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【求助】间接法ELISA测抗体浓度时包被抗原浓度、血清稀释度及酶标记二抗的工作浓度如何依次摸索
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这个帖子发布于6年零31天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我是做ELISA的新手，没有现成的试剂盒，请问间接法ELISA测抗体浓度时包被抗原浓度、血清稀释度及酶标记二抗的工作浓度如何依次摸索，拜请高手指点！
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建议先按照二抗的推荐浓度，固定一个值。可以通过棋盘滴定法确定抗原和血清稀释度。最后对二抗浓度进行调整。
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谢谢！我看到网上说酶标抗体工作浓度选择时用100ng/mlIgG包被，洗涤，将酶标二抗做一系列稀释后分别加入已包被的孔中，加底物，终止，取A值在1时的酶标抗体的稀释度为工作浓度，我想请问为什么是用100ng/mlIgG包被呢？还有我想问一下多克隆抗体可以用来做标准品吗？拜请高手指点！由衷的感谢！
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做课题的人都用100ng/ml的抗体包被，因为那样是很多文献上说的，不会错。做产品的都会自己试一个浓度，因为这个浓度的蛋白包被太浪费了。多克隆抗体可以做标准品，但批间差异比较大。
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那这样的话我可以先摸索酶标二抗的工作浓度再摸索抗原包被量及血清稀释度了是吗？若上述值确定后，如何用已有的抗体做标准曲线呢？谢谢！
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我的意见是先确定抗体抗原的浓度，二抗的浓度放在最后做修饰调整用。至于如何做标准曲线。。。参考你的检测限和灵敏度来定吧。
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万分感谢！我先摸索一下抗原抗体的浓度吧，如果有不懂的再向您请教。
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关于丁香园请问水用中杉金桥的二抗ZDR-5306，做western时的稀释度是多少阿 - 实验交流 - 生物秀
标题: 请问水用中杉金桥的二抗ZDR-5306，做western时的稀释度是多少阿
摘要: [请问水用中杉金桥的二抗ZDR-5306，做western时的稀释度是多少阿] 说明书上说：不同方法参考效价为：ELISA 1:500~1000,免疫组化1:50左右，免疫印迹1:200~500，可用含有0 02%吐温20的PBS稀释使用。但1：400背景仍很高，用1：800行不？怎样摸合适的稀释度条件，请各位大侠帮忙！ 关键词:[稀释 二抗 效价 吐温 免疫印迹 免疫组化]……
说明书上说：不同方法参考效价为：ELISA 1:500~1000,免疫组化1:50左右，免疫印迹1:200~500，可用含有0.02%吐温20的PBS稀释使用。但1：400背景仍很高，用1：800行不？怎样摸合适的稀释度条件，请各位大侠帮忙！
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电话：021-Elisa终止后为何有絮状沉淀(絮状沉淀,抗体,二抗,稀释倍数) - 免疫实验 - 生物秀
500倍>1000倍）。难道是加入硫酸后二抗变性了，还是二抗过期了呢（一年前买的Sigma,-70分装）,OD值都在1 0-2 1之间。照了两张相片，请高手帮忙分析一下！ 关键词:[絮状沉淀 抗体 二抗 稀释倍数 硫酸]">
标题: Elisa终止后为何有絮状沉淀(絮状沉淀,抗体,二抗,稀释倍数)
摘要: [Elisa终止后为何有絮状沉淀(絮状沉淀,抗体,二抗,稀释倍数)] 近来做Elisa检测抗体浓度时，终止后有絮状沉淀，抗体浓度越高沉淀越多？！不知是为什么，重复3次了还是这样。结果也很怪异，抗体浓度高的（稀释倍数小的）孔OD值反而低（62 5倍 250倍>500倍>1000倍）。难道是加入硫酸后二抗变性了，还是二抗过期了呢（一年前买的Sigma,-70分装）,OD值都在1 0-2 1之间。照了两张相片，请高手帮忙分析一下！ 关键词:[絮状沉淀 抗体 二抗 稀释倍数 硫酸]……
近来做Elisa检测抗体浓度时，终止后有絮状沉淀，抗体浓度越高沉淀越多？！不知是为什么，重复3次了还是这样。结果也很怪异，抗体浓度高的（稀释倍数小的）孔OD值反而低（62.5倍 250倍>500倍>1000倍）。难道是加入硫酸后二抗变性了，还是二抗过期了呢（一年前买的Sigma,-70分装）,OD值都在1.0-2.1之间。照了两张相片，请高手帮忙分析一下！
