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细菌的革兰氏染色
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3秒自动关闭窗口微生物的染色技术及显微镜观察_仪器仪表_中国百科网
微生物的染色技术及显微镜观察
    一、细菌的简单染色法 & 1 目的 & 1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。 & 1.2 掌握细菌的简单染色法。 & 1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 & 2 原理 & 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。& 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
& 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 & 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 & 3 材料 & 3.1& 菌种 & 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌约24h营养琼脂斜面培养物、大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物、面包酵母琼脂斜面培养物。& 3．2& 染色剂 & 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。 & 3.3& 仪器或其他用具 & 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 & 4 流程 & 涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。 & 5 步骤 & 5.1& 涂片 & 取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作，分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
& 5.2& 干燥 & 室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。& 5.3& 固定 & 如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。& 涂片、干燥和热固定。& 5.4& 染色 & 将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min 。 & 5.5& 水洗 & 倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。 & 5.6& 干燥 & 甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。 & 5.7& 镜检 & 涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。 & 6 结果 & 绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。 & 二、革兰氏染色法 & 1& 目的 & 1.1 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。& 1.2 学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。
2& 原理 & 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain & Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。& 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。
& 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
& 3& 材料 & 3.1& 菌种 & 大肠杆菌（Escherichia& coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillus & subtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。 & 3.2& 染色剂 & 结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。& 3.3& 仪器或其他用具 & 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。 & 4& 流程 & 涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。 & 5& 步骤 & 5.1& 涂片 & 5.1.1& 常规涂片法 & 取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
