一抗，钙激活的中性蛋白酶2抗体/Calpain 2
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____钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白mRNA在类风湿发病机制中的作用
钙蛋白酶及钙蛋白酶抑制蛋白mRNA在类风湿发病机制中的作用
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　　【摘 要】 目的 通过比较钙蛋白酶(calpain)和钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)mRNA在类风湿关节炎(RA)和骨关节炎(OA)滑膜上的表达以及人的calpastatin抗原表位的探查，研究calpain和cal&pastatin在RA发病机制中的作用。方法 总RNA从3例RA和2例OA患者滑膜组织中提取;RT&PCR和数字影像光密度仪检测calpain和calpastatin的表达。用自动多肽合成仪合成人的calpastatinN一端L区和C一端Ⅳ区重叠的寡聚肽链;7例RA血清通过dot&ELISA法鉴定合成的calpastatin肽链的抗原表位。结果 RA和OA患者的滑膜组织calpain mRNA的表达水平均高于calpastatin的表达，同时calpain的表达在RA高于OA。人的calpastatin的三个共同的抗原表位被鉴别在C一端Ⅳ区。结Calpain和calpastatin系统参与了RA的发病;RA患者体内存在抗calpastatin自身抗体，合成人的calpastatin肽链可能为RA的诊治提供新的思路。
　　【关键词】 钙蛋白酶;钙蛋白酶抑制蛋白;关节炎，类风湿
　　(rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜增生，软骨破坏和骨侵蚀为特征。发病机制仍不很清楚。最近一些研究报道了钙蛋白酶(calpain)能够降解结缔组织基质并在RA软骨破坏上发挥了重要的作用&1l。Calpain是一种钙依赖中性半胱氨酸蛋白酶，只有在钙存在时才能被激活，它包括一个相对分子质量为80 000的大亚基和一个相对分子质量为30 000的小亚基 . 钙蛋白酶抑制蛋白是calpain的天然抑制剂，它由5个部分组成，每个部分约140个氨基酸。Calpain&calpastatin系统最初被认为是一个细胞内蛋白水解酶，最近证明它们也存在胞外，如在RA和OA的滑液中。本研究用于细RT&PCR探查和比较calpain&calpastatin系统在RA和OA滑膜组织中的情况;同时合成calpastatin的Ⅳ区和L区肽链，用RA患者血清通过ELISA方法鉴别其抗原的表位，进一步探讨RA的发病机制。
　　1材料和方法
　　1.1 标本
　　3例RA和2例OA病人的膝关节滑膜组织，7例RA患者的血清被获取。所有RA患者均符合ARA 1 987年诊断RA的标准。
　　1.2 方法
　　1.2.1 RT&PCR：总RNA提取：取5～10 mg冷冻滑膜组织，用PURE试剂盒(Gibco公司)，按操作说明进行。
　　1.2.2 Dot&ELISA检测合成的重叠寡聚肽链
　　2 结 果
　　2.1 Calpain和calpastatin mRNA的表达
　　2.2 用RA血清鉴别calpastatin线性表位图：为了鉴别calpastatin的抗原性和表位。每9个氨基酸肽链为最小的阳性片段重叠的1 44寡聚肽链(calpas&tatin的10 1～1 53和564～680氨基酸残基)被合成和分析。Dot&ELISA法探查合成的calpastatin抗原表位，7例RA血清有5例患者与合成的肽链发生明显的反应，并且3个共同的表位被显示，其氨基酸序列分别为DKDLDDALD，DTIPPEYRH和QDPIDALSG。正常人对照血清没有反应。
　　3 讨 论