回复昨天照的相片 回复这是正常的现象,你可以调整抗原和抗体的反应浓度,使OD值在正常显色时间内在1.0至2.2之间(这是TMB显色最灵敏的OD值),另外终止反应后应立即用酶标仪读数回复这是正常的，显色液浓度高了反应后是会有絮状沉淀的。就像上面那位仁兄说的那样，调整反应浓度，将od值控制在1.0-2.0之间。回复我得到的OD值都在1.0-2.0之间呀还请楼上两位相告为什么会产生沉淀呢?回复加入终止液后,兰色产物被逐步氧化,氧化后的产物聚集后形成黑色的沉淀物.你把硫酸的浓度降低些,可以避免产生这样的沉淀回复加入终止液后,兰色产物被逐步氧化,氧化后的产物聚集后形成黑色的沉淀物.你把硫酸的浓度降低些,可以避免产生这样的沉淀我用的终止液是2M的硫酸，加入底物溶液后终浓度为0.6666M，Elisa中不都是用这个浓度吗？顺便问一下，为什么终止后OD值在逐渐减小呢？回复langfeng还是很细心的，跟我一样，做实验爱问出个所以然来，所以我也期待高手的回答，因为一个实验看起来很庞大，细作起来，要追究的东西远远是超出你的想象的。我也不大明白为什么会出现这种现象，虽然自己的实验也出现过，不过确实是在OD值高于2的时候才多见黑色沉淀的。1-2只有少量但不明显。我看过好的显色液终止后，好像就不会出现这种状况。不知是不是应该依照显色液而选择终止液。还是依据终止液选择显色液呢？同样期待高手解答！~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~回复我在试验中也会遇到这样的情况，对于这种情况，我这样去解释的，由于检测样本浓度过高而导致有沉淀物产生。通常出现这情况时，只要再增加相应稀释倍数就可避免这种现象了。回复我当时离心后又测了一下，OD的趋势还是和有沉淀时一样（62.5倍 250倍>500倍>1000倍)现在关键是不知道产生沉淀的原理！...回复我的疑问是：做ELISA是OD值在0.800~0.200之间共有六个点值，IC50在0.600~0.700老板说这个结果比较好可是你们都说在1~2之间，这是怎么回事呢？回复随着时间的延长絮状物在加深，OD值变小应该是絮状物挡光的原因吧！回复62.5倍 250倍>500倍>1000倍,典型的hook效应.LZ听楼上几位大哥大姐的把OD值调整以下.我做金标也会出现絮状沉淀,上求组了很久也没人回答为什么会有絮状沉淀.自己还在摸索中回复我的疑问是：做ELISA是OD值在0.800~0.200之间共有六个点值，IC50在0.600~0.700老板说这个结果比较好可是你们都说在1~2之间，这是怎么回事呢？应该是问题出发点不同吧，因为最大OD一般在3.5左右，1-2之间相对更准确一点你们老板大概是从你的试验本身出发的，可能还有其他因素要考虑，所以那样告诉你
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有战友用过abcam 二抗做Elisa吗，稀释度是多少？
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问题已解决悬赏丁当:5
买了abcam羊抗人IgG Fc specific作为二抗说明书建议用1：0000稀释做Elisa，可是学校免疫老师说他们都用1：1000稀释二抗做Elisa，说运到国内的抗体不那么纯。请问有人用过吗，稀释度是多少？
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如果二抗浓度过高会怎样？即使二抗浓度高了可以通过洗板而避免浓度高带来的干扰吗？
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别听一些人瞎扯了。还是看你自己的试验要求啊，可以预试验测试一下，不过我建议稀释比例还说明书来说。我用过不少这种二抗。你可以10000倍为基准 上下都做几个浓度，没有背景更好，如果有，参考 我回复你的另一帖中提到的信噪比为标准作为筛选依据！
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AELOO 如果二抗浓度过高会怎样？即使二抗浓度高了可以通过洗板而避免浓度高带来的干扰吗？浓度”过高“的非特异是洗不掉的，所以还是要浓缩工作浓度。我就不知道了 说明书有建议工作浓度 干嘛要听别人说用1：1000
除非你有可靠的依据啊
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谢谢 xiaowu2008~~~听说他们用的也是abcam，不过是分装的。免疫老师的说法，对于我这个生手来说，确实挺困扰我的。其实我也觉得，说明书都这么说，不能差太多吧。不过我还是打算做一下预实验，整体摸下做的效果怎么样，看看试剂好不好使。准备这么做：200ng/ml抗原包板 二抗 \
一抗100ng/ml标准品阳性样本稀释1：100阳性样本稀释1：400阴性样本稀释1：100阴性样本稀释1：400空白（一抗加入1％MP）1：20001：10000
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设计得粗糙，不敢弄得太复杂怕分析不明白目的主要是 确定二抗浓度，试剂都好不好使，顺便看下2个真实的患者血清结果如何
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关于丁香园ELISA如何选一抗与二抗
小火wan1439
一抗是与底物相结合的,同时一抗必须有抗原识别位点,能被另一种抗体识别并结合.二抗是能与一抗的抗原识别位点识别并结合,同时,二抗必须有可以观测、计量的性质.这些性质可以是：①二抗本身带有颜色,可以通过分光度仪检测到二抗的浓度；②二抗还可以作为一种酶,催化另一种底物,通过检测底物或者生成物的浓度检测出二抗的浓度；等等……有很多,就是说必须是可测量的.
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