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P332病毒10~13
十、流行性感冒病毒(MDCK、m基因)
流感。甲乙丙ABC三型分别引起。
甲型流感病毒-流行形式，能世界性大流行。动物中广泛分布。
乙型-局部爆发，无动物证据。
丙型-散在形式、主要婴幼儿、不流行、猪也是天然宿主。
正黏病毒科。球形囊膜病毒、刚分离到-常见丝状体-长达数μm，单股负链RNA、分节段。人甲流病毒HA基因不断点突变、HA蛋白抗原性不断漂移→不同程度流行。甲、乙、丙分型依据:粒核蛋白NP、膜蛋白MP的不同。甲流亚型分型依据:血凝素H(H1-16)、神经氨酸酶N(n1-9)
(二)病原分离方法
采取标本鼻咽拭子or含漱液、鼻咽抽吸液、低温24h运送or-70℃冻存。发病3天内
分离病毒鸡胚or细胞培养。病毒分离-诊断金标准。鸡胚:9~11日龄、尿囊腔or羊膜腔接种、双腔也可。细胞:MDCK狗肾细胞、“O”相特性-鸡红细胞不凝集、查HA活性用豚鼠or人"O"型细胞。
(三)特征性基因和抗原检测
可用基因编码M蛋白的m基因-流感特异基因。m基因、np基因、mp基因-不同型别ABC的检测→RT-PCR编码表面蛋白的HA、NA基因-不同亚型的鉴定→RT-PCR、电泳检测、基因芯片检测。
可用抗原NP抗原-流感阳性、HA & NA蛋白-确定亚型制备单克隆抗体→免疫标记方法:免疫荧光、免疫胶体金测定流感蛋白存在。
(四)免疫检测
特异性抗体只有抗HA的中和抗体含:IgG、IgM、SIgA。IgM抗体结果不够理想。IgG抗体-急性期&恢复期4倍↑确诊→抗原为H3N2、H1N1、乙型毒株。常用红细胞凝集抑制测定。
十一、狂犬病毒/恐水症(弹状病毒科、外形似子弹、跨膜糖蛋白GP、快速荧光灶抑制试验 RFFIT、固定毒CVS株、BHK21细胞系)
中枢神经系统感染疾病。犬、猫、野生食肉动物、食虫&吸血蝙蝠→咬、抓、舔→皮肤/黏膜破损处→神经末梢上行→中枢神经系统。急性、进行性、几乎不可逆转的脑脊髓炎、恐水、近似100%死亡。野生动物主要储存宿主、犬、猫、家畜→储存宿主&主要传染源。
弹状病毒科:①水疱性口炎病毒属、仅②狂犬病毒属威胁人类-典型种、③未定属-植物弹状病毒。
野毒/街毒--动物/病人中发现的
固定毒--传代后适应特定宿主
外形似子弹，一端半球形，一端扁平.单股负链RNA跨膜糖蛋白-GP，诱导中和抗体&刺激细胞免疫、是保护性抗原。GP是病毒与受体结合的结构&与毒力直接有关。
(二)病原分离方法
组织分离法or乳小白鼠分离法
细胞培养法分离病毒唾液、脑脊液、皮肤、脑组织→研磨后→PBS、MEM制成30%悬液→4℃ 2000 rpm 20 mins→取上清接种已单层敏感细胞(鼠神经传代细胞、Vero、BHK21)→2%血清维持液、37℃ 5%CO2孵育4~5 d→观察特异性荧光包涵体判断结果。
乳小白鼠接种法30%待检组织悬液→离心取上清→接种1~2日龄乳鼠脑内→负压饲养柜→可取脑继续传代→无菌取脑、-70℃/50%甘油PBS-20℃保存/研磨后脱脂牛奶-20%悬液，真空冷冻干燥长期保存。
(三)特征性基因与抗原检测
核蛋白N基因相对保守。RT-PCR、巢式PCR、Realtime-PCR
(四)抗体检测
不形成病毒血症，无免疫应答反应。晚期血脑屏障破坏、刺激免疫系统大量特异性抗体。抗体检测对临床诊断意义不大，只在临床晚期出现。免疫后血清中和抗体水平(评判指标)≥0.5 IU/ml有效保护--WHO。
小鼠中和试验-传统
快速荧光灶抑制试验 RFFIT (WHO推荐)倍比稀释灭活血清，病毒-标准固定毒CVS株、细胞-BHK21→荧光显微镜看结果→和阴性血清组荧光灶比较→荧光灶抑制≥50%的血清最高稀释倍数→为中和抗体滴度
十二、腮腺炎病毒
流行性腮腺炎病毒MuV、急性呼吸道传染病。好发 儿童&青少年，无力、食欲减退、一侧or双侧腮腺肿胀、疼痛发热。并发症:脑膜炎脑炎、睾丸炎、附睾炎、卵巢炎、胰腺炎、心肌炎潜伏期1~3 weeks，排毒期:发病前后 1周。疫苗接种预防MV感染唯一手段。
副黏病毒科副黏病毒属、单链负链RNA、仅1个血清型具有血凝、血溶2种活性。
凝集鸡、豚鼠(其他啮齿类不凝)、人血红细胞，4℃(好)&37℃
血溶:高浓度病毒、仅37℃
脂溶剂敏感、紫外线、加热可灭活2℃ 保存3个月、-60℃ 1年↑
(二)病原分离方法
