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枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化
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枯草芽孢杆菌培养基
范文一：经验交流47出。脑充血、水肿,切面可见白质和灰质有小出血点。脊髓也有类似变化。3　实验室诊断　(1)无菌取病死猪肝、脾、肾等实质器官直接做组织触片,革兰氏染色镜检,为革兰氏阳性的成对、单个、短链球菌,其中成对排列的双球菌占多数。菌体呈卵圆型,有荚膜。同时将病料接种于10%马血琼脂平板上,置恒温培养箱中37℃培养24h,出现灰色、半透明的黏液状菌落。菌落周围有明显溶血环,低倍镜观察,溶血环中无红血球存在,呈Β型溶血。取菌落涂片染色镜检,状排列的革兰氏阳性链球菌。(2的新鲜血液1匀,加盖玻片,发现红细胞表面呈锯齿状、星状或菠萝状等不规则形状;上下震动或左右摆动。血浆中有球形、杆形的闪光虫体,这些虫体能上下左右的伸展、旋转。每个压片的各个视野,均可看到红细胞被虫体附着和血浆中运动着的虫体。(3)新鲜血液涂片,瑞氏染色,油镜下可见红细胞边缘和游离于血浆中的附红细胞体被染成紫蓝色,而血小板则被染成淡红色。4　防治　(1)应用“百毒杀”消毒剂对猪舍、用具及(2)消除饲养环境中应周围环境彻底消毒,1次（）日。激因素,加强饲养管理,提高机体抵抗力,并消灭有可能传播附红细胞体的传播媒介(如蚊、蝇、虱子等)。(3)对病猪,用新胂凡纳明,按25mg（）kg体重肌肉注射,1次（）日。青霉素按5万IU（）kg体重,链霉素40mg（）日。同时采用kg体重肌肉注射,2次（）辅助疗法,静脉注射10%葡萄糖生理盐水和维生素C,4d后治愈。(4)全场用土霉素按800g（）t饲料拌料,连喂5d后减到400g（）t饲料,饲喂半个月,至今再未发现类似疫情。(胶南市兽医卫生监督所　王孟良徐洪清　孙吉谦　王风莲　266400青岛市经济技术开发区友谊公司　宋开彬)1.2　培养基　营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、固体培养基,全都自行制做。2　方法2.1　菌种培养　将芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上,然后在恒温箱内37℃培养24h,即可见到一层白色圆整、边缘光滑的枯草芽孢杆菌菌落。将固体培养基上已培养好的芽孢杆菌无菌接种到5ml,摇匀,37,100ml(含5%,h备用。2.1kg、玉米蛋白粉g、NaCl5g充分混匀。将上述原料平均分为4组:1组不添加任何物质;2组中加0.5%葡萄糖;3组加0.5%硫酸铵;4组加0.5%葡萄糖和0.5%硫酸铵的混合物。以上4组各加125ml自来水拌湿,用NaOH调pH值至中性,装入聚丙烯灭菌袋中,121℃高压灭菌20min备用。2.3　接种　将以上培养的菌种接种于固体培养基中,每组25ml,充分混匀后37℃分别恒温培养24、48、72h,培养基厚度以3～5cm为宜,24h翻动1次。2.4　细菌计数　分别在培养24h、48h、72h时收集部分固体培养基,进行细菌计数。3　结果3.1　细菌数量　不同培养基配方及不同培养时间中细菌的生长繁殖情况见表1。表1　不同时间各组细菌总数时间(h)2448721组4.0×91.0×82组2.8×91.6×93组1.0×84.0×84组0.8×81.4×8平均枯草芽孢杆菌的培养细菌固体培养具有对设备条件要求低、耗能低、细菌繁殖量高的特点。枯草芽孢杆菌作为微生物饲料添加剂具有广泛的应用价值。本实验通过计数细菌的繁殖数量,探讨了最适于枯草芽孢杆菌生长的固体培养基的组成和收获时间。1　材料1.1　菌种　枯草芽孢杆菌菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。表1显示,在不同的培养时间和不同营养基配方中,以2组培养72h细菌总数最高,4组次之。3.2　培养基成分的影响　4种不同培养基中,以2组平均细菌繁殖量最高,3组最少。3.3　培养时间的影响　在进行细菌计数的3d内,1组的细菌总数在第2天达到峰值后逐渐下降;2组、4组的细菌总数3d后仍处于上升阶段;3组的细菌总数2d后达到稳定期。4　讨论本试验表明,在基础固体培养基中适当加入一些营养物质有利于细菌的生长繁殖。适量添加葡萄糖后可增加细菌的收获量,而添加硫酸铵则减慢了48山东畜牧兽医细菌的繁殖速度。其原因可能是所加硫酸铵量过大,作为胺类代谢产物抑制了细菌的生长。枯草杆菌在不同固体培养基中生长繁殖速度不同。在添加葡萄糖的固体培养基中,细菌可持续生长72h以上。在没有葡萄糖或仅添加了硫酸铵的固体培养基中,培养48h以后,细菌的数量不再增加甚至下降。在生产实践中随着培养时间的延长对能源的消耗和污染杂菌的机会都会增加,应根据生产需要,选择最佳的收获时间。()式,确定畜产品收购的保护价格,确保农民在养殖低谷时的最低收入。2.4　加强基层畜牧兽医站建设　各乡镇应从畜牧业发展的大局出发,给予乡镇畜牧兽医站足够的人员和经费,加强技术培训,不断提高畜禽疾病的诊治水平和疫情的监测手段,以适应畜牧业快速发展的需要。(257300)动物防疫网络化管理,是新时期农业部为提高我国动物防疫管理工作的质量和效率,实现动物防疫管理工作由传统走向现代的一项重大举措,是我国兽医工作与国际接轨的必然需求。2003年我省被农业部列入首批动物防疫网络化管理试点省份以来,这一现代化的管理手段,目前已对我省的动物防疫工作产生了重要影响,极大地提高了我省动物防疫信息传递速度和疫情处理的快速反应能力。1　强化领导,提高认识动物防疫网络化建设工作是当前动物防疫工作的一件大事,是从根本上提高动物防疫管理水平的现代化管理手段。各级畜牧兽医行政管理部门应按照动物防疫网络化建设工作实施进度,严格实行主管领导负责制,层层建立动物防疫网络化建设工作责任制,切实将各项工作落到实处。2　加强动物防疫网络设施建设各地应按照农业部制定的《动物防疫网络化管理软件运行所需软、硬件要求》,配置有关动物防疫网络设施。并应落实好经费,配备动物防疫网络专用微机及相关配置,为实现动物疫情网络化管理提供基本保证。3　严格按照农业部的要求,认真开展工作动物防疫网络化管理工作是一项政策性、技术性很强的工作。按照农业部《动物防疫网络化管理(试行)要求,动物防疫网络传输工软件使用规范》作,必须专机、专线专用,专人操作。防疫管理人员必须熟知国家有关法律、法规,掌握软件的安装、卸载、专线上网、数据传输、数据库备份及网络信息录入、网络维护等基本操作技能。应针对动物防疫网络化管理软件所涉及的内容,认真组织各基层防疫单位进行学习、落实,督促各基层动物防疫单位,严格按动物防疫网络化报表,填报项目要求认真填报,并逐一进行核实,确保近几年来,随着农业产业化结构调整,畜牧业在大农业中所占的比重日趋增大,畜牧养殖基地建设越来越成为影响畜牧业发展的一大桎梏。1　制约畜牧业发展的因素1.1　土地因素　土地是建设饲养小区、发展规模化养殖的必要条件。由于农民承包土地30年不变,有些地区乡镇、村不能调整农民承包的土地,这就制约着饲养小区的规划和建设。1.2　资金缺乏　资金是畜牧养殖基地建设的第一要素,从目前看,建设高标准饲养小区,需要相当数量的资金。大部分饲养户在发展规模化养殖中由于贷款难、资金担保手续繁杂,有许多想建设的饲养小区不能建设。1.3　技术人员缺乏　乡镇畜牧兽医站的工作人员是乡村畜牧业生产的技术主力。由于许多地区乡镇畜牧兽医站“名存实亡”,存在着人员老化、知识馈乏的问题,有诊不能接、有病治不好的现象普遍存在,难以适应畜牧业迅速发展的需求。2　发展畜牧业的对策2.1　切实解决土地问题　允许反租倒包、放宽土地使用政策等方式,打破束缚畜牧养殖基地建设的条条框框,允许养殖户与种植户协商,在承包的土地中规划饲养小区或建设养殖场。2.2　拓宽资金来源渠道　吸引其他行业资金的转移,动员各界有识之士的资金向高利润、低风险的畜牧业转移,条件成熟的地区乡镇、村可创办股份制饲养小区(场)。金融部门简化贷款手续,为养殖户提供方便,适度扩大贷款金额和延长贷款时间,积极推行“五户联保”的贷款模式。2.3　建立合理、紧密的利益机制　畜牧龙头企业要实行“合同鸡、合同牛、合同羊、合同奶”的生产模原文地址：经验交流47出。脑充血、水肿,切面可见白质和灰质有小出血点。脊髓也有类似变化。3　实验室诊断　(1)无菌取病死猪肝、脾、肾等实质器官直接做组织触片,革兰氏染色镜检,为革兰氏阳性的成对、单个、短链球菌,其中成对排列的双球菌占多数。菌体呈卵圆型,有荚膜。同时将病料接种于10%马血琼脂平板上,置恒温培养箱中37℃培养24h,出现灰色、半透明的黏液状菌落。菌落周围有明显溶血环,低倍镜观察,溶血环中无红血球存在,呈Β型溶血。取菌落涂片染色镜检,状排列的革兰氏阳性链球菌。(2的新鲜血液1匀,加盖玻片,发现红细胞表面呈锯齿状、星状或菠萝状等不规则形状;上下震动或左右摆动。血浆中有球形、杆形的闪光虫体,这些虫体能上下左右的伸展、旋转。每个压片的各个视野,均可看到红细胞被虫体附着和血浆中运动着的虫体。(3)新鲜血液涂片,瑞氏染色,油镜下可见红细胞边缘和游离于血浆中的附红细胞体被染成紫蓝色,而血小板则被染成淡红色。4　防治　(1)应用“百毒杀”消毒剂对猪舍、用具及(2)消除饲养环境中应周围环境彻底消毒,1次阅读详情：日。激因素,加强饲养管理,提高机体抵抗力,并消灭有可能传播附红细胞体的传播媒介(如蚊、蝇、虱子等)。(3)对病猪,用新胂凡纳明,按25mg阅读详情：kg体重肌肉注射,1次阅读详情：日。青霉素按5万IU阅读详情：kg体重,链霉素40mg阅读详情：日。同时采用kg体重肌肉注射,2次阅读详情：辅助疗法,静脉注射10%葡萄糖生理盐水和维生素C,4d后治愈。(4)全场用土霉素按800g阅读详情：t饲料拌料,连喂5d后减到400g阅读详情：t饲料,饲喂半个月,至今再未发现类似疫情。(胶南市兽医卫生监督所　王孟良徐洪清　孙吉谦　王风莲　266400青岛市经济技术开发区友谊公司　宋开彬)1.2　培养基　营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、固体培养基,全都自行制做。2　方法2.1　菌种培养　将芽孢杆菌菌种在无菌条件下接种于营养琼脂培养基斜面上,然后在恒温箱内37℃培养24h,即可见到一层白色圆整、边缘光滑的枯草芽孢杆菌菌落。将固体培养基上已培养好的芽孢杆菌无菌接种到5ml,摇匀,37,100ml(含5%,h备用。2.1kg、玉米蛋白粉g、NaCl5g充分混匀。将上述原料平均分为4组:1组不添加任何物质;2组中加0.5%葡萄糖;3组加0.5%硫酸铵;4组加0.5%葡萄糖和0.5%硫酸铵的混合物。