　　Calpain&calpastatin系统与RA的联系已经被报道。Calpain是一个溶解性的钙依赖半胱氨酸蛋白酶已经被广泛研究在体内外炎症模型中和在体外降解软骨的蛋白多糖。一些动物模型提示与细胞相互作用有关的蛋白水解酶在软骨破坏上发挥作用。这些蛋白水解酶通常在体内被特异性天然的抑制剂灭活。在正常的生理情况下，激活的calpain可被calpastatin抑制而保持平衡，但是在关节炎时calpain和calpastatin被提示是不平衡的。Yamamoto等报道：用免疫组织化学探查了calpain在RA和OA滑膜内层的分布，结果RA的calpain稍强于OA;同时在RA患者的关节滑液中calpastatin少于calpain。本研究也显示calpain和calpastatin mRNA的表达在RA和OA滑膜组织是不平衡的，calpain高于calpastatin，尤其在RA更为明显。这个结果提示过多的calpain可能参与了RA和OA的软骨破坏，这与临床上RA和OA都有软骨损伤，而RA更是以软骨和骨进行性破坏为特征的临床表现相一致。
　　Calpain多于calpastatin的机制如何?目前尚不清楚。但抗calpastatin自身抗体被探查在RA为48%～57%，而在其他结缔组织病为11%～25%。抗calpastatin抗体完全有可能阻止了calpastatin介导的抑制calpain的蛋白水解活性，该抗体与calpastatin结合，使活性calpastatin减少，相对增加了calpain的活性并可能累及组织损伤，这就可能导致免疫复合物介导的炎症反应和不可控制的calpain激活。
　　在我们的研究中，人的calpastatin的N一端(L区)和C一端(Ⅳ区)被选择来合成了寡聚肽链，合成肽链抗原的表位用dot&ELISA检测，7例RA患者的血清有5例显示与合成的肽链有明显的反应并且几个共同的表位均被鉴定在calpastatin的C一端，N一端没有观察到反应，这与calpastatin的N.端没有抑制功能，C一端为抑制功能区可能有关。同时正常对照血清没有反应。这个结果说明calpastatin可能是一个自身抗原，它的表位能够与患者的血清中的抗calpastatin自身抗体结合。Mimori等也报道了一个对靶抗原的自身抗体cDNA克隆(RA一6)完全被鉴定在人的calpastatin的C一端。虽然我们的研究显示，合成的人的calpastatin的C一端(Ⅳ区)与RA患者的血清起反应，但是否与calpas&tatin的C一端(I、Ⅱ、Ⅲ区)起反应，是否与OA患者的血清起反应，尚需进一步的研究。
　　抗calpastatin自身抗体又是如何产生?有报道发现：calpain和calpastatin的表达增加在感染了人类嗜T淋巴细胞病毒1(一种反转录病毒)细胞内，这种病毒可以引起类似RA的关节病变，可能与人类的calpastatin有共同抗原。另外calpastatin基因突变也可能产生异常的calpastatin表达，成为自身抗原。Esser等已报道了用合成的半胱氨酸蛋白酶抑制剂作为抗风湿疾病的缓解药已用于小鼠的佐剂性关节炎和胶原诱导的关节炎。因此，研究calpain&calpastatin系统有助于理解RA的发病机制，合成钙蛋白酶的抑制剂可能为开拓新的抗风湿药提供思路。
　　&&转自中华风湿病学杂志
　　作者：徐建华 张仁利 孙桂华 杨明功 帅宗文 张锐
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面议深圳市一种以DNA聚合酶δ为靶标筛选化疗药物及药效的方法
一种以DNA聚合酶δ为靶标筛选化疗药物及药效的方法
【专利摘要】本发明涉及一种以DNA聚合酶δ为靶标筛选化疗药物的方法，属于生物化学与细胞分子生物学领域。方法为：确定出由Calpain激活途径介导的肿瘤细胞凋亡，以DNA聚合酶δ/p12为靶标，快速评价某种化疗药物对特定肿瘤细胞的杀伤效率。优点为：结合市场可购买的检测细胞凋亡、Calpain和Caspase-3活性的常规试剂盒，通过检测DNA聚合酶δ各个亚基在不同细胞凋亡途径中不同时间的变化，以DNA聚合酶δ作为细胞凋亡的一个新靶标，方便准确地判断某种肿瘤化疗药物的药效，本发明特别适用于Calpain激活途径介导癌细胞凋亡的化疗药物筛选。
