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血液DNA提取试剂盒-天根
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不可忽视的细节
―血液基因组提取 浓度：100－300ng/ul 纯度：任何杂质都可能导致DNA在储存过程中的降解，因此要确保纯化得到的核酸的纯度。 温度：纯化得到基因组DNA之后需将DNA溶液分装保存到-20℃，反复冻溶会导致DNA的降解。 溶解DNA Buffer：纯化得到的基因组DNA最好溶解在TB Buffer
或者Tris缓冲液里，因为大片段的基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。 纯度（ OD260-320 /OD280-320 ）
紫外分光光度计进行测量（选择正确的稀释倍数，确保OD260 值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释4－5倍；溶液裂解法稀释20－30倍）OD260-320 /OD280-320
说明有蛋白的污染OD260-320 /OD280-320＝1.7～1.9
说明纯度很好OD260-320 /OD280-320
说明有部分降解或有RNA污染 得率
紫外分光光度计进行测量Yield＝ OD260×50ng/ul×稀释倍数 电泳检测要控制上样量。上样量过大会导致泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。 如果加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。 若上样量合适，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNA有降解。 TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样本来源一致，分别取1μl，10μl，50μl，100μl为起始样本提取基因组 。各取2μl基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析实验结果。 * 天根生化科技（北京）有限公司 DNA提取的原则 基因组提取方法 样本保存和前处理 基因组提取流程 DNA保存及检测方法 试剂选择原则
内容 没有严格要求:
Southern Blots
RFLP 严格要求片段长度:
PFGE 脉冲场凝胶电泳
DNA Length DNA提取原则1：DNA片段长度 没有严格要求
常规PCR 严格要求产物纯度
存档、产物长期保存
Southern杂交
荧光定量PCR
SNP Microarray
比较基因组杂交
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天为的&世界的DD核酸分离纯化系列
&& 天为的 世界的DD核酸分离纯化系列
天为时代公司生产的质粒提取系列产品，全部采用碱裂解法和独特的硅基质吸附材料特异性吸附DNA，分为离心柱型和硅胶树脂型两种，去除其它杂质，方便快速，不需要有机试剂抽提、乙醇沉淀等步骤。
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采用全新配方，最大限度去除杂质蛋白及其它有机化合物，得到的质粒DNA纯度笔传统试剂盒纯度更高
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纯度高、回收率高、操作时间短
全新的以异硫氰酸胍为基础的RNA提取方法，在高盐条件下RNA与硅胶膜结合，在低盐、高pH条件下洗脱，快速有效去除细胞中基因组DNA和蛋白质，使获得的RNA纯度高，稳定性好。
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TRNzol 总RNA提取试剂
可即用的从细胞和组织中提取总RNA的试剂，迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，有效保持RNA完整性。
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RNAclean RNA纯化试剂盒
可从酶反应液（如Dnase处理，蛋白酶处理，RNA标记等）中纯化回收RNA，最大限度出去蛋白质、无机盐离子和有机杂质等