BSC-1、Vero(常用)、MDBK、Hela、KB、WI-38均可。细胞病变表现为细胞聚集&退化性病变，有时产生融合细胞&嗜酸性包涵体。感染细胞能吸附豚鼠红细胞。成年啮齿类动物对病毒不敏感。发病早期→采集唾液、尿、脑脊髓液→接种鸡胚羊膜腔、卵黄囊、传代细胞→取羊水:血红细胞吸附试验、血凝和补体结合实验or观察细胞病变(多核细胞、细胞融合、胞浆内嗜酸性包涵体)
(三)特征性基因与抗原检测
唾液、尿、脑脊髓液→RT-PCR、核酸测序。SH基因--分型依据、因为变异程度最大。
融合蛋白F--细胞融合现象主要因子。血凝素-神经氨酸酶HN--免疫原性蛋白(HN蛋白的抗体可中和病毒感染→进行被动免疫)。HN蛋白→最主要的V抗原--病毒颗粒抗原。可溶性抗原--S抗原→NP蛋白。
(四)抗体检测
血清→补体结合实验、ELISA。急性期IgM抗体+(1个月内未接种)or IgG抗体4倍↑--确诊
十三、风疹病毒(丙类、CRS、E1蛋白、E1基因)
急性呼吸道传染病、丙类人-唯一宿主。发热、麻疹样皮疹、耳后&枕下淋巴结肿大。成人症状较重:关节炎、血小板减少性紫癜、个别疹后脑炎、脑脊髓膜炎。容易垂直感染:流产、死胎、先天性风疹综合征（CRS）部分风疹病毒隐形感染者--传染源。
披膜病毒科风疹病毒属--唯一成员、单正链RNA只有1个血清型，2个基因组、共10个基因型(1A~1G、2A~2C)不耐热、56℃ 30 mins灭活、脂溶剂敏感、甲醛、环氧乙烷、紫外线。4℃不稳定、-70~-60℃稳定。
(二)病原分离方法
咽拭子& CRS患者脑脊液、泪液、分泌液、损伤组织。疹前4~5d、疹后1~3d；CRS发病后数月内。Vero、RK-13兔肾细胞、BHK-21地鼠肾，无明显CPE。病毒标本or盲传细胞→提取核酸→核素标记探针进行分子杂交、RT-PCR→诊断病毒。
(三)特征性基因与抗原检测
E1蛋白→中和抗原决定簇&凝血活性。E1基因的739个核苷酸→WHO鉴定型别最少序列。
(四)抗体检测
IgM抗体↑持续1个月左右，CRS可达半年。IgG抗体可达数年~数十年，育龄妇女阳性率76%~98%。免疫学方法对胎儿早期感染不能诊断，从胎儿组织中检测出病毒基因是诊断“胎儿风疹病毒感染”的主要依据。孕妇感染早期诊断:
IgM抗体+、近期感染
胎儿绒毛膜中风疹特异性抗原
羊水or绒毛尿囊膜→核酸分子杂交or PCR检测\羊水or绒毛膜→病毒分离鉴定&|&&|&&|&&|&
腺病毒包装
技术服务信息
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腺病毒包装纯化实验
摘要： 利用AdMax系统在HEK293细胞中获取表达Oct-4-EGFP- 3FLAG的重组腺病毒，经扩增、纯化、检测后留待后续功能学研究。
关键词：AdMax， Oct-4， EGFP，重组腺病毒
一、&实验原理
腺病毒是一种无包膜病毒，直径在70～90nm。病毒颗粒由252个壳粒呈二十面体排列组成，每个壳粒的直径约为7～9nm。位于衣壳中的基因组是线状双链DNA，长度约为36 kb，两端各有长约100 bp的反向重复序列。腺病毒在自然界分布十分广泛，在很多哺乳动物和禽类中都有发现，其对上皮细胞，角膜和消化道上皮细胞具有一种天然的侵嗜性。现已发现的51种人腺病毒，根据组织嗜性不同被分成ABCDEF六个不同亚群，其中C亚群的第2和第5血清型最常被用于构建腺病毒载体(见下表)。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&人类腺病毒血清型分类
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&& &
腺病毒的双链DNA基因组分为编码区和非编码区。根据DNA复制周期的不同，编码区又分为早期基因区和晚期基因区。前者又细分为E1～E4四个区，主要负责编码调节蛋白；而后者分为L1～L5五个区，负责编码结构蛋白。腺病毒基因组中早期表达的调节蛋白可以调控晚期基因的表达，其中最先表达的是E1区基因，它所表达的蛋白(包括E2产物) 是腺病毒基因组复制、病毒包装和其他蛋白表达所必需的。在非编码区，腺病毒双侧末端各含有一小段约100bp的末端反向重复序列(ITR)。ITR含有病毒进行复制和包装所必需的顺式作用元件及DNA复制起始点，它是病毒DNA复制所必需的，其内侧包含病毒包装信号(&)。
腺病毒作为一种病毒载体具有以下优点：（1）宿主范围广， 对人致病性低；（2）基因组信息完全清楚，易于操作，可以插入大片段的外源基因；（3）容易获得较高滴度；（4）不与基因组整合，瞬间表达，安全性较高；（5）可以感染多种人类细胞，（包括分裂期和非分裂期细胞）；目前较为成熟的载体系统有非复制型（如AdMax）和复制型（又叫溶瘤腺病毒）两种。