以上4组各加125ml自来水拌湿,用NaOH调pH值至中性,装入聚丙烯灭菌袋中,121℃高压灭菌20min备用。2.3　接种　将以上培养的菌种接种于固体培养基中,每组25ml,充分混匀后37℃分别恒温培养24、48、72h,培养基厚度以3～5cm为宜,24h翻动1次。2.4　细菌计数　分别在培养24h、48h、72h时收集部分固体培养基,进行细菌计数。3　结果3.1　细菌数量　不同培养基配方及不同培养时间中细菌的生长繁殖情况见表1。表1　不同时间各组细菌总数时间(h)2448721组4.0×91.0×82组2.8×91.6×93组1.0×84.0×84组0.8×81.4×8平均枯草芽孢杆菌的培养细菌固体培养具有对设备条件要求低、耗能低、细菌繁殖量高的特点。枯草芽孢杆菌作为微生物饲料添加剂具有广泛的应用价值。本实验通过计数细菌的繁殖数量,探讨了最适于枯草芽孢杆菌生长的固体培养基的组成和收获时间。1　材料1.1　菌种　枯草芽孢杆菌菌种购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。表1显示,在不同的培养时间和不同营养基配方中,以2组培养72h细菌总数最高,4组次之。3.2　培养基成分的影响　4种不同培养基中,以2组平均细菌繁殖量最高,3组最少。3.3　培养时间的影响　在进行细菌计数的3d内,1组的细菌总数在第2天达到峰值后逐渐下降;2组、4组的细菌总数3d后仍处于上升阶段;3组的细菌总数2d后达到稳定期。4　讨论本试验表明,在基础固体培养基中适当加入一些营养物质有利于细菌的生长繁殖。适量添加葡萄糖后可增加细菌的收获量,而添加硫酸铵则减慢了48山东畜牧兽医细菌的繁殖速度。其原因可能是所加硫酸铵量过大,作为胺类代谢产物抑制了细菌的生长。枯草杆菌在不同固体培养基中生长繁殖速度不同。在添加葡萄糖的固体培养基中,细菌可持续生长72h以上。在没有葡萄糖或仅添加了硫酸铵的固体培养基中,培养48h以后,细菌的数量不再增加甚至下降。在生产实践中随着培养时间的延长对能源的消耗和污染杂菌的机会都会增加,应根据生产需要,选择最佳的收获时间。()式,确定畜产品收购的保护价格,确保农民在养殖低谷时的最低收入。2.4　加强基层畜牧兽医站建设　各乡镇应从畜牧业发展的大局出发,给予乡镇畜牧兽医站足够的人员和经费,加强技术培训,不断提高畜禽疾病的诊治水平和疫情的监测手段,以适应畜牧业快速发展的需要。(257300)动物防疫网络化管理,是新时期农业部为提高我国动物防疫管理工作的质量和效率,实现动物防疫管理工作由传统走向现代的一项重大举措,是我国兽医工作与国际接轨的必然需求。2003年我省被农业部列入首批动物防疫网络化管理试点省份以来,这一现代化的管理手段,目前已对我省的动物防疫工作产生了重要影响,极大地提高了我省动物防疫信息传递速度和疫情处理的快速反应能力。1　强化领导,提高认识动物防疫网络化建设工作是当前动物防疫工作的一件大事,是从根本上提高动物防疫管理水平的现代化管理手段。各级畜牧兽医行政管理部门应按照动物防疫网络化建设工作实施进度,严格实行主管领导负责制,层层建立动物防疫网络化建设工作责任制,切实将各项工作落到实处。2　加强动物防疫网络设施建设各地应按照农业部制定的《动物防疫网络化管理软件运行所需软、硬件要求》,配置有关动物防疫网络设施。并应落实好经费,配备动物防疫网络专用微机及相关配置,为实现动物疫情网络化管理提供基本保证。3　严格按照农业部的要求,认真开展工作动物防疫网络化管理工作是一项政策性、技术性很强的工作。按照农业部《动物防疫网络化管理(试行)要求,动物防疫网络传输工软件使用规范》作,必须专机、专线专用,专人操作。防疫管理人员必须熟知国家有关法律、法规,掌握软件的安装、卸载、专线上网、数据传输、数据库备份及网络信息录入、网络维护等基本操作技能。应针对动物防疫网络化管理软件所涉及的内容,认真组织各基层防疫单位进行学习、落实,督促各基层动物防疫单位,严格按动物防疫网络化报表,填报项目要求认真填报,并逐一进行核实,确保近几年来,随着农业产业化结构调整,畜牧业在大农业中所占的比重日趋增大,畜牧养殖基地建设越来越成为影响畜牧业发展的一大桎梏。1　制约畜牧业发展的因素1.1　土地因素　土地是建设饲养小区、发展规模化养殖的必要条件。由于农民承包土地30年不变,有些地区乡镇、村不能调整农民承包的土地,这就制约着饲养小区的规划和建设。1.2　资金缺乏　资金是畜牧养殖基地建设的第一要素,从目前看,建设高标准饲养小区,需要相当数量的资金。大部分饲养户在发展规模化养殖中由于贷款难、资金担保手续繁杂,有许多想建设的饲养小区不能建设。1.3　技术人员缺乏　乡镇畜牧兽医站的工作人员是乡村畜牧业生产的技术主力。由于许多地区乡镇畜牧兽医站“名存实亡”,存在着人员老化、知识馈乏的问题,有诊不能接、有病治不好的现象普遍存在,难以适应畜牧业迅速发展的需求。2　发展畜牧业的对策2.1　切实解决土地问题　允许反租倒包、放宽土地使用政策等方式,打破束缚畜牧养殖基地建设的条条框框,允许养殖户与种植户协商,在承包的土地中规划饲养小区或建设养殖场。2.2　拓宽资金来源渠道　吸引其他行业资金的转移,动员各界有识之士的资金向高利润、低风险的畜牧业转移,条件成熟的地区乡镇、村可创办股份制饲养小区(场)。金融部门简化贷款手续,为养殖户提供方便,适度扩大贷款金额和延长贷款时间,积极推行“五户联保”的贷款模式。2.3　建立合理、紧密的利益机制　畜牧龙头企业要实行“合同鸡、合同牛、合同羊、合同奶”的生产模
范文二：菌种的培养1.1材料1.1.1 菌种枯草芽孢杆菌。1.1.2 培养基（1）LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml，pH为7，（可溶性淀粉20g）琼脂20g。（2）筛选用培养基：含有2%可溶性淀粉的LB培养基。（3）种子培养基：豆饼粉4%，玉米粉3%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，NH4Cl0.15%，H2O。（4）发酵培养基：豆饼粉5.6%，玉米粉7.2%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.4%，【2】 NH4Cl0.13%，CaCl20.13%，α—淀粉酶50g。1.1.3 主要试剂蔗糖、葡萄糖、淀粉、玉米淀粉、麦芽糖、酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、氯化铵、硫酸锰、硫酸镁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙。1.1.4 仪器设备控温摇床、高压蒸气灭菌锅、电子天平、pH测定仪、无菌操作台和紫外分光光度计。1.2方法1.2.1 培养基的制备(1)称量按培养基配比依次准确地称取酵母膏、NaCl、蛋白胨放入烧杯中，并在烧杯中加入少量蒸馏水。注：酵母膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，酵母膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片【3】。(2)溶化可溶性淀粉溶液的配制方法：将所需克数的可溶性淀粉放入一个小烧杯中，加入少量蒸馏水，搅拌成糊状，然后将糊状溶液均匀倒入少于培养基总体积的沸水中，一边搅拌一边加热，待其溶化成透明状后继续在电炉上加热5分即制成可溶性淀粉溶液。 如果配制固体培养基时，将已准备好的可溶性淀粉溶液倒入烧杯中，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，补水到所需的总体积。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按2%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间【4】。 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不能用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影响细菌生长。(3)调pH培养基配好以后，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直到pH达7为止；反之，用1mol/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精细的微生物，其pH的调节可用酸度计进行【5】。注意：pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度，配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固，因此应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。(4)分装按照实验要求，可将配置的培养基分装入试管内或三角瓶中。液体分装：分装的高度以试管高度的1/4左右为宜；分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶的一半为宜。固体分装：分装于试管中的应不超过试管的1/5，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的量以不超过一半为宜。(5)加塞培养基分装完毕后，在试管口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。(6)包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，外边再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称，组别，配制日期。三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结扎好，使用时容易解开，同样注明。(7)灭菌将配置好且包扎完毕的固体、液体培养基及本实验涉及的试管、三角瓶等及400ml纯水于高压灭菌器中以0.14Mpa，121℃条件下高压蒸汽灭菌20分钟。(8)斜面搁置将培养基冷却至50℃左右时放置斜面，斜面在试管的1/2处为宜，待斜面凝固后，放置于冰箱中待用。1.2.2菌种的筛选与保藏(1)倒平板将实验配制好的培养基加热溶化，待冷却至55—60℃时，倒平板9皿【6】。(2)稀释用接种环取菌种，放入盛90ml无菌水的三角瓶中，振摇。用一支1ml无菌吸管吸取1ml菌液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6不同稀释度的菌液。(3)划线将平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5、10-6三种稀释度（共三组）然后用接种环分别沾取浓度为10-4、10-5、10-6稀释液并对号在相应平板上划线，室温下静止5—10min，使菌液吸附进培养基。(4)培养将培养基平板倒置于37℃的培养箱中，培养2—3天，观察淀粉圈。对有淀粉圈的菌落，测量淀粉圈的直径D，菌落直径r，计算D/r的比值，可进行拍照，选择淀粉圈较大的菌落作为后续实验的菌种【7】。(5)接种接种到斜面培养基中，标注上日期等信息。放入恒温培养箱中培养作为一级种子。(6)保藏斜面置于37℃的培养箱中，培养2—3天，观察菌种长势好坏，若菌种长势好则将其放入冰箱中保藏，若长势不好则需多次斜面转接。