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加入到各种RNA溶液或反应液中（如RT-PCR等），增进RNA稳定性，高效去除RNase污染。
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独有的超薄纯化柱，可用10ul洗脱体积回收DNA片段，即使微量DNA也可轻松回收！
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相关天根生化科技由于遗传基因的差异，不同个体对一些疾病具有不同的敏感性，对同一药物的药效和不良反应也存在差异，然而这些都与DNA的多态性密不可分。 通过DNA水平的遗传多态性分析，我们不仅能够发现某些疾病的易感基因，建立遗传病的基因诊断方法，而且还能从基因组水平深入认识疾病及药物作用个体差异的机制，指导和优化临床用药。因此，DNA多态性在生物医学、药物开发、法医鉴定甚至人类进化起源等领域都有非常重要的价值。提取高质量的基因组DNA是这些研究的基础。传统用于DNA提取的样本主要来源于血液，但是这一来源将面临着大样本采集的经费和实用性的问题，尤其不适合于儿童和健康志愿者的标本采集。唾液作为一个潜在的诊断标本，具有采集方便、无创伤等优点。多个研究显示唾液来源的基因组DNA完全适用于大样本DNA多态性分析的流行病学研究[, , , ]。
本研究从获得口腔黏膜细胞的途径、储存条件、DNA提取方法等方面探索从唾液中提取人类基因组DNA的方法，测定基因组DNA的含量和质量，并用TP53和PRB-3基因的PCR反应验证其扩增效果。同时采集大量健康儿童和成人唾液标本评估该方法DNA提取的稳定性，以期获得一种快速、有效且对人体无伤害、无痛苦的基因组DNA提取方法。
1 材料和方法
1.1 标本采集与处理
从广东药学院征集6名健康志愿者，按照课题组前期唾液定时采集的方式[]采集基础状态下3 min的唾液，简单操作如下：受试者除喝水外禁食1 h以上，采样前静坐10 min，并通过吞咽排空口腔唾液，然后通过自然流出的方法收集3 min口腔分泌的唾液。取2个1.5 mL的EP管，各加入0.1 mL唾液，其中一管室温(25℃)放置1周备用，另一管直接用于DNA提取。20 min后，按照口腔拭子基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)说明书的要求，取一支口腔拭子在面颊内壁两侧各反复刮拭6次，室温(25℃)放置1周备用。取另一支口腔拭子重复操作1次，直接用于DNA提取。
按照上述唾液自然流出的采集方式[]，分别从广州市海珠区妇幼保健院和广东药学院采集47名健康儿童(23名男孩，24名女孩)和52名健康成人(26名男性，26名女性)的唾液标本，-80℃保存并在1周内进行DNA提取实验。采集3 min的平均唾液量为(0.46±0.29)mL(范围0.2~1.2 mL)。该研究的所有参与者和儿童参与者的监护人都签署了《知情同意书》。
1.2 唾液基因组DNA提取和鉴定
对采集的6名健康志愿者新鲜和室温放置1周的唾液标本，分别利用碘化钾法和试剂盒法进行DNA提取。(1)碘化钾法：参考Loparev等[]的方法并做部分修改。取0.1 mL唾液置于1.5 mL离心管中，加0.01 mol/L
PBS溶液500 μL，反复吹打几下，11 000×g离心5 min；沉淀加50 μL 5 mol/L的碘化钾溶液，漩涡30 s，再加100 μL 0.9% NaCl和150 μL酚∶氯 仿(25∶24)溶液，震荡30 s，11 000×g离心5 min；取上清，加入等体积的异丙醇，混匀，11 000×g离 心5 min；沉淀加入500 μL无水乙醇洗涤，11 000×g离 心5 min。沉淀室温晾干，用TE缓冲液溶解。(2)口腔拭子基因组DNA提取试剂盒法：试剂盒购自天根生化科技有限公司，DNA提取按照试剂盒的操作说明进行。99名健康儿童和成人的唾液标本，解冻后直接用碘化钾法进行DNA提取。提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果用Bio-Rad GelDoc XR凝胶成像系统进行观察拍照。DNA含量和纯度用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)测定。
1.3 基因组DNA体外PCR扩增