& 5.2& 初染 & 滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。 & 5.3& 媒染& 用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。 & 5.4& 脱色 & 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。 & 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 & 5.5& 复染 & 在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。 & 5.6& 镜检 & 干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。& 5.7& 实验结束后处理 & 清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。
& 三、实验结果 & 1 根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。 & 2列表简述两株细菌的染色结果(菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。 & 四、思考题& 1 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ & 2 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? & 3 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? & 4 不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？ & 5 你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节? & 6 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察? & 7 如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?
收录时间:日 14:48:27 来源:
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环境中微生物的检测,细菌的简单染色,细菌的革兰氏染色
实验一：环境中微生物的检测，细菌的简单染色，细菌的革兰氏染色 作业题： 1、为什么在培养过程中要将培养基平板倒置 答：倒置的原因为 1、防止培养基水汽凝结后流下到培养基上，从而冲散菌落并造成多菌落 的污染串染，不利于细菌菌落的计数统计；2、同时培养基倒置后，可以有效防止外部空气 进入，防止杂菌污染培养基 2、为什么在实验中要留空白对照 答：预留空白对照组，可以通过观察空白对照组中
菌落生长情况，排除可能的因操作原因造 成的无关杂菌、 无关变量的污染干扰。 同时可以验证菌落生长长势不因为培养基制备的原因 而产生误差。 3、比较测试培养皿和对照培养皿中的菌落数说明什么问题 答：测试培养皿和对照培养皿同时进行操作，可以通过观察对照空白培养皿中的菌落数，对 照排除测试培养皿中因培养基制作或培养皿自身灭菌等操作误差引起的染菌因素。 便于判定 测试培养皿中哪些是来自环境中的微生物，哪些是来自于培养皿本身所携带微生物。 4、通过实验谈谈你对无菌操作的认识 答：通过第一次的实验，我们已经认识到环境中的微生物是无处不在的。在微生物实验中， 只要不注意， 就很有可能造成杂菌的污染而影响到正常实验。 在实验课上我们学到的是最基 本的无菌操作技术，而更重要的是树立无菌操作的意识，比如在操作的时候尽量不说话、不 用手去触碰非无菌区域， 对菌落进行接种时应该靠近火焰， 操作完后再次在火焰上方灼烧消 毒等等。 5、制片时为什么要固定？固定时应该注意什么事项？ 答： 制片时固定的意义在于防止后期在染色和冲洗玻片时细菌会随着流水冲散甚至冲走， 造 成制片失败。 固定时应注意不应直接将玻片放于酒精灯外焰灼烧， 否则会造成细菌因迅速脱 水而无法顺利固定在玻片上。同时不能灼烧过度否则会造成细菌缩水变形。 6、在使用和清理油镜过程中应注意哪些过程？ 答：油镜属精密仪器，需轻拿轻放并不能将镜子反向放置。在使用前，需对油镜用擦镜纸的 光面蘸取少量松柏油擦拭油镜镜头， 同时在样品玻片上样品处滴加少量松柏油。 放置好后调 至油镜，先调节粗准焦螺旋待其离样本距离很近时，换用细准焦螺旋调节，待其与样本上松 柏油接触形成一条油线。通过调节细准焦螺旋进行观察以免压坏镜头。 使用完后先调节粗准焦螺旋升起镜头， 然后用擦镜纸的光面蘸取少量二甲苯擦拭油镜镜 头，后再取擦镜纸蘸取少量松柏油擦拭油镜镜头。然后将油镜镜头摆置高处放置。 7、革兰氏染色的关键步骤是什么？为什么？应当如何控制？ 答：第三步酒精脱色。因为如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性；如果脱色不 够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性。应当在用酒精脱色过程中不断观察玻片颜色变化，并 适时用蒸馏水进行润洗以防脱色过度；同时严格控制脱色时间。 8、当需要对一株未知菌进行革兰氏染色时，应从哪些方面注意控制条件，才能保证对君主 的染色结果可靠？ 