范文三：枯草芽孢杆菌常用培养基配方：1L蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂枯草芽孢杆菌原生质体的制备1 培养枯草芽孢杆菌取亲本菌株T4412、TT2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(CM)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 mL 菌液转接入装有20 mL 液体完全培养基的250 mL 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其终浓度为0.3 u/mL，继续振荡培养2 h。2. 收集细胞各取菌液10 mL，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 mL SMM 中，每mL 约含108～109 活菌为宜。3. 总菌数测定各取菌液0.5 mL，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。4. 脱壁二株亲本菌株各取5 mL 菌悬液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/mL，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 mL 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。5. 剩余菌数测定取0.5 mL 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 mL，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。
范文四：植物病 学 理报ACT
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玉 米粉1 5%:,,.10 %C,萄葡糖5%郁3 Lm、高提到、1 2.x10,,‘豆 粉饼4u /mLf。鱼粉?0.5%4.C,a0O.5%?Z(HN).:504对于
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析法a收稿期日:025 一一5;: 修 回日期20 051
范文五：22(增刊)82-88　　　　　　中国生物防治　ChineseJournalofBiologicalControl　　　　　　　2006年10月枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化张丽霞1,2,李荣禧1,王　琦23,梅汝鸿2(11内蒙古农业大学农学院,呼和浩特　中国农业大学植物病理学系,北京　100094)摘要:在摇瓶发酵条件下,采用Plackett2Burman设计法和响应面分析法对枯草芽孢杆菌B908菌株的培养基配方进行优化,确定了影响B908菌株发酵液含菌量的3个重要因子依次为玉米粉、碳酸钙和豆饼粉;对这3个因子进行爬坡路径试验,通过响应面分析法确定了主要影响因子的最佳条件。优化后的培养基配方使摇瓶发酵液每毫升的含菌量从016×109个/ml提高到个/ml。关　键　词:枯草芽孢杆菌;发酵培养基;Plackett2中图分类号:S476111　　文献标识码:A()2Medium2xia,LIRong2xi,WANGQi,MEIRu2hongDepartmentofAgronomy,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,InnerMongolia010018,China)Abstract:Plackett2BurmandesignandresponsesurfaceanalysiswereusedtooptimizethefermentationmediumofBacillussubtilisB9081BasedontheresultsofPlackett2Burmandesign,importantfactorsaf2fectingtheyieldofBacillussubtilisB908werecornflour,beanflourandCaCO31Then,thethreefactorswerefurtheroptimizedusingresponsesurfaceanalysis.Theoptimizedfermentationmediumallowedtheproductiontobeincreasedfrom616×109sporesml-1tosporesml-11Keywords:BPlackett2Bresponsesurfaceanalysis枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B908是中国农业大学植物病害生物防治研究室从水稻根际土壤中分离获得的有益菌株,对水稻纹枯病、棉花枯萎病、小麦赤霉病等多种植物病害有明显的防治效果[1],应用前景广阔。该芽孢杆菌已经制成制剂而应用于农业生产。制剂中的芽孢含量是影响制剂应用效果的关键因素。本研究通过优化发酵培养基配方,提高发酵液中芽孢含量,降低生产成本,提高制剂的生防效果。目前,生产上枯草芽孢杆菌的发酵培养基配方的主要成分有玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉以及其它一些微量元素。但由于配比的不合适使得发酵液含菌量不高。发酵培养基的成分对微生物发酵液含菌量有很大的影响[2]。调整培养基中各物质的配比,可以改善细菌的生长条收稿日期:基金项目:国家863科技攻关项目作者简介:张丽霞(1979-),女,硕士;3通讯作者,博导,电话:,E2mail:wangqi@。82增刊　　　　　　　　　　　　张丽霞等:枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化件,提高发酵液含菌量。本研究针对应用于生产上的一种发酵培养基作为初始发酵培养基,采用Plackett2Bruman设计与响应面分析方法(RSA)相结合的试验统计方法进行优化,确定了该培养基中影响B908发酵液含菌量的主要因子及其最佳配比:玉米粉(1310g/L)、CaCO3(710g/L)和豆饼粉(2015g/L),使B908菌株的发酵液含菌量提高。1　材料与方法111　供试菌株枯草芽孢杆菌B908,从水稻根际土壤中分离获得,由中国农业大学植物病理学系植物病害生物防治研究室提供。112　培养基液体种子培养基:肉汁胨培养基[3]。初始发酵培养基:玉米粉10g,葡萄糖5g,豆饼粉15g,鱼粉5g,CaCO35g,(NH4)2SO41g,K2HPO4013g,MgSO4?7H2O012g,MnSO4?H212g,水1000ml。113　培养基配方的优化方案设计11311　Plackett2Burman设计法[4]　养基中的9,以X1、X4、X7、X10162X3、X5、X6、X8、X9、X11、X12、X14分别代表玉米粉、NH4)2SO4、O3K2HPO4、MgSO4?7H2O、MnSO4?H2O,每个因素取高低两个水平(1)。11312　最陡爬坡路径方法[5]确定重要因子的最适浓度范围　影响发酵液含菌量的重要影响因子确定后,对这些因子进行最陡爬坡路径试验,以初始发酵培养基的浓度为基础,以适当的梯度改变重要影响因子在发酵培养基中的浓度,其他组分取低水平即初始发酵培养基的浓度,考察发酵液含菌量变化趋势,确定最适浓度范围。11313　响应面分析法[6]确定最佳发酵培养基配方　响应面分析法是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。其中,Box2behnken和Box2Wilson中心组合设计是两种较常用的RSA法。Box2behnken法适用于2～5个因素的优化试验,每个因素取3个水平,以-1,0,1编码。根据相应的试验表进行试验后,对数据进行二次回归拟合,得到带交互项和平方项的二次方程,最后在一定的水平范围内求出最佳值,最后进行模型验证[7]。114　发酵条件在500ml三角瓶中装50ml培养基,灭菌。调其初始pH值到712,以2%的接菌量接菌(即在每100ml的液体培养基中接入2ml浓度为1×108/ml的芽孢悬浮液);接菌后于温度为30℃,转速为200r/min的摇床内进行发酵培养;每2h取样,显微镜检查,芽孢形成率达80%时,测其含菌量。115　含菌量测定计数器计数法[3]。3次重复。2　结果与分析211　初始发酵培养基中主要影响因子的确定对初始发酵培养基组分中的9个因素进行了考察,玉米粉、豆饼粉和CaCO3作为重要影响83中国生物防治　　　　　　　　　　　　　　　第22卷因子的可信度大于85%,对发酵液含菌量影响显著,是影响发酵液含菌量的主要影响因子(表1、表2)。这3种组分对发酵液含菌量均是正影响(t为正值)。表1　Plackett2Burman试验设计与结果试验次数920X111-1--1-1--11-1-1X2-11-1X3111X411-111-1--1-1-1-1X5-111-111-1--1-1-1X6-1-111-111-1--1-1X7-1-1-111-111-1--1-1X8-1X91X10-1-1X1111X12-1-1-1X13111X-1-1-1-11-11-1-111-1X-1-1-11-111-1-11-1X-11-1-111-111-1-1-1菌量(109个/ml)301-1-1-1-1-1-1-11-11-11-111111-1-1-1-1-1-1-11-11--1-1-1-1-1-11-11-111-1-11--1111-11-1--1-1-1-111-1-1-1-111-1-111111-1-1111-1-11-11111111-11-1-1-11-1-1-1-1-1表2　Plackett2Burman试验分析结果因子符号X2X3X5X6X8X9X11X12X因子玉米粉葡萄糖豆饼粉鱼粉CaCO3(NH4)2SO4K2HPO4MgSO4?7H2OMnSO?HO水平(浓度g/L)25-01202tPr>|t|重要性排序212　培养基重要影响因子的最适浓度范围的确定对玉米粉、豆饼粉和CaCO3三个主要影响因子进行最陡爬坡路径试验,确定此三因子的最适浓度范围(表3)。