【专利说明】一种以DNA聚合酶5为靶标筛选化疗药物及药效的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物化学与细胞分子生物学领域。具体而言，特指一种以DNA聚合酶6为靶标，快速评价某种化疗药物对肿瘤细胞杀伤效率的方法。
[0002]化疗或靶向药物治疗的一个主要分子机理是通过激发肿瘤细胞凋亡机制(apoptosis)来杀死肿瘤细胞,然而,肿瘤细胞本身却会迅速对药物做出反应，自身演化出一套反凋亡机理来抑制细胞的凋亡，从而产生耐药性。
[0003]目前被普遍认可的多种被广泛应用于治疗头颈部癌症、宫颈癌、骨肉瘤等多种肿瘤的化疗药物，如顺钼和多西紫杉醇等，均通过诱导细胞凋亡或肿瘤坏死而达到治疗目的(Takahara PM., et al., Nature, : 649—52; Ahsan A., et al., Cancer Res., 62-69; Pfreundner L., et al., Radiother Oncol., 3-70)。但这些药物的普遍缺点除了严重毒副作用外，其癌细胞所产生的日渐突出的耐药性，使其临床应用受限制，疗效也受影响(Mintz MB.，et al., Cancer Res, 48-54)。一旦癌细胞产生耐药性，即使有极少数癌细胞未被杀死，这些“漏网”的癌细胞也会很快扩散和转移，在这种情况下，目前还没有更为有效的治疗手段。而A23187是一种钙离子转运载体，作用于肿瘤细胞后，可以造成内质网钙离子浓度失衡，激活Calpain，诱导多种肿瘤细胞以Calpain激活依赖性的途径而凋亡。
[0004]化疗药物诱导癌细胞凋亡的能力被视为评估疗效的一项重要指标，因此，开发出一种高效的评估药效的手段(获得一个特异性针对细胞凋亡的理想靶标)，筛选既毒副作用小，又能确保肿瘤细胞被彻底杀死的化疗药物，以避免“漏网”癌细胞的扩散和转移，是全世界科学家正在努力的目标。
[0005]研究表明，细胞凋亡主要是由于DNA损伤和修复系统缺陷所致，大部分抗肿瘤药物均通过直接损伤DNA或者阻断DNA代谢系统的DNA聚合酶和异构酶而激活细胞凋亡。即:一旦药物导致肿瘤细胞产生DNA损伤，而多种DNA损伤的修复途径又失灵，如O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(06-methylguanine-DNA methyltransferase)、喊基切除修复(base-excision impair)、核苷酸切除修复(nucleotide-excision r印air)、DNA双键断裂修复(DNA double-strand breakrepair)、以及碱基错配修复(DNA cross-link repair)等,将直接诱导肿瘤细胞的凋亡(RoosWP, et al., Trends Mol Med., 0-50)。作为一种最主要的聚合酶，DNA聚合酶 5(Polymerase 5，Pol S )在各种形DNA修复过程中通过重新合成DNA (Re-synthesis of DNA)和缺口填补(Gap-fillin)等功能起着重要的作用(Branzei D., &? Foiani, M., Nat Rev MolCell Biol, 7-308)。通过对人DNA聚合酶S进一步的研究发现，DNA聚合酶8本身也是一个 DNA 损伤响应的革巴标(Zhang, S., et al., J Biol Chem, : 15330-40)。在体外培养的人细胞中，通过遗传毒物处理或射线诱导而引起DNA损伤的情况下，DNA聚合酶6的小亚基pl2在ATR/Chkl通路调 控下以泛素化依赖的形式降解，从而导致细胞内DNA聚合酶6由原来的四聚体形式Pol S 4转换为三聚体Pol S 3以应对DNA损伤(Meng，X.，et al.,Nucleic Acids Res, 7-657)。但到目前为止，还未有利用DNA聚合酶或异构酶(topoisomerases)作为细胞凋亡的革巴标。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是:确定DNA聚合酶8是细胞凋亡过程的一个新靶标，首次提出一种以DNA聚合酶8为靶标来评估某种化疗药物对肿瘤细胞杀灭效率的方法。