以提取的唾液基因组DNA样品作为模板，在ABI 2720型PCR仪上扩增肿瘤蛋白TP53基因和唾液特异蛋白PRB-3基因。PCR反应体系按照东盛生物PCR Mix试剂盒的说明书进行配制，20 μL的反应体系含DNA模板50 ng(室温放置1周的唾液标本提取的DNA使用的PCR模板量为100 ng)，上、下游引物各1 μL(引物浓度为1 μmol/L)。TP53引物序列：P1为5′-CCCTTCCCAGAAAACCTACC-3′，P2为5′-CAGGCATTGAAGTCTCATGG-3′，扩增片段大小为192 PCR循环参数: 95℃ 3 min，然后95℃ 15 s、60℃ 30 s循环30次。PRB-3引物序列：P1为5′-ACAGCCTCCCCAGTAATCA-3′，P2为5′-TTAAAGGTAGAGCTATGAC-3′，扩增片段大小为1 261 bp；反应条件：95℃ 5 min，然后95℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1.5 min循环30次，72℃ 7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。另外，为了探讨唾液中微生物和食物残渣是否会干扰PCR扩增，课题组对碘化钾法提取的基因组DNA进行TP53基因荧光实时定量PCR扩增。定量PCR反应按照iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)说明书配制反应液，在Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR仪上进行扩增。20 μL反应体系含样本DNA模板10 ng，TP53引物序列和用量同前。定量PCR循环温度为95℃预温3 min，95℃ 15 s、60℃ 30 s循环35次。
1.4 统计学处理
利用SPSS 19.0 软件对DNA提取的得率和D260/D280、D260/D230值数据进行t检验，检验水准(α)为0.05。
2.1 唾液基因组DNA的得率和纯度比较
表 1显示了不同保存条件和提取方法提取的唾液基因组DNA的DNA提取效率(得率)，以及D260与D280、D230之间的比值。从DNA提取的得率来看，以使用试剂盒法提取新鲜唾液标本获得的DNA含量最高，以试剂盒法提取室温保存7 d的唾液标本获得的DNA含量最低。碘化钾法对两种不同保存方法获得的DNA含量居中，且两者差异不大。从提取质量来看，碘化钾法对新鲜唾液标本提取的DNA的D260/D280值为2.0左右，而且对室温保存样本获得DNA的D260/D280值更高；试剂盒法对两种保存方法获得的DNA的D260/D280值都在1.8左右。 并且碘化钾法提取的DNA的D260/D230值都明显低于试剂盒法，这些结果提示碘化钾法提取的DNA可能存在少量RNA和盐离子、糖类物质的残留。此外，碘化钾法对99名健康儿童和成人-80℃冻存唾液标本提取的基因组DNA的得率和D260/D280、D260/D230都与碘化钾法提取新鲜唾液标本的结果一致。
表 1(Table 1)
表 1 不同保存条件和提取方法提取的基因组DNA得率和纯度
Tab 1 Genomic DNA yield and purity from different conservation conditions and extraction methods
GroupnYield m/μgD260/D280D260/D230
Fresh saliva (KI method)61.91±0.151.99±0.050.73±0.26
Saliva at room temperature for 7 d (KI method)61.95±0.132.20±0.050.70±0.22
Fresh saliva (Kit method)62.64±0.341.81±0.021.55±0.53
Saliva at room temperature for 7 d (Kit method)60.51±0.111.83±0.091.53±0.59
Saliva preserved at -80℃ (KI method)991.89±0.461.96±0.100.75±0.95
KI: Potassium iodide. P&0.05 vs fresh saliva by KI method
表 1 不同保存条件和提取方法提取的基因组DNA得率和纯度
Tab 1 Genomic DNA yield and purity from different conservation conditions and extraction methods
2.2 唾液基因组DNA电泳结果