随玉米粉、豆饼粉和CaCO3浓度的增加,发酵液含菌量的变化趋势先上升后下降(表3),玉米粉1310g/L,豆饼粉2015g/L,CaCO37g/L时对应的发酵液含菌量达到最大值,为三因子的最大响应值区域。213　培养基重要影响因子的最佳浓度的确定三个重要因子的最适浓度范围确定后,以玉米粉1310g/L,豆饼粉2015g/L,CaCO3710g/L84增刊　　　　　　　　　　　　张丽霞等:枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化为中心点施行响应面分析,各自变量水平见表4,试验设计及结果见表5。表3　最陡爬坡路径试验设计及结果试验次数1234567玉米粉(g/L)1415豆饼粉(g/L)2510CaCO(g/L)菌量(109个/ml)表4　响应分析法设计因子及水平列表符号X1X2X3因子玉米粉豆饼粉CaCO3水平(浓度g/L)-115　1---110002-11-11-1-X-1-111000菌量(个/ml)011179对试验数据进行回归分析,得二次多项式方程:Y1=75X1-5X3-+2X1X2+-5X2X3-。决定系数R2=019765,表明模型能解释97%菌量的变化,回归拟合程度较好。利用SAS软件可得到三个重要影响因子之间的响应面分析图和相应的等高图。等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小,椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则与之相反[8]。图1(a)显示,在X3(CaCO3)为最佳值710g/L时,在X2(豆饼粉)为高水平或低水平时,随着X1(玉米粉)浓度的增加,发酵液含菌量先增加后降低。说明玉米粉浓度过高过低都不利于发酵液含菌量的增加,即C/N过高过低都对发酵液产菌不利。在X1(玉米粉)为高水平时,随着X2(豆饼粉)浓度的增加,发酵液含菌量增加,说明较小的碳氮比有利于含菌量的增加;在玉米85中国生物防治　　　　　　　　　　　　　　　第22卷粉为低水平时,随着X2(豆饼粉)浓度的增加,发酵液含菌量变化小,说明此条件下豆饼粉对含菌量的影响甚微。模型中在响应面的最高点,等高图的圆心对应的值,存在着一个最佳值。图1(b)显示,X1(玉米粉)与X2(豆饼粉)两因素交互作用显著。　　图2(a)显示,在X2(豆饼粉)为最佳值2015g/L时,在X3(CaCO3)为高水平或低水平时,随着X1(玉米粉)浓度的增加,发酵液含菌量先增加后降低。说明碳源过高或过低都不利于含菌量增加。在X1(玉米粉)为高水平或低水平时,随着X3(CaCO3)浓度的增加,发酵液含菌量先增加后降低。说明玉米粉浓度为g/L时,CaCO3浓度过高不利于含菌量的增加。模型中在响应面的最高点,等高图的圆心对应的值,存在着一个最佳值。图2(b)显示,X1(玉米粉)与X3(CaCO3)两因素交互作用显著。(a)Y=f(X1,X2)的响应面分析图(b)Y=f(X1,X2)的等高图图1玉米粉与豆饼粉双因素最适浓度及配比的模拟结果(a)Y=f(X1,X2)的响应面分析图(b)Y=f(X1,X2)的等高图图2　玉米粉与CaCO3双因素最适浓度及配比的模拟结果图3(a)显示,在X1(玉米粉)为最佳值1310g/L时,在X2(豆饼粉)含量高或低的情况下,随着X3(CaCO3)浓度的增加,发酵液含菌量先增加后降低。说明CaCO3浓度过高过低都不利于含菌量的增加。在X3(CaCO3)为低水平时,随着X2(豆饼粉)浓度的增加,发酵液含菌量增加;在X3(CaCO3)为高水平时,随着X2(豆饼粉)浓度的增加,发酵液含菌量减少;说明在CaCO3为86增刊　　　　　　　　　　　　张丽霞等:枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化低水平时,较小的碳氮比有利于含菌量增加,而在CaCO3为高水平时,氮源的增加不利于含菌量的增加。模型中在响应面的最高点,等高图的圆心对应的值,存在着一个最佳值。图3(b)显示,X2(豆饼粉)与X3(CaCO3)两因素交互作用显著。(a)Y=f(X1,X2)(1)3Cg/L,豆饼粉浓度为2011124g/L,CaCO3浓度为618987g/L8/ml。为证实预测结果,在该浓度下进行重复摇瓶试验,所得试验值1/ml与预测值8/ml接近,二者的良好拟合性证实了模型的有效性。优化后得到B908菌株的发酵培养基配方为:玉米粉1219824g,葡萄糖5g,豆饼粉2011124g,鱼粉5g,CaCO3618987g,(NH4)2SO41g,K2HPO4013g,MgSO4?7H2O012g,MnSO4?H2O012g,水1000ml。优化后的发酵培养基配方使摇瓶发酵液每毫升的含菌量从616×109提高到。3　讨论Plackett2Bruman设计与响应面方法相结合的试验统计方法能快速、有效地从枯草芽孢杆菌B908液体发酵培养基中筛选出比较重要的影响因子并实现其优化,得到最佳培养基配方。本项研究中,CaCO3为最佳值710g/L时,在豆饼粉为高水平或低水平时,随着玉米粉浓度的增加,发酵液含菌量先增加后降低;在玉米粉为高水平时,随着豆饼粉浓度的增加,发酵液含菌量增加;在豆饼粉为最佳值2015g/L时,在CaCO3为高水平或低水平时,随着玉米粉浓度的增加,发酵液含菌量先增加后降低;在玉米粉为最佳值1310g/L时,在CaCO3为低水平时,随着豆饼粉浓度的增加,发酵液含菌量增加;在CaCO3为高水平时,随着豆饼粉浓度的增加,含菌量减少。表明合适的碳氮比是提高枯草芽孢杆菌发酵液含菌量的关键因素。CaCO3是多数芽孢杆菌发酵培养基中不可缺少的一种成分,对发酵液含菌量的变化有显著影响效应,与多数研究报道相符。CaCO3的主要作用可能是促进芽孢的形成和调节培养基pH值。由于目前枯草芽孢杆菌常常用于发酵制备各种酶或其他代谢产物,而关于该菌的产孢特性及以芽孢产量为目的的研究较少,尤其是针对工业上大规模生产方面的研究更少,因此本研87中国生物防治　　　　　　　　　　　　　　　第22卷究的结果对于枯草芽孢杆菌在工业发酵上有重要意义。对于枯草芽孢杆菌B908的发酵条件如温度、pH值、接菌量等是下一步的工作,在发酵培养基与发酵条件确定后,进行50、500、5000L等发酵罐的逐级放大,以优化确定枯草芽孢杆菌的液体发酵生产工艺。参考文献[1]　胡洪涛,王开梅,杨自文.枯草芽孢杆菌防治植物病害作用机理及其在植物生防中的应用[A].见:杨怀文主编.迈入二十一世纪的中国生物防治[C].北京:中国农业科学技术出版社,.[2]　储炬.现代工业发酵调控学[M].北京:化学工业出版社,]　方中达.植病研究方法[M].北京:中国农业出版社,1998.[4]　倪勤.SAS最优化软件速成[M].北京:科学出版社,1998.[5]　MuralidharRV,ChirumamilaRR,MarchantR,etal.AresponsesurfaceapproachforthecomparisonoflipaseproductionbyCandidacylindraceausingtwodifferentcarbonsources[J].BiochemEng,-23.[6]　褚以文.微生物培养基优化方法及其OPTI优化软件,],]　王晓青.农用抗生素2-16高产菌株选育及发酵优化组合研究,[8]　王允祥,吕凤霞,陆兆新.,3-94.88
范文六：检测技术枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化刘吉华 郭海龙 吴俊罡 张秉胜 秦贵江大连翔大生物技术研究中心有限公司中图分类号:S816.32
文献标识码:B
文章编号:03)12-0028-02
枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一,其已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的/绿色0添加剂,故具有广阔的发展前景,并已在畜牧业、饲料业广泛应用,显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性,能产生抗菌素,在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。现阶段的工业化生产中,常存在着发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题,对此我们对发酵培养基进行了优化实验,以提高产量、降低成本。管,轻轻震荡使冻干菌体溶解成悬浮状,取0.1~0.2mL菌悬液涂于上肉汤培养基平皿上,37e培养36h1.2.1.2 菌种筛选挑取少许活化后菌落划线于促芽孢形成培养基(土壤浸出液1000mL、牛肉膏6g、蛋白胨5g、琼脂20g、pH7.0~7.2)平皿上,37e培养20h左右取出,选大菌落挑到装有4.5mL无菌水的试管中,震荡均匀后置120e干燥箱中加热20min,再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养,反复多次。最后选取平皿上的大菌落转接到促芽孢培养基的试管斜面上,37e培养箱培养13~15h拿出放入4e冰箱保存备用。筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前后的种子斜面各1支,分别接入装有肉汤培养基的三角瓶中,在37e、195r/min的摇床上振动培养,每3h涂片观察1次,培养36h记录活菌数和芽孢率。此过程重复3次。1.2.2 培养基选择首先选择4种不同培养基进行摇瓶培养比较,观察菌数和芽孢形成情况。1.2.2.1 培养基的配制:?号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%+豆粕1%;?号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%+豆粕1%+30.8mg/L收稿日期:1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。1.1.2 主要试剂:牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、淀粉、硫酸锰、葡萄糖等。