AdMax包装系统是由加拿大microbix公司经销，广泛被科研用户使用的腺病毒载体系统。它的工作原理是，利用Cre/loxP（或FLP/frt）重组酶将携带外源基因的穿梭质粒与骨架质粒在HEK293细胞中实现重组，产生腺病毒 （见AdmaxTM重组腺病毒流程图）。该系统具有操作简便、重组效率高、病毒产率高、目的基因表达水平高等优点，同时mCMV启动子较hCMV启动子的启动效率也要高出若干倍。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& AdmaxTM 重组腺病毒流程图
关于AdMax腺病毒包装系统的详情，请登陆网站：
二、&实验目的
获取足够纯度和滴度的重组腺病毒Adeno-Oct-4-EGFP-3FLAG。
三、&实验步骤
将目的穿梭质粒pAdeno-mCMV-Oct-4-EGFP-3FLAG与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒Adeno-Oct-4-EGFP-3FLAG，经大量扩增后纯化，检测滴度和目的基因表达水平后备用。实验步骤如下：
1.&病毒包装与鉴定：
1)&转染前一天，将细胞接种到6孔板中，控制细胞转染时的密度为70-80%。
2)&转染前一小时取出细胞培养板，去除原有细胞培养基，加入1.5ml的Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱。
3)&制备转染试剂和质粒的复合物：
a)&将待转染的病毒载体质粒4&g（骨架质粒：穿梭质粒=1:1）溶于Opti-MEM培养基，总体积为250 &l，轻轻混匀。
b)&将和元生物腺病毒包装转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为250 &l，轻轻混匀。
c)&将和元生物腺病毒包装转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
d)&取出细胞培养板，将上面配好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中，做好标记，放回培养箱。
e)&6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入2ml新鲜完全培养基培养。
f)&每三天换液一次，大概7-15天左右出现病毒空斑，待完全病变后收集上清液。
2.&病毒大量扩增与纯化：
将HEK293细胞铺于30-40个10cm dish，待细胞长至70-80%，每块板加入合适滴度的病毒（约107-108PFU/ml）10 &l，感染细胞，待细胞全部病变后（2-3天），每块板中加入约500 &l 10% Nonidet P 40（NP40）以裂解细胞。收集细胞裂解物，12000 rpm离心10 min，弃细胞碎片收集上清。每100ml上清加入50 ml病毒沉淀液（20% PEGM NaCl），冰上放置1h以沉淀病毒。12000 rpm离心上述混合物20min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml 密度为1.10g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20 mM Tris-HCl，pH 8.0）4℃ 7000rpm离心5min，收集病毒悬浮液。
在超速离心管中加入2.0 ml的1.40g/ml CsCl 溶液（溶剂同上）。再加入3.0 ml 1.30 g/ml 的CsCl 溶液。最后加入5 ml的病毒悬浮液。22800 rpm，4℃离心2.5h。收集密度在1.30-1.40g/ml 之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10 mM 的EDTA Na2煮沸10 min)。在透析缓冲液（50g蔗糖，10ml 1M pH为8.0的Tris-HCl液，2ml 1M MgCl2溶液定容至1000ml）中，4℃透析过夜，中间更换透析液一次。收集病毒，于-80℃保存。
三种密度的CsCl溶液配制如下（溶于灭菌20 mM Tris，pH8.0），4℃保存。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& CsCl溶液配制
