离子色谱法检测解磷微生物发酵液中有机酸的方法研究--《中国毒理学会环境与生态毒理学专业委员会第二届学术研讨会暨中国环境科学学会环境标准与基准专业委员会2011年学术研讨会会议论文集》2011年
离子色谱法检测解磷微生物发酵液中有机酸的方法研究
【摘要】：提出了采用高效离子交换色谱的方法测定不同时期的解磷菌发酵液中苹果酸等小分子有机酸的方法。在所选色谱条件下,有机酸浓度和峰高呈现良好线性关系,线性相关系数在0.996以上。各有机酸相对标准偏差在1.07%-1.81%,精密度良好。发酵液样品中几种酸的平均回收率在95.76%-110.13%之间。在发酵过程中5种有机酸的总量呈先上升后趋于平缓的趋势,发酵第12d的时候总量最高,达609.03mg/L。该方法是用于定性和定量测定解磷菌发酵液中常见小分子有机酸的快速、有效方法。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：TQ921【正文快照】：
日前，解无机磷微生物广泛应用于磷矿粉溶解及土壤固定态磷释放等领域。通常微生物解无机磷存在多种机制，多数研究者认为，其转化机理主要靠分泌有机酸溶解难溶性磷，因此，了解无机磷微生物分泌有机酸的强度对于评价其解磷能力具有十分重要的意义。由于有机酸的来源不同，
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细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析
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3秒自动关闭窗口为寻找高效分解纤维素的真菌资源，从新疆不同地区采集到土样45份。以纤维素为唯一碳源对土壤样品进行初筛，得到40株能够分解利用纤维素的真菌菌株。将上述菌株在产酶培养基中培养，测定培养液上清中纤维素酶的活性，筛选出9个纤维素酶活性高的菌株。其中编号为X20-2的菌株分泌的纤维素酶和β-葡萄糖苷酶活力最高。
　　通过形态观察和分子系统学方法，对菌株X20-2进行鉴定。以菌株基因组DNA为模板，根据啤酒酵母RDNA保守区域设计引物，扩增出该菌株18SRDNA全长1785BP和5.8SRDNA137BP，通过与GENBANK中的已知序列进行同源性比较，发现与葡萄穗霉属(STACHYBOTRYS)相关菌株上述序列同源性分别在99％和100％，而两个ITS区(共468BP)与已知菌株的同源性只有92％；采用黑光灯照射诱导菌株产孢，结合菌体形态特征，观察分生孢子与孢子梗的形态，确定菌株X20-2为葡萄穗霉。毒理实验证明，该菌株培养液中不含毒素，可以进行安全的产酶培养。
　　通过单次单因子实验对菌株产生β-葡萄糖苷酶的条件进行优化，确定麦麸为产酶培养基的最适碳源。经过优化培养，β-葡萄糖苷酶活力从最初的4.9U/ML提高到9.37U/ML。测定粗酶对葡萄糖的耐受性，发现当葡萄糖浓度在10G/L时，该β-葡萄糖苷酶仍可保持原总酶活的28％。
　　粗酶液经硫酸铵沉淀和DEAE-52、HITRAP_DEAE_FF柱层析及MONOQ强阴离子层析柱纯化，获得X20-2菌株的β-葡萄糖苷酶，酶蛋白在SDS-PAGE中显示一条带，其分子量约为100KDA。其比活力达到29903.45U/MG，比粗酶液提高了143.5倍。酶学性质分析表明，该酶反应的最适温度为60℃，最适PH为5.6，并在60℃以内及碱性条件下稳定。AG+、CU2+、ZN2+和FE3+对该酶有不同程度的抑制作用。
枯草芽孢杆菌可将水体中有机物分解为小分子的有机酸、氨基酸等物质，因此，它是水产养殖系统中最有效的水质净化菌种之一。本文首先建立了枯草芽孢杆菌的pcr快速鉴定方法，然后对海南岛不同地理来源的多种海水水体开展了枯草芽孢杆菌的分离、纯化和鉴定以及对各菌株进行了rapd分型的工作，同时研究了不同遗传型菌株的水质改良效果，具体结果如下：
1、以枯草芽孢杆菌的gyrb基因设计了2对特异性引物，分别为f1、f2。以标准的枯草芽孢杆菌做pcr检测，结果表明，f1和f2能获得分子量分别为387bp和362bp的目的条带。利用其它12株非枯草芽孢杆菌进行pcr特异性检测，结果表明引物对f1和f2的特异性较强，从而首次成功建立了枯草芽孢杆菌的pcr快速鉴定方法。