1.1.3 主要设备P270普通摇床、303AB-3隔水式培养箱、1600倍微生物显微镜、PHS-25G型酸度计、50L高级发酵罐、电热干燥箱等。1.2 检测方法活菌计数采用平皿活菌计数法,芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数比较。检测培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,葡萄糖1%,氯化钠0.5%,琼脂2%。1.2.1 菌种处理1.2.1.1 安培管菌种活化用无菌吸管吸取0.3~0.5mL无菌水滴入安培浓度的硫酸锰溶液0.1%。>>号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡28饲料研究 FEEDRESEARCHNO.12,2003检测技术萄糖1%+氯化钠0.5%; 1/4 号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%+30.8mg/L浓度的硫酸锰(MnSO4)溶液0.1%;4种不同培养基pH值均调为7.0~7.2以上每种培基各做3瓶,装液量100mL/500mL三角瓶,用四层纱布和牛皮纸包扎置立式压力蒸汽消毒器中于121e灭菌20min,取出备用。1.2.2.2 摇瓶种子制备将在冰箱保存的种子在无菌室内接入肉汤培养基中,在37e、195r/min的摇床上振荡培养12h。1.2.2.3 接种和培养培养好的种子液以10%接种量分别接入4种不同培养基中37e振荡培养,每隔12h检测1次,36h结束培养。1.2.2.4 正交实验我们将上述摇瓶结果相对较好的?号培养基作为基本培养基,设计了4个因素3个水平的正交实验,以进一步优化培养基配比(培养36h测活菌数)。正交实验设计序号葡萄糖(%)0.50.50.淀粉(%)0.10.150.20.10.150.20.10.15豆粕(%)30.8mg/L硫酸猛溶液(%)00.10.150..1502 结果和讨论2.1 菌种处理结果见图1图1 菌种处理结果对比图从菌种优化的3次结果看,经优化后在相同的培养时间内(36h)芽孢形成率由原先的约38%提高到约96%,活菌数也由17.7亿/mL提高到28.6亿/mL。2.2 摇床实验的结果4种培养基对比试验结果12h培养基?培养基?培养基>>培养基 1/4 芽孢率活菌数(亿/mL)芽孢率活菌数(亿/mL)芽孢率活菌数(亿/mL)芽孢率活菌数(亿/mL)个别芽孢26.25个别芽孢27.15有个别芽孢15.75有个别芽孢14.36约40%18.6约50%28.45约50%19.1个别芽孢19.25约80%15.4约100%26.2约80%12.25约25%11.7524h36h通过试验证明添加适当比例的锰离子、淀粉对芽孢形成有促进作用。?号培养基配比要明显优于其他3种培养基配比,培养到36h芽孢率可达到95%以上,活菌数可达到27亿/mL,故我们选择?号培养基作为进行正交实验基本培养基。2.3 正交实验结果影响因素:硫酸锰溶液>豆粕>葡萄糖>淀粉适宜条件:葡萄糖1.5%、淀粉0.1%、豆粕3%、30.8mg/L的MnSO40.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%。2.4 发酵罐实验结果2种培养基对比结果见图291.50.2注:其他营养成分添加比例不变1.2.3 发酵罐实验以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50L发酵罐培养,并与肉汤培养基进行对比。发酵罐培养的有关条件如下:定容30L,加消泡剂3j,用NaOH溶液调pH值到7.5~8.0,(注:因为灭菌后pH约下降0.5~1.0),培养121e灭菌20min,培养温度37e,搅拌转速200r/min,起始气流量比1:0.5。当芽孢率达到80%以上时,发酵结束。此实验重复2次。饲料研究 FEEDRESEARCHNO.12,200329检测技术正交实验结果及分析序号IjIIjIIIjKjIj/KjIIj/KjIIIj/KjDj葡萄糖(%)0.50.50..576.956..11.16淀粉(%)0.10.150.20.10.150.20.10.150.262.20.10.54豆粕(%).11.23.230.8mg/L活菌数硫酸锰溶液(亿/mL)(%)00.10.150...9.523.538.13.007.18.2531.00高,菌体死亡率较优化前低24.7%。图2 2种培养基分别发酵培养2次结果对比图注:芽孢率1、活菌数1、芽孢率2、活菌数2代表2次肉汤培养基配方发酵培养结果。芽孢率3、活菌数3、芽孢率4、活菌数4代表优化的培养基配方发酵培养结果。3 结论适合该菌株发酵的培养基配比为:葡萄糖1.5%+豆粕3%+淀粉0.1%+30.8mg/LMnSO40.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%。通讯地址:大连经济技术开发区松岚街11号1166202次实验结果基本稳定,采用优化的培养基比肉汤培养基有很大提高。主要体现在:?发酵周期缩短了24~26h,在发酵生产中降低了能耗,且可提高年产量。?最终活菌数提高了约54.7%,芽孢形成比率(上接第25页)至油和杆菌肽锌+硫酸粘杆菌素对育肥效果的对比试验,结果发现,添加杆菌肽锌+硫酸粘杆菌素组仔猪腹泻次数为17次,死亡率为5.0%;添加牛至油仔猪腹泻6次,死亡率为1.7%,每头纯收入提高7.1元。这表明,牛至油比饲用抗生素有更好的抗菌作用并能提高经济效益。4.2 牛至油在养禽业中的应用杜云良(2000)用牛至油、恩诺沙星、硫酸新霉素治疗不同致病型大肠杆菌引起的鸡大肠杆菌病试验、体外抑菌试验、临床诊疗统计,结果表明,使用牛至油比使用恩诺沙星和硫酸新霉素的治愈率提高15%~20%,死亡率降低19%~25%,同时用牛至油防治鸡大肠杆菌病有疗程短、见效快、无耐药性、成本低、用药方便等特点。中国农科院畜牧所用AA肉鸡做了牛至油与不同抗生素对比试验,结果表明,牛至油预混剂高、中剂量在整个试验期不同阶段日增重都是最高,料肉比最低,说明牛至油是非常好的促生长剂,可以提高鸡的日增重和饲料效率。价廉中草药。牛至挥发油在临床应用,可避免因长期使用抗菌素所带来的副作用及耐菌株的产生,是一种新型的植物抗生素,它含有植物复合酚类是其发挥抗菌作用的基础,特别是对于大肠杆菌、沙门氏杆菌等所引起的肠道疾病有很好的控制效果。牛至油预混剂是目前理想的抗生素替代品,具有抗菌谱广、作用迅速、无残留、不易产生耐药性等特点,因而有较大的开发应用价值,值得在饲料中推广使用。但对其疗效与安全性尚需做进一步探讨。参考文献1 杜云良.牛至提取物防治鸡大肠杆菌的研究.中国家禽,):8~92 林清华,刘波,徐有为.牛至挥发油对肠炎常见菌体外抗菌作用.应用与环境生物学报,):76~783 林清华,张楚富,张焱文.牛至挥发油对小鼠特异性免疫功能的影响.应用与环境生物学报,):389~3914 林清华,杨清平,李常建,等.致肠炎常见菌对牛至浸膏的敏感性试验.氨基酸和生物资源,):30~32通讯地址:广东省佛山 5282315 展望牛至广泛分布在我国,是一种药源极为丰富的30饲料研究 FEEDRESEARCHNO.12,2003检测技术枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化刘吉华 郭海龙 吴俊罡 张秉胜 秦贵江大连翔大生物技术研究中心有限公司中图分类号:S816.32
文献标识码:B
文章编号:03)12-0028-02
枯草芽孢杆菌是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一,其已被越来越多地研制成饲用微生态制剂。因其制剂是无毒、无残留、无污染的/绿色0添加剂,故具有广阔的发展前景,并已在畜牧业、饲料业广泛应用,显示巨大的社会效益和生态效益。枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性,能产生抗菌素,在动物肠道内具有较强生物夺氧能力。这些特性对促进动物营养的消化吸收、提高动物的饲料转化率、防病和促进生长起到重要作用。现阶段的工业化生产中,常存在着发酵周期长、芽孢形成率低、成本高等问题,对此我们对发酵培养基进行了优化实验,以提高产量、降低成本。管,轻轻震荡使冻干菌体溶解成悬浮状,取0.1~0.2mL菌悬液涂于上肉汤培养基平皿上,37e培养36h1.2.1.2 菌种筛选挑取少许活化后菌落划线于促芽孢形成培养基(土壤浸出液1000mL、牛肉膏6g、蛋白胨5g、琼脂20g、pH7.0~7.2)平皿上,37e培养20h左右取出,选大菌落挑到装有4.5mL无菌水的试管中,震荡均匀后置120e干燥箱中加热20min,再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养,反复多次。最后选取平皿上的大菌落转接到促芽孢培养基的试管斜面上,37e培养箱培养13~15h拿出放入4e冰箱保存备用。筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前后的种子斜面各1支,分别接入装有肉汤培养基的三角瓶中,在37e、195r/min的摇床上振动培养,每3h涂片观察1次,培养36h记录活菌数和芽孢率。此过程重复3次。1.2.2 培养基选择首先选择4种不同培养基进行摇瓶培养比较,观察菌数和芽孢形成情况。1.2.2.1 培养基的配制:?号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%+豆粕1%;?号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%+豆粕1%+30.8mg/L收稿日期:1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。1.1.2 主要试剂:牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、葡萄糖、淀粉、硫酸锰、葡萄糖等。1.1.3 主要设备P270普通摇床、303AB-3隔水式培养箱、1600倍微生物显微镜、PHS-25G型酸度计、50L高级发酵罐、电热干燥箱等。1.2 检测方法活菌计数采用平皿活菌计数法,芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数比较。检测培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,葡萄糖1%,氯化钠0.5%,琼脂2%。