nanoluc和质粒酶切验证怎么连接

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-10-08 16:33 标签： 质粒酶切验证

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【摘要】目的 构建人表面活性物質蛋白-B (SP-B)基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒酶切验证,并分析其在H441细胞中的转录活性.方法 (1)以人基因组DNA为模板,PCR扩增SP-B启动子(-218/+435 bp)序列片段,并通过TA克隆方法连接到pGM-T载体上,筛选阳性克隆将目的片段进行测序.测序鉴定正确后的目的片段被克隆到荧光素酶表达载体pGL3-Basic上构建pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒酶切验证,酶切及测序鉴定重组质粒酶切验证；(2)将构建的pGL3-basic-SP-B-promoter重组质粒酶切验证酶切改造,SP-B启动子克隆进pGL4.17载体构建pGL4.17-SP-B-promoter重组质粒酶切验证；经酶切及基因测序确认無误后,采用脂质体法将构建的两种重组质粒酶切验证分别和内参质粒酶切验证pRL-TK同时转染H441细胞,检测双荧光素酶活性.结果

中国医师杂志 2013年 6月第 l5卷第 6期 Journal ofChinese PhysicianJune 2013。Vo1．15No．6 人表面活性物质蛋 白 B基 因启动子荧光素酶 报告基 因重组质粒酶切验证 的构建及活性检测 王席娟 蔡保欢 李文斌 刘伟 王靓 常竝文 【摘要】 目的 构建人表面活性物质蛋白一B(SP-B)基因启动子荧光素酶报告基因重组质粒酶切验证， 并分析其在 H441细胞中的转录活性方法 (1)以人基因组 DNA为模板，PCR扩增 SP．B启动子(一 218／+435 bp)序列片段并通过 TA克隆方法连接到 pGM—T载体上，筛选阳性克隆将 目的片段进行 测序测序鉴定正确后的目嘚片段被克隆到荧光素酶表达载体 pGL3．Basic上构建 pGL3．basic．SP．B． promoter重组质粒酶切验证，酶切及测序鉴定重组质粒酶切验证；(2)将构建的pGL3-basic—SP．B．promoter重组质粒酶切验证酶切改 造 sP—B启动子克隆进 pGL4．17载体构建 pGL4．17-SP．B—promoter重组质粒酶切验证；经酶切及基因测序确认 无误后 ，采用脂质体法将构建的两种重组質粒酶切验证分别和内参质粒酶切验证 pRL—TK同时转染 H441细胞检测双 荧光素酶活性。结果 构建的重组质粒酶切验证经酶切及测序鉴定完全正确转染 H441细胞后 ，检测细胞裂 解液萤火虫荧光素酶(firefly)及海肾荧光素酶(renilla)活性两者 比值间接反映启动子活性，pGI3． basic／pGL4．17-SP-B—promoter重组质粒酶切验证 的 firefly／renilla比徝 (2．8±1．1、66．5±3．8)较空载体质粒酶切验证

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