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&
3.&病毒滴定测定：
1)&选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成5.0&105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，
37℃、5%CO2培养。
2)&准备好10倍梯度稀释的病毒样品，然后依次将10-5至10-8稀释的病毒液加入24孔板中，每孔加入100&l。
3)&37℃、5%CO2感染48h。轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇500&l，-20℃固定20min。
4)&使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
5)&加入200&l 1%BSA 37℃封闭1h。
6)&加入200&l的一抗溶液至每个孔中，37℃孵育1h。
7)&使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
8)&加入200&l的二抗至每孔，37℃孵育1h。
9)&使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
10)&加入200&l新配置的工作液至每孔，室温孵育5-10min。
11)&弃工作液，使用PBS清洗2次，每孔每次加入1ml PBS。
12)&每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10&物镜下计算阳性细胞个数。
13)&计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度。
4.&目的基因表达检测：
腺病毒感染工具细胞-293T，WB检测病毒表达情况（24孔板为例）。
第一天：细胞准备：
将长势良好的293T细胞接种到24孔板，消化好细胞后把细胞浓度调为1&105个/ml，按500&l/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30-50%之间。
第二天：病毒感染：
感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加。病毒液10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1。每个MOI值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，终浓度为5&g/ml。中间每隔15-20min摇晃一次培养板，增加感染效果。感染过程尽量使用无血清培养基。感染293T细胞无需Polybrene，无需无血清处理，直接按照MOI=1-10感染。
第二天：换液：
感染实验同一天，1.5-2h后（中间每半小时均匀摇晃一次，增加感染效率），弃去上清，换5%血清的培养基，500&l/孔。
(注：某些特殊细胞需要更换一半病毒液后，过夜，具体请咨询公司技术支持信箱：)
第三天：观察荧光表达情况：
在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计腺病毒感染目的细胞的效率。对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟一天观察的时间，以保持细胞良好的生长状态。通过细胞感染的效果，确认目的细胞的感染MOI。对于因目的基因较大，载体无法携带标记基因的，细胞感染腺病毒后大约48h后蛋白表达达到峰值。注：通常未知细胞感染腺病毒的最佳MOI值，需要首先选择96孔板进行摸索，后续放大的原则是保持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。即使这样，放大实验时由于体系的改变，加上预实验的MOI值设置跨度大小，需要对MOI的再次优化。MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值
&&&&&&&&&&&
*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。
*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理。
293T感染24h-48h均可以收集样品进行WB检测