碘化钾法和试剂盒法对新鲜唾液样本提取的DNA用40 μL的TE缓冲液溶解，对室温放置1周的唾液标本提取的DNA用15 μL的TE缓冲液溶解。随机选择2个健康志愿者的8个DNA样品，各取5 μL点样在同一块凝胶上进行电泳，电泳结果如图 1。由图 1A可知，碘化钾法和试剂盒法对新鲜唾液样本提取的DNA在23 kb附近都有一条明显的主带，但是试剂盒法获得的DNA拖尾现象明显，提示DNA存在降解。两种DNA提取方法对于室温放置1周的唾液标本提取的DNA都存在一定程度的降解，尤其是试剂盒法获得的DNA样品降解严重，其中一个标本几乎没有明显的主带，提示碘化钾法对于室温放置7 d的唾液样本也能获得较好的提取效果，而试剂盒法则效果较差。此外，对碘化钾法提取的99份健康儿童和成人-80℃冻存唾液标本的基因组DNA，随机选择5个DNA样品进行电泳，其电泳图谱与碘化钾法对新鲜唾液标本的提取结果类似(图 1B)，提示碘化钾法对新鲜或-80℃冻存唾液标本提取的基因组DNA质量比较稳定。
图 1 唾液基因组DNA电泳结果
Fig 1 Electrophoresis results of salivary genomic DNA
9A: Genomic DNAs from different conservation conditions and extraction methods. M indicated λDNA/Hind Ⅲ mol 1-4 indicated DNAs extracted by the method of KI (1,2 indicated fresh saliva and 3,4 indicated saliva placed for a week at room temperature); 5-8 indicated DNA extracted by the method of Kit (5,6 indicated fresh saliva and 7,8 indicated saliva placed a week at room temperature). B: Genomic DNA was extracted by the method of KI from saliva of 5 healthy volunteers
2.3 唾液基因组DNA体外PCR扩增结果
以提取的基因组DNA作为模板，对TP53和PRB-3基因进行PCR扩增，各取5 μL扩增产物电泳检测。为了便于结果的比较，图 2A~2D仅展示了图 1A和1B中样本基因组DNA的PCR扩增结果。由图可以看出，不同来源的DNA样品对TP53和PRB-3基因都有非常好的PCR扩增效果，PCR产物大小与预期一致。其中不同来源的基因组DNA对TP53基因(短片段DNA)的PCR扩增效果没有差异，然而对PRB-3基因(长片段DNA)的PCR扩增效果则有明显差异，表现为新鲜样本的扩增效果较好，室温放置1周的唾液样本扩增效果较差。提示虽然两种提取方法之间没有明显的差异，但是不同的唾液保存方法却存在明显不同。此外，定量PCR结果(图 2E和2F)显示，图 1B中随机选择的5个唾液基因组DNA对TP53基因都有很好的荧光扩增曲线，并且它们的荧光熔解曲线只有一个特征峰，提示唾液中微生物和食物残渣不会干扰人源PCR扩增。
图 2 唾液基因组DNA的TP53和PRB-3基因PCR扩增
Fig 2 PCR amplification of TP53 and PRB-3 based on salivary genomic DNA
A,B: PCR amplifications of TP53 (192 bp) and PRB-3 (1 261 bp) genes based on eight genomic DNA samples from different conservation conditions and extraction methods,respectively. M indicated DS-2000 molecular weight marker,1-8 were described in Fig 1A; C,D: PCR amplifications of TP53 and PRB-3 genes based on five genomic DNA samples from Fig 1B; E,F: Fluorescence amplification and melt peak curves of TP53 gene by quantity PCR based on five genomic DNA of Fig 1B.