[0007]本发明所要解决的技术问题简述为:采用诱导Caspase-3激活途径导致细胞凋亡的肿瘤化疗药物多西紫杉醇和顺钼、以及诱导Calpain激活途径导致细胞凋亡的高选择性钙离子载体A23187分别处理宫颈癌细胞HeLa，诱导HeLa细胞进入凋亡，用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检查进入不同凋亡时期的癌细胞，用钙蛋白酶活性检测试剂盒测定Calpain活性,用Caspase-3活性检测试剂盒测定Caspase-3的活性，再用抗DNA聚合酶5四种亚基的抗体Western blot分别检测4种亚基pl25、p50、p68和pl2在不同凋亡途径中凋亡早期和凋亡晚期的特征变化，确定DNA聚合酶5是某种细胞凋亡途径的一个新靶标；由此，以DNA聚合酶5为靶标，评估肿瘤化疗药物对由某种凋亡途径激活的肿瘤细胞的杀灭药效。
[0008]以DNA聚合酶5为靶标筛选化疗药物的方法按照下述步骤进行:
1.介导癌细胞凋亡途径的确定:首先，在用细胞培养瓶体外培养的癌细胞培养基中添加一定计量待筛选的化疗药物，收集药物处理后不同时间的细胞，以细胞凋亡试剂盒检测并确定何种药物具有诱导癌细胞凋亡的功效，同时，确定发生癌细胞凋亡是由Caspase-3激活途径还是由Calpain激活途径所介导的。
[0009]上述步骤中所述的癌细胞为外购的人宫颈癌HeLa细胞株(型号:HeLa_S3)。
[0010]上述步骤中所述的诱导Caspase-3激活途径介导癌细胞凋亡的肿瘤化疗药物为外购的多西紫杉醇和顺钼；诱导Calpain激活途径介导癌细胞凋亡的药物是外购的高选择性钙离子载体A23187。
[0011 ] 上述步骤中所用测定Caspase-3和Calpain活性的试剂盒分别为外购的Caspase-3活性检测试剂盒和韩蛋白酶活性检测试剂盒。
[0012]上述步骤中所用监控癌细胞凋亡的试剂盒为外购的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒。
[0013]2.DNA聚合酶5在不同细胞凋亡途径中的行为变化:收集不同时间点、对应于步骤I中所处不同凋亡途径介导的癌细胞，裂解细胞，高速离心后取上清进行SDS-PAGE电泳并转膜，以分别抗DNA聚合酶5四种亚基的抗体进行Western blot分析，分别检测四种亚基pl25、p50、p68和pl2在不同凋亡途径中凋亡早期和凋亡晚期的特征变化，确定DNA聚合酶S是某种细胞凋亡途径的一个新靶标。
[0014]上述步骤中，在Calpain激活途径介导癌细胞凋亡早中期，小亚基p 12在药物处理后12小时被降解，随后又逐步回复至正常水平(24小时)，而在癌细胞凋亡晚期，大约36小时开始，pl2又逐步被降解，直到第48小时，pl2及另外三个亚基均被降解，意味着在该途径细胞凋亡晚期，DNA复制叉完全崩塌，癌细胞彻底死亡。
[0015]上述步骤中，如果仅pl2被降解，而其它三个亚基依然存在(凋亡早期)，则意味着尽管大部分癌细胞进入凋亡，但仍有少量癌细胞还具有生长能力，有可能这些“漏网”的癌细胞会很快无序增殖、扩散和转移。
[0016]上述步骤中，在Caspase-3激活途径介导的癌细胞凋亡过程中，DNA聚合酶S四个亚基没有明显的变化。
[0017]本发明的突出优点表现为:结合市场可购买的检测细胞凋亡、Calpain和Caspase-3活性的常规试剂盒，通过检测DNA聚合酶5各个亚基在不同细胞凋亡途径中不同时间的变化，以DNA聚合酶5作为细胞凋亡的一个新靶标，方便准确地判断某种肿瘤化疗药物的药效，本发明特别适用于Calpain激活途径介导癌细胞凋亡的化疗药物筛选。