1.2.1 菌种处理1.2.1.1 安培管菌种活化用无菌吸管吸取0.3~0.5mL无菌水滴入安培浓度的硫酸锰溶液0.1%。>>号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡28饲料研究 FEEDRESEARCHNO.12,2003检测技术萄糖1%+氯化钠0.5%; 1/4 号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%+30.8mg/L浓度的硫酸锰(MnSO4)溶液0.1%;4种不同培养基pH值均调为7.0~7.2以上每种培基各做3瓶,装液量100mL/500mL三角瓶,用四层纱布和牛皮纸包扎置立式压力蒸汽消毒器中于121e灭菌20min,取出备用。1.2.2.2 摇瓶种子制备将在冰箱保存的种子在无菌室内接入肉汤培养基中,在37e、195r/min的摇床上振荡培养12h。1.2.2.3 接种和培养培养好的种子液以10%接种量分别接入4种不同培养基中37e振荡培养,每隔12h检测1次,36h结束培养。1.2.2.4 正交实验我们将上述摇瓶结果相对较好的?号培养基作为基本培养基,设计了4个因素3个水平的正交实验,以进一步优化培养基配比(培养36h测活菌数)。正交实验设计序号葡萄糖(%)0.50.50.淀粉(%)0.10.150.20.10.150.20.10.15豆粕(%)30.8mg/L硫酸猛溶液(%)00.10.150..1502 结果和讨论2.1 菌种处理结果见图1图1 菌种处理结果对比图从菌种优化的3次结果看,经优化后在相同的培养时间内(36h)芽孢形成率由原先的约38%提高到约96%,活菌数也由17.7亿/mL提高到28.6亿/mL。2.2 摇床实验的结果4种培养基对比试验结果12h培养基?培养基?培养基>>培养基 1/4 芽孢率活菌数(亿/mL)芽孢率活菌数(亿/mL)芽孢率活菌数(亿/mL)芽孢率活菌数(亿/mL)个别芽孢26.25个别芽孢27.15有个别芽孢15.75有个别芽孢14.36约40%18.6约50%28.45约50%19.1个别芽孢19.25约80%15.4约100%26.2约80%12.25约25%11.7524h36h通过试验证明添加适当比例的锰离子、淀粉对芽孢形成有促进作用。?号培养基配比要明显优于其他3种培养基配比,培养到36h芽孢率可达到95%以上,活菌数可达到27亿/mL,故我们选择?号培养基作为进行正交实验基本培养基。2.3 正交实验结果影响因素:硫酸锰溶液>豆粕>葡萄糖>淀粉适宜条件:葡萄糖1.5%、淀粉0.1%、豆粕3%、30.8mg/L的MnSO40.1%、磷酸氢二钾0.3%、磷酸二氢钾0.15%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%。2.4 发酵罐实验结果2种培养基对比结果见图291.50.2注:其他营养成分添加比例不变1.2.3 发酵罐实验以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50L发酵罐培养,并与肉汤培养基进行对比。发酵罐培养的有关条件如下:定容30L,加消泡剂3j,用NaOH溶液调pH值到7.5~8.0,(注:因为灭菌后pH约下降0.5~1.0),培养121e灭菌20min,培养温度37e,搅拌转速200r/min,起始气流量比1:0.5。当芽孢率达到80%以上时,发酵结束。此实验重复2次。饲料研究 FEEDRESEARCHNO.12,200329检测技术正交实验结果及分析序号IjIIjIIIjKjIj/KjIIj/KjIIIj/KjDj葡萄糖(%)0.50.50..576.956..11.16淀粉(%)0.10.150.20.10.150.20.10.150.262.20.10.54豆粕(%).11.23.230.8mg/L活菌数硫酸锰溶液(亿/mL)(%)00.10.150...9.523.538.13.007.18.2531.00高,菌体死亡率较优化前低24.7%。图2 2种培养基分别发酵培养2次结果对比图注:芽孢率1、活菌数1、芽孢率2、活菌数2代表2次肉汤培养基配方发酵培养结果。芽孢率3、活菌数3、芽孢率4、活菌数4代表优化的培养基配方发酵培养结果。3 结论适合该菌株发酵的培养基配比为:葡萄糖1.5%+豆粕3%+淀粉0.1%+30.8mg/LMnSO40.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%。通讯地址:大连经济技术开发区松岚街11号1166202次实验结果基本稳定,采用优化的培养基比肉汤培养基有很大提高。主要体现在:?发酵周期缩短了24~26h,在发酵生产中降低了能耗,且可提高年产量。?最终活菌数提高了约54.7%,芽孢形成比率(上接第25页)至油和杆菌肽锌+硫酸粘杆菌素对育肥效果的对比试验,结果发现,添加杆菌肽锌+硫酸粘杆菌素组仔猪腹泻次数为17次,死亡率为5.0%;添加牛至油仔猪腹泻6次,死亡率为1.7%,每头纯收入提高7.1元。这表明,牛至油比饲用抗生素有更好的抗菌作用并能提高经济效益。4.2 牛至油在养禽业中的应用杜云良(2000)用牛至油、恩诺沙星、硫酸新霉素治疗不同致病型大肠杆菌引起的鸡大肠杆菌病试验、体外抑菌试验、临床诊疗统计,结果表明,使用牛至油比使用恩诺沙星和硫酸新霉素的治愈率提高15%~20%,死亡率降低19%~25%,同时用牛至油防治鸡大肠杆菌病有疗程短、见效快、无耐药性、成本低、用药方便等特点。中国农科院畜牧所用AA肉鸡做了牛至油与不同抗生素对比试验,结果表明,牛至油预混剂高、中剂量在整个试验期不同阶段日增重都是最高,料肉比最低,说明牛至油是非常好的促生长剂,可以提高鸡的日增重和饲料效率。价廉中草药。牛至挥发油在临床应用,可避免因长期使用抗菌素所带来的副作用及耐菌株的产生,是一种新型的植物抗生素,它含有植物复合酚类是其发挥抗菌作用的基础,特别是对于大肠杆菌、沙门氏杆菌等所引起的肠道疾病有很好的控制效果。牛至油预混剂是目前理想的抗生素替代品,具有抗菌谱广、作用迅速、无残留、不易产生耐药性等特点,因而有较大的开发应用价值,值得在饲料中推广使用。但对其疗效与安全性尚需做进一步探讨。参考文献1 杜云良.牛至提取物防治鸡大肠杆菌的研究.中国家禽,):8~92 林清华,刘波,徐有为.牛至挥发油对肠炎常见菌体外抗菌作用.应用与环境生物学报,):76~783 林清华,张楚富,张焱文.牛至挥发油对小鼠特异性免疫功能的影响.应用与环境生物学报,):389~3914 林清华,杨清平,李常建,等.致肠炎常见菌对牛至浸膏的敏感性试验.氨基酸和生物资源,):30~32通讯地址:广东省佛山 5282315 展望牛至广泛分布在我国,是一种药源极为丰富的30饲料研究 FEEDRESEARCHNO.12,2003
范文七：枯草芽孢杆菌常用培养基配方 枯草芽孢杆菌常用培养基配方：1l蒸馏水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化钠+0.5g牛肉膏+20g琼脂
枯草芽孢杆菌原生质体的制备1 培养枯草芽孢杆菌取亲本菌株t4412、tt2 新鲜斜面分别接一环到装有液体完全培养基(cm)的试管中，36℃振荡培养14 h，各取1 ml 菌液转接入装有20 ml 液体完全培养基的250 ml 锥形瓶中，36℃振荡培养 3 h，使细胞生长进入对数前期，各加入25 u/ml 青霉素，使其终浓度为0.3 u/ml，继续振荡培养2 h。2. 收集细胞各取菌液10 ml，4000 r/min 离心10 min，弃上清液，将菌体悬浮于磷酸缓冲液中，离心。如此洗涤两次，将菌体悬浮10 ml smm 中，每ml 约含108～109 活菌为宜。3. 总菌数测定各取菌液0.5 ml，用生理盐水稀释，取10-5、10-6、10-7 各1ml(每稀释度作两个平板)、倾注完全培养基，36℃培养24 h 后计数。此为未经酶处理的总菌数。4. 脱壁二株亲本菌株各取5 ml 菌悬液，加入5 ml 溶菌酶溶液，溶菌酶浓度为100 ug/ml，混匀后于36℃水浴保温处理30 min，定时取样，镜检观察原生质体形成情况，当95%以上细胞变成球状原生质体时，用4000 r/min 离心10 min，弃上清液，用高渗缓冲液洗涤除酶，然后将原生质体悬浮于5 ml 高渗缓冲液中。立即进行剩余菌数的测定。5. 剩余菌数测定取0.5 ml 上述原生质体悬液，用无菌水稀释，使原生质体裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀释液各0.1 ml，涂布于完全培养基平板上，36℃培养24～48 h，生长出的菌落应是未被酶裂解的剩余细胞。计算酶处理后剩余细胞数，并分别计算二亲株的原生质体形成率。原生质体形成率＝未经酶处理的总菌数一酶处理后剩余细胞数。
范文八：维普讯 h资tp:/t/ww.cqwipv.com枯芽孢草菌固体发杆酵养培基优的化张 志 ，徐 海 燕 ， 焱杨 军方（ 东 来 宝 利 生来物 工
１０ ２ 　 ０７）０摘 要通过： 正试交验对草 芽孢枯杆 Ｙ菌三 角瓶 固 体发酵培养配基进行 方优化了，试 验果 以结麸皮 ８ ％， 稻 。０壳１％， 玉米 粉 ５ ，豆 粕
５，硫 酸镁
０ ５ ％０％ ． ｃ０ ￣ ． 硫酸
铵５ ０．％， 水 比料 １ 为１ 方１ 活 数 最菌
０ 个 ?亿　 ～、配： ６ ｇ 且 ， 应 于 用体 固发 酵罐中
发酵效 果 良 好。关键词：草 芽枯孢杆 菌；体固发 ；培养酵基化优中 分图类
号： Ｓ１． Ｓ；
．１ 文献 标识
码：Ｂ 文 章编 号
： １ ０ — ４ ２ ０ ０ ９）０
３ ３ ８６６ ８ —６ ４３０ １０ ８ （０
５０ — ４００作为 抗生 素 的 代替 品，益 生 菌 酶制和 剂等
的研　究 与开发 近几
成 年绿 色 为料 饲添加 剂 热的 。点其 　中１２ 方 法 ．１ 　．液体
种 培 养子　． １２ 益生倍菌受关 注 。作
益 为菌 生一 种 的，芽 杆孢菌 制剂动 在生 物产中的 研 和 应究用一直 都是 畜 牧 科业　研每３ ０ｍ ０　Ｌ 三 角瓶 装
量 ５　 液 体Ｌ
种子 培养 　０
ｍ 基在 ｌｌ ２ ℃条，件下灭 菌
　３ ，ｉ温降后从
斜面 　接 ０ｎ一ｍ生 产和人员关 注
的 点 。焦 前 芽目 杆菌 多采孢用液
　体 层深发
技 酵 术再经 ，喷雾干 燥进行 生 产， 设对备要环 苔菌
养 基 培置 ３ ，℃控 ７ 摇 床 温 养培 ，转 速０ｒｍ２ ｎ至， 孢芽 率 达９％以 上 时停
，止约　 ２?　ｉ ～ ０需２ 　 　 ｈ ４ ．１ 三角瓶 固体
发培酵 养　．
２２求高，生Ｔ艺产杂复 而同；发酵体采的用原一料般　 廉 价 的农是副产
品 如草粉 、麸（皮等
用 的） 设　 备采，也液较体