RFU：Relative fluorescence units
基因多态性研究已经广泛应用到临床检验、医药研究、法医鉴定和分子流行病的调查中，其样本来源大部分还是以血液为主。然而当血液标本的采集存在困难时，如健康人群，尤其是儿童和老年人，由于身体状况或其他原因不愿提供血液样品，则需要通过其他方式来获得DNA标本。理论上DNA可以从身体的任何细胞中获取。人类口腔黏膜为复层鳞状上皮，由多层细胞组成，其中基底层具有旺盛分裂能力，最表层的角化层已衰老退化，可以自然脱落到唾液中，也可在外力作用下剥落到载体上。这些脱落口腔细胞虽然细胞核固缩，但同样具有完整人类的基因组DNA序列，从而成为法医学和遗传学DNA多态性检测分型的生物性检验材料[]。目前，从唾液采集的方式到基因组DNA提取方法已有大量文献报道，并且一致显示从唾液标本中能够提取高质量的基因组DNA，满足各种DNA多态性的分析[, , , , ]，但是这些研究方法主要以商业试剂盒为主，价格较贵，操作烦琐。
本研究比较了碘化钾法和口腔拭子基因组DNA提取试剂盒法对唾液基因组DNA的提取，从结果来看，两种方法对新鲜唾液样本都能获得高质量的DNA，并且对TP53和PRB-3基因都能获得很好的PCR扩增效果。其中试剂盒法获得的DNA含量更高，但其DNA降解也更高。究其原因可能与试剂盒法的采样方式和DNA提取过程有关。口腔上皮细胞具有代谢旺盛、更新快、易脱落的特点。商业试剂盒采用灭菌棉签在口腔面颊内壁两侧各擦拭6次，而碘化钾法则采用直接吐唾液的方式收集唾液标本，因此前者收集到的口腔上皮细胞较多，其获得的DNA含量相应也较多。另外，收集到的口腔上皮细胞为衰老退化的细胞，并且细胞核已固缩，其DNA存在氧化、断裂、缺失和交联等现象，核苷酸长链的脆性增加，变得比较容易断裂。此时除了采样方式的物理剪切会增加DNA的断裂外，DNA提取过程如果过于烦琐，移液和离心过程的物理剪切必然会增加DNA的断裂降解。试剂盒法需要经过细胞裂解、过柱前处理、过柱、去杂质和溶解DNA等10个步骤，包括8次离心、6次漩涡、2次裂解液的移液操作，共计80 min。然而，碘化钾法只需要经过细胞裂解、去蛋白、沉淀、洗涤和溶解DNA 等5个常规的步骤，涉及4次离心、3次漩涡、2次裂解液的移液操作，共计25 min。因此，试剂盒棉签拭子的采样方式和烦琐的DNA提取过程是导致DNA降解的重要原因。陈嘉昌等[]也发现利用棉签拭子采集的标本提取的DNA会出现严重的降解，而且还呈现出明显的DNA ladder凋亡条带。他们认为口腔上皮细胞离开水相环境后，会加速其凋亡速度。同时，由于采样方式的物理剪切，核膜和质膜发生破裂，致使基因组DNA暴露在极易受降解的环境中。相对于试剂盒法，碘化钾法提取的唾液基因组DNA的D260/D280值偏高(2.0左右)、D260/D230值偏低(0.7左右)，该结果揭示碘化钾法获得的基因组DNA存在一定量的RNA和盐离子、糖类物质的残留。由于细胞裂解释放的RNA在高盐或有机溶剂中短期内很难彻底降解，再加上唾液中本身含有较多的糖类物质，因此去除RNA、增加DNA的洗涤次数对获得高纯度的基因组DNA非常必要。碘化钾法在DNA提取过程中未做RNA去除处理，并且只用无水乙醇洗涤DNA一次，因此其获得的DNA纯度偏低，建议在使用碘化钾法的时候可以适当增加一次DNA的洗涤。试剂盒法采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，并且对提取的DNA进行了2次以上的洗涤，因此其基因组DNA纯度较高。但是从PCR的结果来看，碘化钾法残留的RNA和盐离子杂质并不会影响PCR扩增。为了验证碘化钾法提取唾液基因组DNA的稳定性，本研究对99名健康儿童和成人-80℃冻存唾液标本进行了DNA提取，结果显示DNA含量虽然存在个体差异，但是DNA的质量较好且稳定可靠，对TP53和PRB-3基因都能获得很好的PCR扩增效果。对于个体差异的原因，可能与唾液量、口腔发育和口腔卫生的差异等有关。可见碘化钾法提取唾液基因组DNA简便快速、稳定可靠，适用于分子流行病大样本DNA的提取和多态性分析。