[0018]本发明通过以下附图和实施例作进一步详细阐述。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1.应用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒对HeLa细胞经不同凋亡诱导剂处理后在不同时间的检测结果。图中左边数字表示凋亡诱导剂处理后检测细胞凋亡的时间，分别为12，24，36和48小时；图下方“对照”表示未经诱导剂处理的细胞作为对照，“ I”表示荧光显微镜下观察到的、在凋亡早期被Annexin V-FITC检测到的脂膜外翻的磷脂酰丝氨酸(PS)的绿色荧光信号，“2”表示用碘化丙啶(Propidium 1dide, PI)检测到的凋亡晚期染红的细胞核，“3”表示“I”图和“2”图的重合。A:用肿瘤化疗药物多西紫杉醇和顺钼联合处理HeLa细胞。B:采用钙离子载体A23187处理HeLa细胞。
[0020]图2.钙离子载体A23187处理HeLa细胞后Calpain活性变化、DNA聚合酶8四个亚基的降解变化、以及Calpain抑制剂ALLN对四个亚基降解的影响。A: Calpain活性变化时相。与图1B中观察细胞凋亡的时间点相对应，分别在细胞被A23187处理后的0，12，24，36,48小时用韩蛋白酶活性检测试剂盒测定Calpain活性变化,横坐标表示分析Calpain活性的采样时间点，纵坐标表示相对Calpain活性，以相对突光单位RFU (RelativeFluorescent Unit)表示。B: DNA聚合酶5四个亚基的降解变化时相。以抗DNA聚合酶6四种亚基的抗体Western blot分别检测4种亚基的降解变化，图中左边的数字表示标准蛋白Marker (KDa)，右边的箭头和数字分别表示各自亚基和内参蛋白的位置。图上半部，横坐标表示:M为标准蛋白Marker, r-pol 8表示以纯化后的重组DNA聚合酶5四亚基蛋白复合物作为标准对照，0，12，24，26，48分别表示采样的时间点，以卢-actin蛋白作为内参。图下半部表示每隔4小时在0-24小时的时间段对pl2小亚基进行Western blot分析，检测这个时间段P12降解和恢复的变化情况。C: Calpain抑制剂ALLN对四个亚基降解的影响。图中左边的数字表示标准蛋白Marker (KDa)，右边的箭头和数字分别表示各亚基和PCNA蛋白的位置。左半图:表示在A23187处理后48小时对DNA聚合酶5四种亚基的Western Blot分析，M表示标准蛋白Marker (KDa), “a”表示未经处理的细胞作为阴性对照，“b”表示经A23187处理后48小时的细胞，“c”表示在A23187处理前3小时加入ALLN抑制剂，处理48小时后采样。右半图:表示在A23187处理后12小时对DNA聚合酶5四种亚基的Western Blot分析，“e”表示未经处理的细胞作为阴性对照，“f”表示经A23187处理后12小时的细胞，“g”表示在A23187处理前3小时加入ALLN抑制剂，12小时后各亚基的变化。
[0021]图3.经多西紫杉醇和顺钼联合处理HeLa细胞后Caspase-3活性变化和DNA聚合酶5四个亚基的降解变化。A: Caspase-3活性变化时相。与图1A中观察细胞凋亡的时间点相对应，分别在O，12，24，36，48小时用Caspase-3活性检测试剂盒测定Caspase-3的活性，横坐标表示分析Caspase-3活性的采样时间点，纵坐标表示检测的相对Caspase-3活性，以在405nm处测定的吸光度OD4tl5表示。B:DNA聚合酶5四个亚基的降解变化时相。以抗DNA聚合酶5四种亚基的抗体Western blot分别检测4种亚基的降解变化，图中左边的数字表不标准蛋白Marker (KDa),右边的箭头和数字分别表不各自亚基和内参蛋白的位置。横坐标表示:M为标准蛋白Marker,r-pol 8表示以纯化后的重组DNA聚合酶5四亚基蛋白复合物作为标准对照，0，12,24,26,48分别表示采样的时间点，以卢-actin和PCNA作为内参蛋白。
[0022]实施方式