答： （1）要同时做一张革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的混合涂片，用作对照。 （2）注意脱色时间。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性 菌。如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可能被误认为是革兰氏阳性菌。 （3）注意染色所用细菌的菌龄，要选用处于对数生长期的菌体。如菌龄太老，由于菌体 死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。实验一一、实验目的环境中微生物的检测与细菌的革兰氏染色杨明轩 生物 111 1、用实验证明生活环境中存在各种微生物，了解无菌操作的重要性。 2、学习并掌握细菌的简单染色和革兰氏染色法。 3、学习并掌握油镜的工作原理及正确的使用方法。二、实验原理（一）环境中微生物的检测 微生物是一类形态结构多样的生物体， 广泛存在于我们生活的环境中， 其中大部分存在 于土壤中。在不借助显微镜的条件下，多数微生物肉眼不可见。有些微生物对人类及其他生 物有益，而有些则往往能引起工农业产品及实验室中各种实验材料的污染。在实际工作中， 必须牢固建立起无菌操作的概念，熟练掌握各种微生物操作技术，防止杂菌污染。 在我们生活的环境中存在着种类繁多的微生物， 在适宜的温度下， 将这些微生物接种到 适合于它们生长的固体培养基表面，经过一段时间，即可有单个菌体或孢子生长、繁殖形成 一个个肉眼可见的菌落。根据不同菌落形态上的不同，可以初步分辨出不同类型的微生物。 （二）细菌的革兰氏染色 细菌的革兰氏染色法是 1884 年有丹麦病理学家 Christain Gram 创立的，可以将细菌区 分为革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上比较重要和广泛应用的鉴 别染色法。其基本步骤是结晶紫初染、碘液媒染、乙醇脱色、番红复染。 细菌的细胞壁成分和结构不同， 因而对革兰氏染色产生的反应不同。 革兰氏阳性细菌的 细胞壁主要有肽聚糖形成的网格状结构组成，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而 使网状结构的孔径缩小，细胞通透性降低，结果使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易 脱色， 因而呈现蓝紫色。 相反， 革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低， 而脂类物质含量高， 当用乙醇处理时，脂类物质溶解，因而导致细胞壁通透性增加，并使结晶紫-碘复合物容易 被乙醇脱色，最后被染上复染液番红的颜色，因而成红色。 革兰氏染色法的结果不仅与乙醇脱色程度有关， 同时也与菌龄密切相关， 通常用处于对 数生长期的菌体进行染色。若菌龄过老，可能导致革兰氏阳性菌被染成阴性。三、实验材料1、菌种：大肠杆菌（Escherichia coli） ，37℃培养 12~16 小时（未污染） 大肠杆菌（Escherichia coli） ，37℃培养 12~16 小时（有污染） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ，37℃培养 16~18 小时 2、染料：草酸铵结晶紫染液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染液 3、其他：7 套无菌培养皿、150ml 细菌培养基（LB） 、载玻片、无菌水、洗瓶、擦镜纸、 吸水纸、二甲苯、香柏油、接种用具四、实验方法（一）环境中微生物的检测 1、接种（1）取一套培养基平板，不打开，作为对照组。编号为 7，注明为对照，以“CK（check） ”表示。 （2）取另外四套培养基平板，依次编号为 1、2、3、4、5、6。打开皿盖，分别作如下处理：咳嗽处理、在空气 中放置 20min、用手指按压培养基表面、衣服袖口按压培养基表面、钱币按压培养基表面、头发按压培养基表面。盖 好皿盖，并分别注明处理方式。 2、将所有培养皿倒置，与 28℃温箱中培养一周，观察结果。 （二）细菌的革兰氏染色 1、涂片：取一洁净的载玻片，在两端和中央各滴一滴无菌水。以无菌操作法分别取少量大肠杆菌、金黄色葡萄球 菌在两侧的水中涂菌，并在中间的水中进行混合涂菌。干燥固定。 2、染色： （1）初染：加草酸铵结晶紫染液各一滴覆盖于涂片处约 1min，水洗； （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并用碘液覆盖 1min，水洗； （3）脱色：倾斜载玻片，并衬以白背景，用 95%乙醇冲洗至流出的乙醇不带紫色为止，立即用水冲净乙醇； （4）复染：用番红染液覆盖 1min（可适当延长时间至 2min） ，水洗，风干； （5）镜检：干燥后置于油镜下观察； （6）清理：整理桌面，将显微镜恢复原样，将废片放入废片缸内。