发简酵单 ，生
成产本 大 大
低 于 液体 发 酵 。　所
近 以年各来生
产 厂都家 在积极探 索芽孢 杆 菌
固的 　发 体酵 技术，并有少 数 生产厂开家试始性探生产 ： 　基于
进 此 行枯 草 了孢芽杆 菌 固发 酵体 养 培 基的优试　化验 ，以 简化求产工生艺， 提产高 ，量降低产生 成 ： 本材１ 料 与法每方 ５ ０ｍ０
２　， 体同发酵 培
养 基　０ｇ
原试 剂混料合
，加料 水 料 ，水比
为１ｌ １．：，搅拌 　 均 匀培，养 经基ｌ ｌ℃灭菌 ３　
ｎ２ ０ｍｉ， 温 后降接种量
为 　 ＶＭ，２Ｖ液 菌体 体 积种 ，数一 同Ｍ 发 酵培体　 ％（ 养 ／ 一基 的 质量 下，
） 同， 后然置３ ７℃培
养 中静 箱止 　 养培， 问
拍时打 ，使 其 均
率　８ ％ 上以 时 ，止 发停 酵 然后 。于６
０℃烘 干 、粉０ 碎、 　计
活 菌　数１． 固
发酵罐 发 体酵验　试 ．３ ２１１材　料．菌种
枯草 芽为孢杆
（ 菌　 ｕｉｔ） 　 Ｂ ｂｉｓＹ ｓ…： 东宝来
ｌ利来　生
股有 限份 司生公 技 术研物究所 分离 并　
保 存并，经中科
院微生物 所鉴
子 培 基养 葡 萄糖 ０２： ，Ｎ Ｃ　％，．． ％ ａ１ ５ 　
酵母 ０ 膏０５． ，蛋 ％胨 ｌ 白，％琼脂
２粉％ ｐ ，．　 。７ 　Ｈ
０体同 发酵 养 培 用基原料
麸皮 、壳稻
米粉 、硫 酸 镁 、硫 酸 铵
、 酸磷 氢二 钾
，等具 配体方
　主设要 备 蒸：气 消毒
器超、 丁净作台 、控 温摇在三 瓶角 体同 发酵 验实的基 上础 ，结
大规模合　固 发 酵 体特的 点 ， 在体固发酵
芽行 孢菌杆 固　体
酵发 方 配的中
实验 。 试第一 步以：产生 的中经验培 基养（ 皮麸８ ％， ０ 　 稻 壳
％２料 水 ，为比ｌ １１ 作为对照 。操 作
：０）．培 养 用基蒸 气灭
， 菌ｌ℃灭菌ｌ２　 ｉ ，当料温 降　 ２ ｒ ｎ ０ａ至５ ０℃
时接 ，入液体
子 ，接种种
量 为１（ ／ ％ ０ Ｖ，Ｍ ）　 搅拌均 匀
发酵 行养 ：整 培个 酵发 过程分两 个 阶 　段 ：第 一 段阶（～ ２
： ｈ １ｌ 　止培 养， 物料缓 　１ 　２
）～ｈ静０ 慢升
；１　 温０ｈ后 以问 断通 风 降
温 使 物 料温度 控制床、控 温生培化养箱、
平 天 、微镜 、固体发显酵罐：收 稿期日：２ ０—４ ２　 ０
５０ Ｉ —作简介 者张志 焱：（９ ９ ）
１６一 ，女
山．东安人 ，泰奉科 ，研究　副员． 主要
从事 微 生 物
酵 发的 研 究　 一 　作 　ｒ３在７ ℃２　，左右第一次翻 曲 ，将并 度温控 制　在 ｈ—０—料博饲 ２ 览 ０ ５０年 ９期第 ３—４ —维资普 讯http/:/wwwcq.ipvc.om２３ 　 ５　 ６　 ４７３ ７℃　
二第 阶 段 ３ ４（
）　 ２～ ０ｈ ：在 ２ 　８ ｈ左 右进行
二第气 透性， 量 加 适入壳稻 ； 入加豆粕
为作氮 ，源但粕 是豆一 种效 氮 迟 源如，添加 少量
速 效氮 源，促 进可次曲翻，将
温度 制在控３
～℃之７间 ，直
至发酵 结　 ５３ 束。发 酵 期间要
定 时样取 检镜，当 孢 芽率达到
８　％０ 以上时 ，停
止酵发： ６ ０烘℃ 干 、 粉碎 、 计活菌数菌 ： 的 体前 期生
长， 培 养故
中 加 入 少 量 硫方酸 铵由；硫于 酸 、磷镁 氢酸 钾参二
微与 物生细胞 壁 的２２２第二步 ：按正 交试 验得
的出佳 发酵 最 培养基　作为固体
发酵罐发 酵 养培基进
行 酵培发养
操， 作方法 　 同 一第步 。２４ ．１．检
测方法组 成 ，硫酸锰 有 促进 芽
孢 菌 杆 孢芽 形成 的
作 用，ｌ 　】
Ｉ所 配 方以中
加硫 入酸 、镁磷酸 二氢钾
硫酸 锰 ：和 因　为所生的产产品 为 活菌 制剂 ， 以所重 最要的
制指控　标
活是菌 数，而
杆菌 只有 形 芽成孢
才能　有 利于 活保菌 存 因而 ，试 验主 围绕要
活数菌和 芽孢 率 这　 两 展 项开 另外＝，发 酵 周 期 也是一 个 很重要 试　的活计菌数
混 用平匀皿 活 菌 计
法数 按 ｌ， ０倍 稀释 法制成不 同浓 度稀
释 ，液从 ３合适
的 稀释　个 液分 别中吸取
１ｎ０置Ｉ于 无 菌 培 养
中 皿， 每一 　稀 ．验标 ，因为指缩 发短酵 周 期就意 味着 降低
能耗 ，节约 生产成本，增 加生
批产 　：次２ 三 ２瓶 角 正交试 验
　 ．释度做　 个平
皿 ：将事 先 融 化
并冷 却 至５ ： 有　 ０ｃ　左【
同体的 养基培 每向个 培皿 养倒入约 中ｌ 　 　 ， 匀２Ｉｍ，摇
凝同后 ，放
７培℃ 养箱
养２ｈ ４　 进　，
行菌 记落数 ：芽 率孢 采 ：用 芽革 兰孢 染 氏后 色微显 镜下 察观正交验试 因素水平
见 表　 ｌ： 表 １ 角三 正 交 试瓶验
因素 水 平　
（ ％）计算：２培
基 养择 选与试 验 结果　 １ 培 养２基的 选择
酵 原的 料以来， 源 广泛 的皮麸
主，为在培养 配基方中适 当 加 玉 入粉 米，为了 增加 培 基 的养１
２１０ １０ 　 ５ 　５５１ ００ 　００ 　．５００５．００１　
０ ０　１ ．表 ２三 角
果　 ８ ２结测 项目水平Ａ 　Ｂ 水平　 Ｃ水平　Ｄ水平
Ｅ　平水　
Ｆ水平　Ｇ水平　 活菌 数（
亿 ? ）个芽 率（孢
ｇ　 　 　％３）５５７０ 　　
０ 狮∞ ∞ ∞ ∞ ∞∞从 正试 验交 培 ３　养６ 后ｈ检测 结果极 差
分析 （ 见玉米
粉 ５ ，豆
５ ，硫 酸粕镁 ０ ５
％ 　 ．％％
１ １添 硫 酸 铵 加 不并能 增 加 　 １．： ．。表２ 可 以看
，影出响验效果 的主试因要排素序为 ） 豆　粕＞ 酸
＞镁稻壳＞
锰 酸＞ 酸铵＞
米粉 磷＞　
硫硫 硫 玉酸 氢二 钾 ， 最适
培养 基 为
麸皮 ８ ％ 稻，
ｌ壳 ， ０ ％ ０孢芽菌
活的 菌数 ，可 见 豆粕 和 麸皮 不 仅 仅是 氮 源
　 ，而 其 中含 且有许 活性多 质 对 芽孢杆物
的 菌生长 促　有饲料博览 ２０ ０５
年第９期一３５一维资普讯 ttp:/h/www.cqvi.pomc同不基 氨 酸动 分自仪氨 析酸 分基析结果
之比　较王宝　ｊ宣 ， 金 张　，任红波 。龙 李， 淑范　，姜海（１ ．中国商业联合鸿饲会料 质量监检督 中测，心黑龙江哈尔滨　 １ ０１
： 黑龙２省江粮卫生检验油ｉ监 ｉ ５００ ．￣ ＇Ｎ， 黑龙江 尔哈滨　１０
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院大 豆 谷 物检 测
黑 龙，江 哈 尔
５ ０ ．）６中 分图类
号： １Ｓ７ ． ６ ８ 文 标献识码 ：
） ９ ００ ３— ２ ８
６１Ｓ ； －１４
０１０ ８（０
— ００ ６０近几来 年于饲料由 业＿猛 迅展 发对饲料，产 的　品 『二含量就成 了键一关环 。 本验实验不 证品同 的牌氨酸　基分 析在仪不 的同实验室测定氨酸基含 是量有差否 别目。前 在 ，国中场上市销 的售基氨酸析分 主仪要是品质控制 经已从规常 营养的分析 到 转了量微分
，对析 　饲 料质 品评的价已经从粗 蛋白 量含高的低 ，改 为观测 　种各基氨酸含是 量符合否要 求，以所准测确 定氨基 　酸收稿 日 期 ２：０ —
　５００ ２日—本
的日立公 司 英和 的安 玛西亚公 司生国 产的产品。
这据 情 况种选定
日 立公司生 产 的氨 基
析仪 　８ ０８ ０英 和安 玛西国亚 公司 产的 生 系３列氨基 分 析酸　１仪作对 比 一作者介 简：宝 瑁（９于ｌ ， 女， 北香河县河 人 科．．高 　 级１７一） 　
程 ，主师从要饲料事分析 与的检 Ｔ测： 作　，?　 ，‘‘　
． ， 　?　 ‘．’，?，，?，． ?，?。，　?‘，。 　 ．，
　． ??。，。 ． ?，．．” ?进用作 是，同
发酵体中 理
的想氮源 原 。料３２ 固体发 酵 罐
酵发．用于 固体发 酵罐
发 中酵 果 良效好，在 同体发 酵
中　罐活菌 数
到达 ３亿４个 ?
至于～发 酵过 程
的 其 中他　０
。ｇ 件条（
通如 量气等 ）
控的制，有待 于 一 进 步的试验研究 。发 酵试验结见 果表３表 ３ 固体 发 酵。 罐 试验 结 果
对比由于 同 体发酵 的三
角瓶试小 工业 和化生产
之间　的条件
控 有很 大 的制 差 ，异 在工 化生 业产 过 程中很难
达ＪＮ试的 结
，如何 改果 进生 中 产发的酵设备 及 ｂ　发 酵条 件
，使 达 ＮＪ之试 的效
们我迫切 　需 ｂ 要解
枯 ，芽草孢杆 菌 同 发 酵可体 用以于
相且对 于 体液 层深发酵
具有 生 对产 设备要　求 、低原料源来广 后处、简理 、单本低成 、廉产
　品适 口好性等
具有 广的发 展阔 间空。由表
可知３，正
交 试得 出 验的最发佳酵
养基培　 配方 优于生
产中 的 经验 培 基养配方 ，虽
然 们 它芽　的
，样但 发酵 周
短且 ，活菌
３４３　个 ?～
０． 亿 ，ｇ提高 了
％３ 。 ０３ 讨　　 沦　 　【】 陈 坚，李 ． ｌ寅发酵 程优过化与实践
【 北】京：北
京化 学丁　业Ｍ ．出版 社，２０
．０２【参考文】献通 过对枯草 芽 孢杆 菌同
体发酵培 养
的优化基　 试 ，得 验 到培养 基的 显明
产 中 经 的 培养 基验， 　
最 佳培 养 基 配 方 为 麸 皮
壳 稻１ ％玉 米，粉
０ ０ 　５，
粕 ５ 豆 ％％硫， 镁 酸００ ％硫，酸 锰 ０ｌ ， 　料 ．５．％０ 】【 乇甫 义．艳何 龄，令娜孔．
饲２用合复 固态发酵酶下 艺讨探【