人宫颈癌HeLa细胞株(型号:HeLa_S3)为美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection, ATCC)产品，购自上海艾研生物科技有限公司；所用细胞培养基DMEM和小牛血清等化学试剂购自GIBCO BRL公司。其它实验材料购自:钙离子载体A23187为Sigma公司产品；多西紫杉醇(paclitaxel)、顺钼(cisplatin )、Calpain抑制剂ALLN均为BioVision公司产品；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒为Abcam公司产品；Caspase_3活性检测试剂盒是碧云天生物技术研究所产品；钙蛋白酶活性检测试剂盒为BioVision公司产品。抗人源DNA聚合酶5的4个亚基pl25、p68、p50和pl2的抗体分别为:鼠抗p50多克隆抗体(ZJ15002)、兔抗pl25多克隆抗体(ZJR12501)、兔抗p68多克隆抗体(ZJR6803)、兔抗P12多克隆抗体(ZJR1204)，以及高度纯化的DNA聚合酶S四亚基蛋白复合(r-pol S)物均为江苏大学生命科学研究院制备并保存(Zhou et al., Plos one, 2011，6: e22224)。抗人PCNA鼠单克隆抗体PC-10和抗3 -actin抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。
[0023]说明:以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照试剂盒或相关产品说明书进行。
[0024]实施例一:用钙离子载体A23187或多西紫杉醇与顺钼联合处理诱导宫颈癌HeLa细胞的凋亡
HeLa细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基于含5% 二氧化碳培养箱中37°C培养，以
0.25%浓度的胰蛋白酶消化传代。传代后的细胞接种于24孔细胞培养板(GIBC0公司产品)，待细胞密度扩增到80-90%，分别以4 y M钙离子载体A23187，或以10 y M多西紫杉醇和8 u M顺钼联合处理细胞，在细胞处理后的0，12，24，26，48小时以Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡，以未经诱导剂处理的细胞作为阴性对照。在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸PS外翻，标记了荧光素FITC的钙依赖性磷脂结合蛋白Annexin V与PS高度亲和，在荧光显微镜下发出绿光，检测早期凋亡的发生。而碘化丙啶PI是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但能够透过凋亡中晚期和死细胞的细胞膜而使细胞核染红。按照说明书的操作要求，将经诱导剂处理后不同时间的细胞在荧光显微镜下观察，如图1A所示，经多西紫杉醇和顺钼联合处理的HeLa细胞在处理后12小时，即可观察到早期凋亡的细胞(绿色)，随着时间的推移，凋亡中晚期的细胞逐渐增多(红色)，特别是在诱导剂处理36小时以后，说明多西紫杉醇和顺钼联合处理能够有效诱导宫颈癌细胞HeLa的凋亡。而对于A23187处理后的细胞，如图1B所示，从处理后12小时起，即可观察到较多的处于中晚期凋亡的细胞，随着时间的推移，中晚期凋亡的细胞越来越多，说明4iiM的A23187处理即可有效诱导宫颈癌细胞HeLa的凋亡。
[0025]实施例二:钙离子载体A23187导致癌细胞Calpain通道的激活
按钙蛋白酶活性检测试剂盒使用说明，取I?2X106个经A23187处理后的HeLa细胞，测定经细胞处理后与图1B相对应的不同时间点的Calpain活性，以未经处理的细胞作为阴性对照。用试剂盒所提供的细胞抽提缓冲液处理细胞，提取胞质蛋白(cytosolicproteins),同时除去膜及溶解体蛋白酶(membrane and lysosome proteases),经 12000转/分钟的速度离心I分钟，将经测定蛋白浓度后的含胞质蛋白的上清与反应缓冲液及Calpain基质Ac-LLY-AFC在37°C避光反应I小时，然后在配备了 400 nm激发光滤器和505nm发射光滤器的荧光仪上进行荧光检测，计算相对荧光单位RFU，即:每个样品每毫克蛋白所测定的荧光单位。如图2A所示，Calpain以时间依赖的方式被激活，在24小时时达最高值，此时可能在反应体系中由于Calpain的基质量被消耗光,导致随后的Calpain活性呈饱和状态。以上实验表明，钙离子载体A23187能够有效激活Calpain通道，也就是说，A23187能够诱导癌细胞以Calpain通道激活的途径凋亡。
