求助：转膜电压高怎么办流如何确定

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-11-03 22:01 标签： 转膜电压高怎么办
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【求助】western 的转膜条件和转膜时间如何确定？？
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这个帖子发布于4年零307天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做western，做的是糖基化蛋白，分子量大概在70kd 55kd 37kd左右配胶，上样量都没问题，内参孵出来很齐电泳：70v 30min +100v 60min0.45um的PVDF 转膜电转：200mA
100min 封闭1h一抗浓度：按前人的经验做，验证没问题TBST:5min 3次二抗：1:5000 浓度没问题TBST：5min 3次目的条带总是出不来。请教各位，是不是我的转膜时间太长了，转膜的电流和转膜时间是怎样的关系？？
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sino_biological 凭我的经验是：转膜时间没问题，不知道你的蛋白表达量高么？如果是表达量低的问题你可以尝试做做Elisa或者dot blot。如果电泳和电转条件都没有问题的话，那是不是我的样品问题，因为我从六孔板（瞬时转染的肿瘤细胞）上提蛋白的时候，加了裂解液（RIPA:PMSF=100:1），每孔加200ul ，之后液体变成粘稠的鼻涕样，14000 g 离心30分钟 没法离心出沉淀。之后拿去超声，蛋白样品就没有那么粘稠了，之后就没有再离心，BCA测蛋白浓度特别高，70ug才加3ul左右。之后加了loading buffer 煮沸5min后上样。这样看来，是不是问题出在我的样品上，是不是我的样品不纯？？RIPA用的是碧云天的强裂解液，PMSF是自己配的。为什么每次裂解蛋白都是鼻涕样的呢？？
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sino_biological 你试过洗涤细胞后 直接煮样 进行wb么？没有试过，细胞需要消化下来吧？具体是怎么操作的？？
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sino_biological 对胞内表达蛋白（且上清中），我们实验室当时简易的wb检测就是EP管取细胞液；1000g离心取培养基后,以PBS洗涤3次（1000g离心）；就可以直接煮样进行wb了，很简单，而且效果都不错。具体你去看看的专业介绍吧。我做的目的蛋白是膜蛋白。。。所以这个方法也一样适用吗？
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sino_biological 应该可以，当时我们实验室有一些做家蚕膜蛋白在细胞中表达的 都是这样wb的噢噢，这样子啊。试试~~谢谢你拉~~~
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sino_biological 对胞内表达蛋白（且上清中），我们实验室当时简易的wb检测就是EP管取细胞液；1000g离心取培养基后,以PBS洗涤3次（1000g离心）；就可以直接煮样进行wb了，很简单，而且效果都不错。具体你去看看的专业介绍吧。还有一个问题，就是直接加1x的loading buffer 煮样吗？？六孔板的一个孔加多少量，100ul？？还是200ul？？？
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sino_biological 2mL的细胞液 去培养基并洗涤后 如果你的蛋白表达量低的话（貌似细胞表达的没几个高的）可以少加点PBS（比如100ul或者200ul）溶解，loading buffer可以用4×或者5×的，这样进一步起到浓缩的效果，上样量的话，这得看你的蛋白了，不同的孔不同的上样量吧 先来个预实验试试 期待你转出一张漂亮的western嗯嗯，试试呐。做出来了，我就上个图。。谢谢！
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sino_biological 2mL的细胞液 去培养基并洗涤后 如果你的蛋白表达量低的话（貌似细胞表达的没几个高的）可以少加点PBS（比如100ul或者200ul）溶解，loading buffer可以用4×或者5×的，这样进一步起到浓缩的效果，上样量的话，这得看你的蛋白了，不同的孔不同的上样量吧 先来个预实验试试 期待你转出一张漂亮的western现在我总结一下你建议的步骤：1 六孔板中将每孔的细胞消化下来，1000g离心弃培养基，加PBS重悬，1000g离心，重复3次。弃PBS。2 加入100ul的PBS重悬，再加入5xloadingbuffer 25ul （loading buffer 的终浓度是1x）3 100摄氏度，煮沸10min。请问整个流程是这样的吧？？？
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sino_biological Yes! Exactly!Thank you so much!!!