此外，为了考虑唾液样本运输的问题，本研究还做了唾液标本室温放置1周的DNA提取实验。研究结果显示，两种提取方法获得的基因组DNA都明显降解，但是碘化钾法提取的基因组DNA主带清晰，而试剂盒法的主带较弱甚至没有。另外，两种方法获得的DNA对TP53和PRB-3基因都能获得很好的PCR扩增效果，但是对于PRB-3基因长片段PCR扩增效果，室温放置1周的唾液样本明显差于新鲜标本。该结果说明室温放置1周的唾液标本虽然降解明显，但是获得的DNA足够用于1 kb左右DNA片段的PCR扩增。推测两种DNA提取方法的PCR结果没有差异而基因组DNA却存在差异的原因，可能与它们的唾液采集方式有关。棉签拭子采样时的物理剪切和干燥环境，会促进唾液标本DNA的降解(如前所述)。吐唾液的采样方式可以避免棉签拭子采样时的问题，而且其采集的唾液标本室温下会滋生大量口腔微生物的生长，从而增加其提取基因组DNA的含量。因此，碘化钾法提取的基因组DNA可能含有大量的微生物DNA。然而这些杂质DNA是否会影响唾液基因组DNA的多态性分析呢？本研究利用碘化钾法提取的唾液基因组DNA进行TP53基因的荧光定量PCR实验，结果发现它们都有很好的荧光扩增曲线，并且熔解曲线也没有双峰或多峰出现，该结果证实唾液中的微生物和食物残渣不会给基因多态性分析带来干扰。对于这一点，程家蓉等[]也获得类似的结果。
综上所述，碘化钾法和试剂盒法对于新鲜和室温放置1周的唾液标本都能获得足量的DNA用于PCR扩增，并且两种方法之间没有差异。直接吐唾液的采样方式虽然提取的DNA量略少些，但是其DNA降解程度较低，应作为唾液标本采集的首选。相对于商业试剂盒法，碘化钾法经过大量唾液标本的验证，不仅廉价、简便，而且能快速从唾液中提取足量和高质量的基因组DNA，为分子流行病学的研究提供了简易、方便、对人体无损伤的有效方法。
Koni A C, Scott R A, Wang G, Bailey M E, Peplies J, Bammann K, et al. DNA yield and quality of saliva samples and suitability for large-scale epidemiological studies in children [J]..
Rogers N L, Cole S A, Lan H C, Crossa A, Demerath E W. New saliva DNA collection method compared to buccal cell collection techniques for epidemiological studies [J]..
Nemoda Z, Horvat-Gordon M, Fortunato C K, Beltzer E K, Scholl J L, Granger D A. Assessing genetic polymorphisms using DNA extracted from cells present in saliva samples [J]..
朱伟锋,罗达亚,涂 硕,张霞丽,揭克敏,万福生. 盐析法快速提取口腔拭子DNA[J]. 第二军医大学学报,0-1374. Zhu W F, Luo D Y, Tu S, Zhang X L, Jie K M, Wan F S, et al. A rapid salting out method for DNA extraction from buccal swabs[J]..
陈龙辉,杨泽民,李茹柳,林传权,张 杰,陈蔚文. 柠檬酸滤纸面积及浓度对刺激健康人唾液分泌和唾液淀粉酶活性改变的影响[J]..
Loparev V N, Cartas M A, Monken C E, Velpandi A, Srinivasan A. An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell lines to identify infectious agents [J]..
张 越,梅善宗. 微量口腔粘膜脱落细胞检材STR位点的法医学检测分型[J]..
陈嘉昌,张红宇,彭瑾瑜,付艳艳,叶伟超,常 弘. 从唾液获取人体DNA的简易方法与应用[J]..