[0026]实施例三:依赖Calpain通道激活的癌细胞凋亡早中期，小亚基pl2被降解/随后恢复，而四亚基复合物在凋亡晚期崩塌
对应于实施例一和实施例二中的分析时间点，经A23187处理的大约2X IO6个HeLa细胞分别用等体积的细胞裂解液裂解细胞，其裂解液组成为:20毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)，pH 7.8, 10%甘油，0.5毫摩尔/升乙二醇双四乙酸(EGTA)，I毫摩尔/升乙二胺四乙酸(EDTA)，I毫摩尔/升氯化镁(MgCl2), 200毫摩尔/升氯化钠(NaCl)，0.1%乙基苯基聚乙二醇(NP-40), I毫摩尔/升苯甲基磺酉先(phenyImethylsulfonate), 2毫摩尔/升二巯基苏糖醇(DTT)，以及蛋白酶抑制剂。经裂解的细胞混合液以12000转/分钟离心5分钟，取上清进行SDS-PAGE电泳，将胶分离后的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，在各亚基相应位置用医用剪刀将膜剪成条，含各亚基的膜条用相对应的抗体进行免疫反应，即=Western Blot分析。未经A23187处理的细胞裂解液作为阴性对照，以高度纯化的DNA聚合酶Pol 6四亚基蛋白复合物作标准对照以监控抗各亚基抗体的灵敏度，以卢-actin作为内参。从图2B(上半图)中可看出，在癌细胞凋亡早中期，小亚基P12在A23187诱导后12小时被降解，随后又逐步回复至正常水平(24小时)。而在癌细胞凋亡晚期，大约36小时开始，pl2又逐步被降解，直到第48小时，pl2及另外三个亚基均被降解。
[0027]为了更清晰地了解pl2的降解/回复情况，A23187处理后的HeLa细胞被每隔4小时分析一次，如图2B(下半图)所示，pl2从A23187处理后的4小时即开始降解，直到第12小时被完全降解，然后又逐渐回复，到第16至24小时基本回复到正常水平。在癌细胞凋亡的早中期0-24小时的时间段，小亚基pl2在第12小时被完全降解，导致Pol 6由四聚体形式Pol 8 4转换为三聚体Pol 8 3以应对DNA损伤，Pol 8 3与其它DNA修复酶(如聚合酶n等)在DNA复制叉上发生酶交换，利用跨损伤修复机制修复受损的DNA，一旦跨损伤修复完成，Pol 6再一次与DNA修复酶在复制叉上发生酶交换(Lee et al.，Environ.Mol.Mutagen, 3 - 698)，通过 pl2 的回复，Pol S 3 又转换成四聚体 Pol 8 4的形式重新合成DNA(16-24小时)，但由于跨损伤修复所带入的DNA突变，如果少数癌细胞未被杀死，意味着化疗后“漏网”的癌细胞很容易复发和转移。而Pol 8四亚基复合物的崩塌意味着在细胞凋亡晚期，DNA复制叉完全崩塌，癌细胞彻底死亡。
[0028]因此，小亚基pl2在癌细胞凋亡早中期被降解/随后回复，以及在癌细胞凋亡晚期Pol S四亚基复合物完全崩塌，说明pl2/Pol S是依赖Calpain激活途径癌细胞凋亡的一个重要靶标。
[0029]实施例四:Calpain抑制剂ALLN有效抑制小亚基pl2降解
对应于实施例一和实施例二，在HeLa细胞A23187处理前预先进入10 y M的Calpain抑制剂ALLN，在细胞处理后的第12小时和第48小时分别采样同样的方法对各亚基的降解进行分析。ALLN能够有效抑制在诱导剂处理后第12小时(图2C，右图)和第48小时(图2C，左图)pl2的降解，但只能部分抑制其它三个亚基在48小时的降解(图2C，左图)，说明pl2是Calpain的一个核蛋白基质；而在癌细胞凋亡晚期其它三个亚基的降解可能还依赖独立于Calpain激活途径的另外未知降解机制。