2、本文首次以海南岛多个地理来源的不同水体为菌种分离对象，结合传统的生化鉴定手段，采用选择性培养基和本文建立的pcr快速检测方法共分离、纯化和鉴定了45株枯草芽孢杆菌菌株，这些菌株的主要来源地为海口、文昌、万宁、陵水、乐东、东方、三亚，分别分离得到17株、1株、19株、3株、1株、4株和1株。
3、利用rapd分子标记技术对46株(包括枯草芽孢杆菌标准株ctccab90008)枯草芽孢杆菌进行了分子分型。为了提高rapd技术稳定性和可重复性，本文首先优化了模板dna浓度、dntps浓度、mg2+浓度、引物浓度、taqdna聚合酶浓度以及退火温度和时间、延伸时间、循环次数等rapd技术的主要影响因素，最终建立了适用于枯草芽孢杆菌的最佳rapd反应体系，即在25μl的总体系中，包括10×pcrbuffer2.5μl，mg2+(25mmol/l)为2μl，dntps(2.5mmol/l)为2μl，引物(10μmol/l)为1μl，dna聚合酶1.0u，dna模板2.0μl；循环参数为：94℃预变性4min，94℃变性45s、38℃退火45s、72℃延伸1。5min，共40个循环，72℃延伸7min。通过对60条rapd随机引物的筛选，共获得11条对该菌扩增效果稳定、多态性丰富的随机引物，选用上述11条引物对46个菌株基因组dna进行pcr扩增，结果表明，这46株枯草芽孢杆菌具有丰富的遗传多样性，共产生了1802条扩增条带，这些条带呈100％的多态性，即这些引物都能单独使这46株菌株产生特异性的指纹图谱，因此，本文为上述枯草芽孢杆菌菌株建立了一种极有效分子鉴定方法。根据upgma方法建立了所有菌株的系统进化树，结果表明，在遗传距离大约为0.53的位置，可以将46个菌株分成14个基因型，分别为a～o型、，其中大多数的菌株集中在第k型和第l型，且绝大多数相同地理来源的菌株具有更近的亲缘关系。
4、根据rapd技术的分型结果，本文从14个遗传型中分别随机选取1株枯草芽孢杆菌进行水质改良效果研究，测定的水质因子有水体cod、氨氮和ph，结果表明，菌株wc07001和菌株wl07003的水质改良效果明显，且菌株wc07001对氨氮的降解作用最佳，而菌株wl07003则对cod的降解作用最佳，这表明不同枯草芽孢杆菌菌株可能对水质作用效果不一，因此，在实际应用中，枯草芽孢杆菌应以不同的菌株组合成复合菌方能达到最佳的水质改良效果。
从三种不同土壤中分离和纯化得到10个石油降解细菌菌株,菌株编号为eva5,eva6,eva7,eva8,eva9, eva10,eva11,eva12,eva13,eva14.分离菌株均为好氧、革兰氏阴性、不形成芽孢的杆菌.根据biomé rieuxvitek微生物鉴定系统得出的表型特性,可将分离菌株eva5,eva6,eva7,eva8和eva9鉴定为铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa).eva10,eva11,eva12,和eva13与醋酸钙-鲍曼复合不动杆菌(acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex)的相似值分别为99﹪,99﹪,99﹪,95﹪:eva14与acinetobacter lwoffii/junii的相似值为97﹪.利用pcr扩增和测序获得10个石油降解菌株部分长度的16srdna序列.利用pcr扩增和测序获得10个石油降解菌株its序列.该研究为国内首次利用16srdna序列分析不同分类单位的污染物降解细菌的系统发育地位及其生物多样性,并利用16srdna和its序列在分子水平揭示相近菌株的差异.
本试验从常州农药厂排污口所采的土壤样品中分离得到了一株生长快，菌落规则，传代稳定，
　　降解能力较高的细菌菌株，并对其进行了生化、分子生物学基础研究，结果如下：
　　1.分离到的4-D菌株，根据BIOLOG试验和16SRDNA序列分析，初步鉴定为：ACINETOBACTERSP.