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ufwtny 你的裂解液加那么多呢啊？？？六孔板每孔加200 ?l，是不是太多了啊……后来没有用RIPA提蛋白了。
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【求助】请教Western Blot恒压转膜对应电流的问题
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这个帖子发布于7年零217天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
:(各位兄弟姐妹：最近作Western Blot 碰到这样一个问题，120V恒压转膜时对应电流开始转时150mA左右，然后一段时间（大概是10min左右）电流就在100mA左右彷徨。而同样的条件别人120V对应电流是200mA，不知道是怎么回事？！请问这样会不会影响转膜效果？（转膜时间1.5hr）:~)是什么原因导致的转膜电流下降的？（转膜液是新配的10*的，甘氨酸90g，Tris碱19.3g。使用时稀释成1*，取100ml 10*的加200ml甲醇和700ml水，实验室的人都是这么用的）有没有什么解决办法！？先谢谢啦！:)
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换个人家的1X看看，如果不一样，那么可能是称试剂称错了。其实也不怎么影响转膜，电流小，多转一点时间。
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我平常用的恒压100V 1h，刚开始是0.28A左右，后来会升到0.31A用的是不加SDS的电转液，3gtris，14.4g 甘氨酸，20%甲醇，加水到1000ml
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谢谢你们的分析关键是现在我做Western Blot结果不稳定（有时有条带有时没得，背景时好时坏），现在我在想到底是抗体的原因还是转膜的原因；因为回想这一个月十几次Western Blot，我注意到我恒压转膜对应电流状态好时有180mA，然后掉到150mA（转膜10min的样子），或者是150mA然后120mA，最近150mA然后60或70mA（都是转膜10min左右后的变化）。有次试着用恒流转膜（200mA），对应电压大概180-190V的样子，结果转膜Marker条带非常不清晰，用丽春红染色后只见泳道不见蛋白条带。现在兄弟很抓狂，不知如何分析改进？请教了实验室的能人，建议重配转膜液和换转膜的装置；我转膜液前后已配了4，5次，装置也用的是实验室公用的，所以很迷茫。望各位不吝赐教！
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我也是这样啊，WB的干扰因素太多了，有时能做出来，有时却做不出来，而且还找不出哪里出问题了，郁闷好多天，有时出来一板很漂亮的，发现少了一条带，。。。唉，western真是要命啊。另外，转膜的时候一定要注意蛋白分子量的大小，如果太小，很容易就把蛋白转过了，这样就什么都看不到了，如果分子量小就要用0.22Um孔径的膜，时间短一些，转膜液里最好不加SDS
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感谢各位的分析！！！
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wings_008 我平常用的恒压100V 1h，刚开始是0.28A左右，后来会升到0.31A用的是不加SDS的电转液，3gtris，14.4g 甘氨酸，20%甲醇，加水到1000ml我也是用这个配方 但是100V下电流不到100mA 请问这是出现了什么问题？
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【求助】转膜时电压往下降，电流上升，帮忙给分析分析原因！
我要转的蛋白超大，3000kD左右。想用100v 2h转膜。但是转移液发热太明显，放4的房间加磁珠搅拌也不管用。只见电压由100逐渐往下降，而电流却不停的彪升，超过400mA。不知对转膜电流和电压有没有上限啊，请高手指点一下。已经失败数次了。有人说可能我的转膜液有问题才会如此发热。每次都是新配的嘛。配方也是普通的：tris、glycine 加20%的甲醇。减少甲醇为15％也转不了。转膜液是否需要过滤或消毒处理吗？3000kD??是啊，kDa,有几个ｉｓｏｆｏｒｍｓ，降解条带也有２７００ｋＤ。你的目的蛋白分子量很大, 建议你 4度下, 20-30V 过夜转膜.转膜缓冲液中不要加20%的甲醇, 大分子转膜时甲醇会降低转膜效率.再一个转膜缓冲液需预冷. 希望能有所帮助
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