程家蓉,关赛芳,王学励,韩丽华,高玉堂. 从人口腔细胞获取基因组DNA作基因多态性分析的可行性[J]..天根DP117-无内毒素质粒大提试剂盒说明书34_质粒提取试剂盒-牛bb文章网
天根DP117-无内毒素质粒大提试剂盒说明书34 质粒提取试剂盒
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产品简介本试剂盒采用独特的硅胶模吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。同时采用特殊的 溶液P4和过滤器CS1，可有效的出去内毒素、蛋白质杂志；整个提取过程仅需1h，方便快捷。使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和细胞转染多种细胞等试验。推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100ml，得率一般在500-1500μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200-600μg左右。 注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。1. 溶液P1在使用前先加入RNase A （将试剂盒中提供的RNase A全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。2. 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。3. 使用前先检查平衡液BL，溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。4. 注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。5. 使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动。6. 提取的质粒量与细菌培养浓度，质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65-70℃水浴中预热，可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。7. 实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。8. 用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。 质粒DNA 浓度及纯度检测得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。操作步骤：1. 柱平衡步骤：向吸附柱CP6中（2.5ml的平衡液BL，8000rpm（~8228×g）离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。（用平衡液处理过的柱子最好立即使用）。2. 取100ml（根据培养菌体的浓度选择合适的量，低拷贝推荐用200ml）过夜培养的菌液加入离心管，室温8000rpm（~8228×g）离心3min收集菌液，尽量吸除上清。注意：菌液较多时候可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。3. 尽量吸除上清，为确保上清液全部吸除，请用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。4. 向留有菌体沉淀的离心管中加入8ml溶液P1（），使用移液器或涡旋振荡器彻底裂解悬浮细菌细胞沉淀。注意：请务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解效果，导致提取量和纯度偏低，对于低拷贝质粒，加大菌体用量的同时按比例增加P1、P2、P4的用量。5. 向离心管中加入8ml溶液P2，立即温和地上下翻转6~8次，室温放置5min。 注意：温和地混匀，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。6. 向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6~8次，充分混匀，至溶液出现白色分散絮状沉淀。然后室温放置10min左右。8000rpm（~8228×g）离心5-10min，使白色沉淀离至管底（可适当增加离心时间），将全部溶液小心倒入过滤器CS1中（请避免倒入大量沉淀而阻塞过滤器），慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50ml的管中（自备）。注意：加入溶液P4后应立即混匀，避免产生局部沉淀。如果离心后倒入过滤器CS1中的溶液有白色沉淀也不会影响过滤，如果菌体过多(&100ml)，推荐延长离心时间至20-30min。7. 向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多容易导致RNA污染），上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）。 注意：过滤后滤液会损失，根据损失的不同请加入不同体积的异丙醇，吸附柱CP6的最大容积为15ml，所以需要分2次过柱。8. 室温8000rpm（~8228×g）离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。注意：将第7步中所得溶液分2次过柱，每次均按以上条件操作。9. 向吸附柱CP6中加入10ml漂洗液PW（），8000rpm（~8228×g）离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。10. 重复操作步骤9。11. 向吸附柱CP6中加入3ml无水乙醇，8000rpm（~8228×g）离心2min，倒掉废液。12. 将吸附柱CP6重新放回收集管中，8000rpm（~8228×g）离心5min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR等）实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP6开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附残料中残余的漂洗液。13. 将吸附柱CP6置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱液TB，室温放置5min，然后室温8000rpm（~8228×g）离心2min。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管，-20℃保存。注意：为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤13。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.5-8.0范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。洗脱缓冲液用量的多少主要是根据质粒的拷贝数以及实验所需要的浓度来确定。洗脱缓冲液体积不少于1ml，体积过小影响回收效率。DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。可选步骤：（如果需要更好浓度的质粒，可进行如下操作）：14. 每1ml洗脱液加入1.42ml异丙醇以及0.42ml 5M NaCl （客户自备），混匀，室温放置5min，8000rpm（~8228×g）离心10min，小心弃上清。15. 加入0.5ml的70%乙醇洗涤沉淀，室温8000rpm（~8228×g）离心5min，小心弃乙醇。16. 重复步骤15。17. 空气中干燥沉淀约5-10min，根据需要用适当体积的TB缓冲液溶解沉淀。欢迎您转载分享：
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