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范文九：枯草芽孢杆菌FS106杆菌肽发酵培养基优化杆菌肽(acitraein)，是由美国哥伦比亚大学Johnson等人在1943年从一名患者的胫骨创伤污染中分离到一株产生抗菌物质的细菌——地衣芽孢杆菌，经发酵取得的成品，1948年由Upjorm公司投产，称Baeitracin，商品名为Baciquent。由于该物质是由杆菌产生的多肽，故中文译名为“杆菌肽”。杆菌肽又名枯草菌素、枯草菌肽、崔西杆菌素。杆菌肽A的分子式：C66H103N17016S。杆菌肽实际上是几种相似多肽组分的混合物，通过其中的某些氨基酸来区别。杆菌肽的结构是由12个氨基酸组成含有噻唑环的多肽复合体，它是多种氨基酸结合而成的不稳定的多肽，含A、A1、B、C??G等多种组分，以A为主。杆菌肽易溶于水，系白色粉末。在pH5.7水溶液中可稳定存在4周。杆菌肽可与多数金属离子生成络合物，并在干燥状有杆菌肽4.2万单位，为淡黄色至淡棕黄色粉末，无嗅、味苦。在吡啶中易溶，乙醚中略溶，在水、甲醇、氯仿、丙酮中几乎不溶。杆菌肽是目前国内外广泛用于饲料中的一种新型的理想广谱抗菌素，它能够有效抑制G+和G-细菌，如金黄色葡萄球菌、链球菌等，具有抗菌谱广、畜禽吸收量少、排泄快、安全性评估良好、不产生耐药性等很多优良特性，是饲料添加剂中传统抗生素的有效替代品，已被应用于生物表面活性剂、饲料添加剂、食品防腐剂和作为生物学的研究工具。目前杆菌肽的工业生产主要通过微生物发酵法制得，地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是目前广泛应用的工业生产菌种。杆菌肽的发酵生产过程国外报道较多，国内相关报道不多，且发酵水平不高。我国的杆菌肽发酵生产始于20世纪60年代，1967年华北制药厂首先在国内生产杆菌肽，不久因故停产。随着我国畜牧养殖业的兴起，杆菌肽于上个世纪90年代开始大量生产，以芽孢杆菌为菌种，玉米和豆粕为主要原料，通过生物发酵、锌络合制备而成。我国天津新星兽药厂选育获得的高产菌株，生产能力为700μg／mL，与国外报道1200μg／mL的水平相差还是很多。国内杆菌肽发酵工业的生产水平亟待提高。微生物的代谢分为初级代谢与次级代谢，杆菌肽属次级代谢产物。初级代谢贯穿于生命活动的始终，与菌体生长水平平行进行。而次级代谢一般只在菌体对数生长后期或稳定生长期进行。因此，此类微生物的生长和次级代谢过程可以划分为两个阶段，即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段。杆菌肽在合成阶段形成的次级代谢途径。但是，培养条件的改变可改变次级代谢产物的合成时期。在生长阶段菌体生长迅速，中间产物很少，当容易利用的氮、磷、糖消耗到一定量之后，菌体生长速度减慢，菌体内某些中间产物积累，原有酶活力下降或消失，导致生理阶段的转变，即由菌体生长阶段转向次级代谢产物合成阶段。此时，原来被阻遏的次级代谢的酶被激活或开始合成。如果在菌体生长阶段终了后立即加入蛋白质，这些酶便不能合成，次级代谢过程将不能进行。有研究得出选用肉汤胰蛋白胨培养基、肉汤鱼蛋白胨培养基、豆芽汁培养基(此三种实验室常用)、黄豆粉培养基(目前工业生产选用)进行发酵，其中豆芽汁培养基发酵的杆菌肽所得抑菌圈最大，与其他发酵液差异较显著，说明培养基的营养成分不同，发酵效果不同；通过对加复合盐与未加复合盐的豆芽汁培养基发酵比较，差异不明显，可见豆芽汁培养基营养十分丰富。从不同蛋白胨的肉汤培养基所产杆菌肽的量进行分析．表明不同氮源对杆菌肽产量影响大。另外，培养基中碳源越高，氮源相对低，可控制菌数的增加，有利于杆菌肽的形成，但如果碳源过高，杆菌肽的形成反而下降，可能是由于糖浓度过高，使培养液的粘稠度增加，发酵液溶解氧减少，从而降低了菌体细胞膜的通透性，影响了菌的正常代谢。导致杆菌肽产量下降。某课题组在成功分离到一株产杆菌肽的枯草芽孢杆菌 FS106基础上，对该菌株产杆菌肽的发酵培养基进行优化，以期提高杆菌肽的发酵水平。 研究的方法和途径材料与方法1 材料1．1 供试菌种 指示菌种：金黄色葡萄球菌，为本实验保藏。生产菌种 ：枯草芽孢杆菌 FS106，为本实验保藏。1．2 培养基 斜面培养基(g／L)：牛肉膏 3，蛋 白胨 10，NaC15，琼脂 20，pH7．0～7．2；种子培养基 ：斜面培养基去除琼脂制备而成 ；初始发酵培养基( L)：玉米粉 5，黄豆粉10，(NH 1，牛肉膏 5，酵母膏 1，NaC15，pH7．0—7．2。 4)2SO42 方法2．1 液体发酵培养 种子发酵培养 ：将枯草芽孢杆菌FS106活化斜面接一环至 50mL种子培养基(250mL三角瓶 )，30℃、230r／min培养 15h。二级发酵培养：取 1mL种子液至 50mL发 酵培养基(250mL三角瓶)，30℃、230r／min振荡培养 36h。2．2 发酵无菌滤液制备 取一定的发酵液 ，用离心机(9000r／min)离心 15min，上清液用细菌滤器 (0．45μm)过滤 ，得到发酵液的无菌滤液 ，进行抑菌活性的测定。2．3 杆菌肽抑菌活性的测定 I矗 采用抑菌圈指示法测定发酵液杆菌肽抑菌活性，以金黄 色葡萄球菌为指示菌，将 2mL金黄色葡萄球菌的菌悬液加入 6ml 45～50℃的牛肉膏蛋白胨培养基中，迅速摇匀，倒入直径为15cm的无菌平皿中，待凝固后，用打孔器打出直径 2．5mm 的孔洞 ，每孔加发酵液 20μL，室温扩散 30min后置于 37℃恒温箱中培养24h，观察并记录抑菌圈的直径。2．4 发酵培养基的优化(1)培养基成分 的单因素优化。(2)碳源优化：分别用 5g／L溶性淀粉 、葡萄糖 、蔗糖 、麦芽糖 、玉米粉 、柠檬酸 、柠檬酸钠 、Na2CO3 等量代替基础培养基中的碳源，进行杆菌肽发酵，以确定最佳碳源。有机氮源优化：分别用 10 L尿素、酪蛋 白、黄豆粉、蛋 白胨、胰蛋 白胨作为基础培养基中的有机氮源 ，采用摇瓶发酵培养条件 ，进行杆菌肽发酵，以确定最佳有机氮源。无机氮 源优 化：分别用 lg／LKNO3、NaNO 、(NH )：SO4、NHNO 、NHCI作为基础培养基 中的无机氮源 ，进行杆菌肽发酵 ，以确定最佳的无机氮源。 生长因子优化：生长因子 的浓度为 6g／L，分别改变 2种生长因子牛肉膏与酵母膏的比例(6：0、5：1、4：2、3：3、2：4、1：5、0：6)，进行杆菌肽发酵，以确定最佳的生长因子。(2)Plackea—Burman(简称 PB)试验设计优化 培养基成分。根据培养基成分单因素的实验 ，供试菌种发酵培养基 的影 响 因素包括 玉 米粉、蛋 白胨、KNO，、牛 肉膏 、NaC1、CaCO3 、ZnSO4 ·7H20，实验选用 10因素 2水 平的PB试验设计，对这 7个因素进行研究 ，另外 3个 因素为虚拟变量 ，用于估计误差。试验设计 的每个 因素取 2个水平，根据前期实验确定各因素的水平 ，根据常规 PB试验设计要求高水平约取低水平的 1．5倍。试验设计和数据分析皆采用 SAS统计学软件 ，每组试验 3次重复 ，结果取平均值。结果形式单因素实验通过测定抑菌圈的大小判定其产量的出最优因子，PB实验选择 N=12的l0因素 2水平的 PB试验设计 ，实验设计与结果见表 1与表2，其中 x4、x7、x9为空白项，用于检验实验误差，根据常规PB试验设计要求高水平为低水平的 1．5倍 。后面一项（抑菌圈直径）表2PB实验设计因素水平及显著性极差R 调整R` 显著性排序最终得到最佳的培养基配方。参考文献[1]胡尚勤．杆菌肽高产的代谢调控 [J]．国外 医药抗 生素 分册 ，)：160—162[2]柏建玲，莫树平，郑婉玲 ，等 ．地衣芽孢杆菌与其他微生物产酶能力的 比较[J]．饲料研究 ，)：25—27．[3]顾真荣 ，吴畏 ，高新化 ，等 ．枯草芽孢杆菌G3菌株的抗菌物质及其特性[J]．植物病理学报 ，)：166—172．[4]饶正华 ，李丽蓓 ，高生 ，等 ．枯草 菌素在饲料中的应用 [J]．中国饲料 ，)：17—18．[5]郑虹 ，施 巧琴 ，施碧红 ，等．芽孢杆菌对养殖水体净化作用 的比较研究[J]．微生物学杂志 ，)：4l一44．[6]施碧红，罗秀针，施巧琴，等．枯草菌素产生菌芽孢杆菌FB123的发酵条件优化及其16SrRNA序列分析 [J]．工业微生物，)：14—18．[7]胡尚勤，王汉臣，刘天贵，等 ．高产杆菌肽菌株的筛选及培养条件研究[J]．河南师范大学学报，)：118—121．[8]余小平 ，劳东宏 ，曾扬南 ．中华人民共和国进出口商品检验行业标准[s]．北京 ：标准出版社 ，—93．[9]郑毅 ，刘源慧 ，邓琳芬 ．响应面法优化米 曲霉 a一淀粉酶液体发 酵培养基[J]．海峡科学 ，)：3—14．
范文十：从枯草中分离提纯枯草芽孢杆菌并培养观察 摘要：枯草培养法是利用枯草杆菌产生芽孢这一性质。因为芽孢对不良环境有较强的抗性。所以枯草在煮沸过程中，不含芽孢的细菌被杀死，而含有芽孢的枯草杆菌能够生存下来，在适宜的条件下进行繁殖生长。芽孢染色法是利用同一种细菌的芽孢和菌体对不同染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色，因芽孢壁厚，透性低，着色脱色均较困难，而使芽孢和菌体呈不同的颜色便于区分。因此芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿，在加热的条件下进行，因孔雀绿与菌体结合较差，所以易被水冲洗掉，而芽孢中的孔雀绿却难溶出，水洗后，再用一种呈红色的碱性染料加以复染，结果，菌体为红色，芽孢为绿色。关键词：
枯草芽孢杆菌
提纯 培养正文（一）研究方法1、实验器材1.1、材料： 枯草1.2、器材：三角烧瓶、温箱、木夹、酒精灯、剪刀、棉塞、涂菌棒、培养皿等。1.3、药品：7%NaCl牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基等。2、研究步骤2.1、枯草杆菌的培养：将枯草数根剪碎，放入三角瓶和电磁炉中，在三角瓶中加入适量Ca(OH)2，在电磁炉中不加入Ca(OH)2。加水没过干草（装量不超过瓶容量的1/2，以保证空气供应）。2.3、塞好棉塞煮沸5分钟。杀死无芽孢的细菌。枯草杆菌因芽孢抗高温而存活。还有其他的芽孢杆菌。2.4、置35摄氏度培养1-2天。或室温放置3-4天。2.5、液面出现白色菌膜。2.6、将其放入培养基中分离纯化，得枯草杆菌或其他芽孢杆菌。(1) 将白色菌膜移至牛肉汤蛋白胨培养基中，将其放置恒温箱中37度培养1-2天，产生菌落。（2）挑菌及纯化： 从上述培养基中分别挑取2个单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是芽孢杆菌属纯种互殴，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37°C培养1-2天后备用。（菌体应呈杆状，具芽孢，宽度一致；菌落颜色形状、质地、透明度均一致）2.7、从芽孢杆菌中鉴别分离枯草芽孢杆菌：（1）用细菌的简单染色法来区分杆菌与球菌。（2）用革兰氏染色法来验证枯草杆菌呈阳性。2.8、用已经提纯出来的枯草芽孢杆菌做细菌芽孢染色法来观察芽孢(二)实验结果1、镜检结果：在用三角瓶培养的菌体在镜检的视野中全部为球状菌体，在电磁炉中培养的菌体为杆状。2、芽孢染色结果：在三角瓶中的菌体无绿色芽孢，在电磁炉中培养的菌体有绿色的芽孢产生。（三）结果分析三角瓶比电磁炉的密封性好，在灭掉无芽孢的的细菌会相对会比电磁炉要高，而且，在 三角瓶中加入了可以杀灭无芽孢的细菌的Ca(OH)2，但是结果却是在空气通透性较大的电磁炉中培养出枯草芽孢杆菌，可能有以下几个原因：由于加入的Ca(OH)2的量过多，导致有芽孢的枯草芽孢杆菌也被杀死了；在高温5min的过程后，接种到培养基上有杂菌；在所用的枯草里的枯草芽孢杆菌较少，影响实验结果；在人为操作上有误差。