[0030]实施例五:小亚基pl2及其它三亚基在caspase激活途径的癌细胞凋亡过程中不被降解
对应于实施例一，以10 ii M多西紫杉醇和8 ii M顺钼联合处理HeLa细胞，在相对应的时间点，按说明书要求，用Caspase-3活性检测试剂盒测定Caspase-3的活性,其结果如图3A所示,在0-24小时区间，Caspase-3被缓慢激活,而在24-48小时区间，Caspase-3活性急剧上升，但Calpain活性无任何被激活的迹象(图未被显示)，说明多西紫杉醇和顺钼联合处理，能够有效激活Caspase途径介导的癌细胞凋亡，但相对于各时间点Caspase-3的激活，Pol S各亚基均未发生降解的现象(图3B)。因此Pol S/P12作为一个重要靶标适用于依赖Calpain激活途径的癌细胞凋亡，但不适用于Caspase激活途径介导的癌细胞凋亡。同时，本实验也意味着用多西紫杉醇和顺钼作为肿瘤化疗药物，由于Pol 6的存在，参与多种DNA的修复，因此也增加了潜在的带有DNA突变细胞“逃逸”的几率，也即增加了化疗愈后肿瘤的复发和扩散的几率。
[0031]综上所述，本发明可以方便地用于抗肿瘤化疗药物药效筛选的新途径，特别适用于由Calpain激活途径介导的癌细胞凋亡，即将病人体内的肿瘤细胞取出体外培养，培养好以后在体外进行药理实验，用不同的药物来处理所培养的肿瘤细胞，如果某种药物能够诱导由Calpain激活途径介导的癌细胞凋亡，则以Pol S/p12为靶标(仅pl2亚基降解，意味着存在未被杀死的少量癌细胞，这些“漏网”的癌细胞可能会很快无序增殖、扩散和转移，只有当四个亚基均被降解，癌细胞才能被彻底杀死)，可以针对某种特定的肿瘤细胞进行化疗药效的快速评估。
【权利要求】
1.一种以DNA聚合酶8为靶标筛选化疗药物及药效的方法，按照下述步骤进行:
(1)介导癌细胞凋亡途径的确定:首先，在用细胞培养瓶体外培养的癌细胞培养基中添加待筛选的化疗药物，收集药物处理后不同时间的细胞，以细胞凋亡试剂盒检测并确定何种药物具有诱导癌细胞凋亡的功效，同时，确定发生癌细胞凋亡是由Caspase-3激活途径还是由Calpain激活途径所介导的；
(2)DNA聚合酶5在不同细胞凋亡途径中的行为变化:收集不同时间点、对应于步骤(I)中所处不同凋亡途径介导的癌细胞，裂解细胞，高速离心后取上清进行SDS-PAGE电泳并转膜，以分别抗DNA聚合酶5四种亚基的抗体进行Western blot分析，分别检测四种亚基pl25、p50、p68和pl2在不同凋亡途径中凋亡早期和凋亡晚期的特征变化，确定DNA聚合酶S是某种细胞凋亡途径的一个新靶标。
2.根据权利要求1所述的一种以DNA聚合酶8为靶标筛选化疗药物及药效的方法，其特征在于:其中步骤(2)中所述的DNA聚合酶8的4个亚基pl25、p68、p50和pl2相应的cDNA分别源自人源DNA聚合酶基因P0LD1、P0LD3、P0LD2和P0LD4。
3.根据权利要求1所述的一种以DNA聚合酶5为靶标筛选化疗药物及药效的方法，其特征在于:其中步骤(2)中所述的以DNA聚合酶8 /P12为靶标的免疫反应所用抗人源DNA聚合酶S四个亚基的抗体分别为:鼠抗p50多克隆抗体(ZJM5002)、兔抗pl25多克隆抗体(ZJR12501)、兔抗p68多克隆抗体(ZJR6803)、兔抗pl2多克隆抗体(ZJR1204)。
4.根据权利要求1所述的一种以DNA聚合酶5为靶标筛选化疗药物及药效的方法，其特征在于:其中步骤(I)中所述的诱导Calpain激活途径介导癌细胞凋亡的药物是外购的高选择性钙离子载体A23187。
5.根据权利要求1所述的一种以DNA聚合酶8为靶标筛选化疗药物及药效的方法，其特征在于:其中步骤(I)中所述的癌细胞为人宫颈癌HeLa细胞株HeLa_S3。
6.根据权利要求1所述的一种以DNA聚合酶8为靶标筛选化疗药物及药效的方法，其特征在于:其中步骤(I)中在确定由Calpain激活途径介导的肿瘤细胞凋亡所用试剂盒为商业化钙蛋白酶活性检测试剂盒。
【文档编号】G01N33/574GKSQ
【公开日】日
申请日期:日
优先权日:日
【发明者】张倩, 周亚竟, 樊晓婷, 陈慧卿, 陈焰
申请人:江苏大学