纯的细菌的发光强度比较。光强度的降低认为是毒性。这个方法是快速，它对有机污染物的特异性也非常高。此方法主要的缺点是在大多数的自然样品中存在颜色和混浊会发散光，被认为有毒性。校正颜色和混浊而引起的效果是费时，不方便和不可靠。
&&&&&&& 闪烁测试是一个改良的生物发光细菌测试，设计用来测试固体样品。这方法考虑到了在整个测试过程中的颜色和混浊。测试以动力学的方式进行，一个可自动加样的化学发光仪能够同时进行加样和测试。在 V. Fischeri 细菌的闪烁测试中细菌通过自动加样器加到样品中，信号连续记录。
&&&&&&& 30秒钟。 在加样后立即收集到最大的信号值（Ipeak），与30秒后的信号值（I30s）相比。对于大多数的化学物质，特别是有机的，毒性效果（光强度的减弱）在孵育几秒钟后就能观察到了。然后对于一些化学物质只有在经过较长时间的孵育后才能观察到效果。因此，在15或30分钟后的动力学数据可以提供可靠的结果。
&&&&&&& 上述描述的特点使得颜色/混浊校正方法不需要了，方便了在极短时间筛选大多数样品的毒性。闪烁测试方法使用30秒的接触时间相比于标准方法中的15到30分钟的接触时间稍降低了灵敏度。当使用相同的接触时间，标准方法和闪烁方法的灵敏度是一样的。它们的相关差异在1％以下。样品测试体积在1ml以下，根据接触时间的长短此方法每小时可以进行40到80个样品的测试
3) 重金属发光细菌快速测试分析&& -- 以生物发光为基础的生物传感器测重金属
&&&&&&& 通过遗传改造生物体使其能够特异性感受在环境样品中存在的重金属。这些细菌菌株对“生物利用度”这个词赋予了全新的概念，因为现在测试毒性物质中的亚类毒性浓度成为可能。相比于标准方法，它是非常快速，每天测试几百个样品成为可能。目前可以提供测试汞和砷的试剂盒，将来会有更多。这个方法可以在管式或板式化学发光仪上进行。
*& 整体细胞传感器检测来自不同样品（水样、沥出物、沉淀物和土壤样品）的重金属的生物利用度组分；
*& 生物利用度表示一种金属可进入生物系统的浓度；
*& 在测定重金属毒性中的重要因素；
*& 不等于溶解度；
*& 用传统的化学方法很难测试，但是用生物传感器容易做到；
*& 非常灵敏的方法，比传统的毒性测试方法灵敏很多。
*& 简单操作：传感器生物体以试剂盒形式（冻干）
*& 高灵敏度 vs.背景 -& 化学发光仪
*& 手持、管式、板式化学发光仪
*& 可以作为大量样品的筛选工具
*& 相比于传统方法，成本具有很大优势
*& 定量测试，动态范围宽
*& 生物活体测试，得到是直接的生物毒性
*& 微生物生物传感器的一般优势
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