四、&实验结果
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 包装荧光拍照质控结果
&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&转染后第9天时观察，HEK293细胞大量飘落，细胞已经完全病变。
Adeno-Oct-4-EGFP滴度结果：
&&& 本次实验在显微镜下５个视野中计算的阳性细胞平均数为8，此孔病毒稀释了107倍，根据以上公式得出：病毒滴度=8&79&107/0.1=6.32&1010（Ifu/ml）
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&& 滴度结果图片
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &
&&& 备注：照片所拍摄的视野通常小于显微镜下观察的视野，因此需要在显微镜视野下计算阳性细胞的个数。
如没有检测滴度的试剂，可以直接检测腺病毒VP数，作为参考值，方法如下：
1.&要用Virus lysis buffer裂解腺病毒，取6&l病毒加入54&l Virus lysis buffer，第三次透析液为空白对照，做好标记。
2.&水浴裂解，56℃，10min。
3.&测dsDNA，OD260，首先用空白对照调零，然后放入样本读数，若在0.1-1.0之间，则可以准确反映病毒浓度，否则需要稀释或加浓。
4.&计算腺病毒浓度：病毒滴度=OD260&稀释倍数&1.1&1012（VP/ml）。
注：通常该方法检测的滴度值较PFU数值，偏高2个数量级，请参考。
5.&293T感染24h-48h均可以收集样品进行WB检测。
腺病毒常见问题：
关于腺病毒滴度单位：
1.&VP测定法（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）：
测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1&1012个病毒颗粒。这种方法只能检测病毒的总颗粒数，而不能确定其中有感染活性的病毒颗粒。
2.&GTU测定法（基因转移单位）：&
GTU测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定。
3.&PFU测定法（空斑形成单位）：&
PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复。
4.&关于腺病毒保存和稀释方法：
若病毒量需长期保存，必须在-80℃保存，特别是纯化之后。在最佳的缓冲液（10mM Tris HCl pH 8.0，2 mM MgCl2，4% Sucrose）病毒会稳定1-2年，通常超过6个月后，应该重新检测滴度。病毒使用切记反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融导致病毒滴度降低10%左右。普通稀释液保存，每次冻融滴度损失会近一半。在DMEM中用血清保存的方式与纯化颗粒一致，但由于血清保护通常比在缓冲液中更加稳定。可以在DMEM中用血清在4℃存储病毒一周以上而不需要反复冻融。
5.&腺病毒在整体动物水平的使用：
体内试验的腺病毒，建议使用纯化过的病毒。因为小扩病毒中含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。腺病毒用量范围在108-9PFU/只小鼠，每隔一天注射一次，共注射4次。小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1&1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50测到：1&1012v.p./只给药，未发现小鼠死亡。
由于腺病毒在整体动物实验的复杂性和多样性，请直接将您的问题和建议与我们的动物工程师讨论，和元生物动物实验中心的腺病毒技术工程师也愿意与您分享他们在这一领域的经验，热线电话400-技术支持电子邮件。
五、&参考文献
1.&Bewig, B., W. E. Schmidt (2000) Accelerated titering of adenoviruses. BioTechniques 28:870-873.
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