五、实验结果 1、对环境微生物的观察记录处理方式 咳嗽 菌落数 48 菌落种数 3 菌落类型 ① ② ③ 空气 25 6 ① ② ③ 指头 ∞ 6 ① ② ③ 衣服 28 6 ① ② ③ 钱币 71 7 ① ② ③ 大小 1.1cm 0.1cm 0.1cm 6.5cm 0.1cm 0.01cm 0.01cm 0.02cm 0.01cm 4.5cm 1.8cm 0.01cm 7.1cm 3.2cm 1.5cm 形态 不规则扁 平 圆形凸透 镜 圆形凸透 镜 丝状隆起 圆形凸透 镜 点状凸透 镜 圆形隆起 圆形凸透 镜 不规则扁 形 不规则扁 形 圆形脐凸 状 圆形凸透 镜 圆形扁平 圆形垫状 圆形凸透 镜 表面干湿 干 湿 湿 干 湿 湿 湿 干 干 干 干 湿 干 干 湿 颜色 白 黄 白 白泛黄 黄 红 黄 白 白 白 白泛黄 金黄 白 金黄 白 边缘 波状 完整 完整 丝状 完整 完整 完整 完整 波状 裂片状 完整 完整 啮蚀状 波状 完整头发283① ② ③4.1cm 2.0cm 1.8cm 0扁平 圆形脐凸 状 圆形脐凸 状 0湿 湿 湿 0白 白 金黄 0波形 完整 完整 0CK000通过上面的数据得知，环境中的微生物是无处不在的。相对来说，空气中的微生物较少，而桌面、人体表面的微 生物则较多。同时，我们应当注意到，并不是所有的微生物都能够在我们所使用的培养基和培养条件下生长的，实验 中观察到的微生物仅仅是真实存在的微生物中的一部分而已。 然而对于微生物实验操作，即便是空气中微量的未知微生物的沾染都会造成对目标微生物培养的严重影响，甚至 会导致目标微生物的变异或死亡，对实验结果造成无法估量的影响。因此在做微生物实验的时候必须严格树立无菌操 作的意识，确保实验结果的准确性。 因此对于微生物实验的结果的可靠性，我们应该保证 1、根据上述实验中手上微生物的检测，在做微生物实验前应 洗手，并在接触培养皿等容器前用 75%的酒精处理消毒。尽量减少手对培养皿的接触；2、树立无菌意识，对于有可能 沾染有外来微生物的器皿或仪器应及时在酒精灯上灼烧达到灭菌处理的效果；3、保证周围环境的相对恒定，做实验的 时候周围不应或尽量少站人，根据上述实验中咳嗽的微生物很多且很容易生长，会对实验结果造成很大的影响。因此 如有可能应尽量在人少或超净工作台里工作。4、对于接种环等经常接触不同微生物的仪器应随时用酒精灯进行灼烧或 者用紫外线进行消毒处理，以防上一批细菌对下一批的实验造成干扰。5、因为实验室中大量的微生物属未知微生物， 且可能会因实验条件而产生有害变异，因此在实验结束后应用 75%的酒精棉球及时擦拭手及可能接触到的皮肤，以防 微生物进入体内造成病害。 2、细菌的革兰氏染色情况菌名 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 菌体颜色 红色 蓝紫色 G或G G + G+ -表 2 细菌的革兰氏染色 注：本次实验中使用的大肠杆菌培养管中因前期实验准备中，混入杂菌导致在对大肠杆菌做革兰氏染色时发现在 红色细菌周围有存在蓝紫色的革兰氏阳性菌。 对于革兰氏染色法，本次实验中主要问题是如何把握控制涂菌的密度。在接种环蘸取菌落时不应涂抹过多菌体， 以防在后续观察染色时造成细菌重叠现象，从而对观察细致结构造成困难。解决方法为用接种环一次性从菌落表面刮 取一次菌落即可，然后在无菌水里充分铺匀摊开，避免细菌之间的重叠。
实验一一、目的要求 细菌的简单染色法和革兰氏染色法 1. 学习微生物涂片、染色...革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫 色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为...实验一、二 油镜的使用与细菌简单染色_工学_高等教育_教育专区。微生物学基础实验,油镜使用,革兰氏染色实验一 油镜的使用与细菌简单染色一、实验目的与内容 1....简单染色法就是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。 革兰氏染色法 (...(7)牙垢 图 6 牙垢涂片中微生物染色结果,10× 100 + 牙垢中含有多种细菌,...黎勇 实验一 油镜的使用和细菌的简单染色法 〔目的...〔方法内容〕 : (一)实验室环境中微生物的检查 (...(阳性) 图 1 视野观察下细菌的革兰氏染色反应 ...实验二 1 实验目的 微生物的染色及观察 一、细菌的简单染色法 1.1 学习微...革兰氏染色法是细 菌学中最重要的鉴别染色法。 革兰氏染色法所以能将细菌分为...实验六微生物的简单染色及革兰氏染色 利用显微镜对微...置于载玻片上的生理盐水中涂抹, 使菌悬液在载玻片...(5)Gram 在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时,...实验一、微生物的简单染色思考题 1 油镜与普通物镜...实验二、革兰氏染色 (1) 为什么必须用培养 24 h ...充分的保持琼脂的弹性与细菌容易繁 殖和生存的环境...学习了解微生物染色的基本原理与方法 学习掌握细菌的简单染色和革兰氏鉴别染色技术...革兰氏染色对于细菌的分类、鉴定及食品卫生检测都有重要意义。 革兰氏染色原理 ...细菌的简单染色和革兰氏染色及其注意事项 (一)目的:学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法. (二)原理:用于生物染色的染料主要有碱性染料,酸性染料和中性染料三大类....微生物实验思考题参考答案及知识要点_农学_高等教育_教育专区。二. 细菌的简单染色和革兰氏染色 1. 革兰氏染色中那一步是关键 为什么?你是如何操作的? 革兰氏染...
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