　　(不动杆菌)，该菌株在农药降解和微生物修复方面还未见正式报道。
　　2.初步分离纯化了高效氯氰菊酯降解酶，并对其酶学性质做了研究。
　　3.构建了4-D菌株基因组文库，筛选到1株对高效氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯表现出良好的降
　　解活性的重组菌株，提取重组质粒进行酶切鉴定，结果发现：插入的外源片段约5KB。对外源片
　　段进行测序，将所得的部分序列登陆WWW.NCBI.NLM.NLH.GOV网站进行比对分析。该基因片段与
　　RHS家族蛋白编码基因同源性达到59％。但RHS家族蛋白是否与拟除虫菊酯农药的降解有关有待
　　于更进一步的分析研究。
漆酶(LACCASE，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，在环境污染物的降解与脱毒、
纸浆的生物制造与漂白、染料的脱色与脱毒、木质素及其衍生物的降解与转化以及食品
性状的改良等领域具有广阔的应用价值和潜力。本论文从自然界筛选到一株产漆酶的白
腐菌，并对其进行了鉴定，研究了其发酵条件、产酶机理、酶的分离纯化和性质以及在
染料脱色和降解中的作用，主要结果如下所示：
利用平板显色特征和产漆酶能力测定，筛选到一株产漆酶的白腐菌株SYBC-L1，
经形态学和分子生物学鉴定，确认该菌株属于担子菌纲、多孔菌科、密孔菌属、血红密
孔菌，命名为血红密孔菌PYCNOPORUS SANGUINEUS SYBC-L1。其18S和5.8S RDNA的
GENBANK登录号分别为EU888830和EU888831。
对P.SANGUINEUS SYBC-L1的液态发酵产漆酶条件进行了优化，利用一些工农业副产
物，如麸皮和豆粕作碳氮源，首先通过单因素法初步优化了其发酵培养基和培养条件，
再经过响应面设计法对培养基组分进一步优化，得到的优化培养基为：葡萄糖50G/L，
麸皮52.5G/L，豆粕L5G/L，NH4H2PO4 1.0G/L，CUSO4·5H2O 2.0 MMOL/L，KH2PO40.5
MMOL/L，NACL 17 MMOL/L，阿魏酸26.1μMOL/L，初始PH 4.0。优化后菌株的漆酶产量为
61.25 U/ML，为优化前基础培养基的87倍。根据其发酵过程数据分别建立了菌体生长、
漆酶合成和底物消耗动力学模型。在此基础上进行7 L发酵罐扩大培养，第10 D漆酶产
量为55 U/ML。
对P.SANGUINEUS SYBC-L1在环境污染物——水葫芦的综合利用方面进行了研究，以
水葫芦为固态发酵基质，采用响应面法优化了P.SANGUINEUS SYBC-L1的固态发酵产漆酶
条件。优化后的培养基为：水葫芦25.1％，木屑13.9％，CUSO4·5H2O 1.5 MMOL/L，没
食子酸40μMOL/L，起始含水量65％，初始PH 6.0。菌株优化后的漆酶活力为32.02 U/G
干基，约为优化前的4.5倍。这种发酵方法不仅提高了水葫芦的综合利用价值，而且有
利于水葫芦生物质的进一步利用。
对P.SANGUINEUS SYBC-L1在漆酶发酵过程中的生理特性进行了研究，发现菌体在漆
酶高产时氧化水平提高，丙二醛、H2O2、抗坏血酸含量以及SOD、CAT活力明显上升，
这表明菌体在漆酶合成时受到了一定的氧化胁迫作用。采用FENTON试剂对P.SANGUINEUS
SYBC-L1发酵产漆酶进行氧化胁迫试验，结果显示H2O2∶FE2+比例为10∶1时可明显促
进漆酶的产生，推测漆酶的产生可能与活性氧诱导的基因表达有关。
经过硫酸铵分级盐析、DEAE-CELLULOSE阴离子交换层析和SEPHADEX G-100分子筛层
析，分离纯化得到2个漆酶同工酶LACⅠ和LACⅡ，SDS-PAGE显示均为单体蛋白，分子
量分别为58.89和63.07 KDA，糖含量分别为36.92％和13.58％，且二者在330 NM处均
有特征吸收峰。LACⅠ和LACⅡ的最适反应PH值位于酸性范围，反应温度较宽，高温和
低温条件均具有较好的催化活性，且酸碱稳定性和热稳定性良好。SDS、NAN3、β-巯基
乙醇和KI对LACⅠ和LACⅡ具有抑制作用，而EDTA、NA+和低浓度的CU2+、MG2+及ZN2+
稍有促进作用。LACⅠ和LACⅡ的催化底物广泛，ABT8是其最适宜的底物。以ABTS为
底物时，KM值分别为0.5 MMOL/L，KCAT/KM值分别为19,640.36和31，172.64
S-1·MM-1。经UPLC/MS/MS鉴定及氨基酸序列分析，LACⅠ和LACⅡ均属于密孔菌属漆酶。
对P.SANGUINEUS SYBC-L1漆酶在工业染料的脱色和降解方面进行了研究，结果显示
蒽醌类染料是漆酶的反应底物，可直接被漆酶降解，偶氮类染料在漆酶介体存在的情况
下可被降解。小分子介体的添加有助于提高染料的脱色效率，RBBR、酸性红1和活性
黑5在添加丁香醛连氮后，反应20 MIN，脱色率分别为94.91％、90.87％和72.15％；酸
性蓝129和活性蓝4在HBT介体存在的情况下脱色60 MIN，其脱色率分别为81.73％和
92.18％。利用高效液相色谱对染料降解后的产物进行分析，发现有降解中间产物生成，
并且经过植物毒理试验表明，这些降解物的毒性大大降低，对小麦发芽率完全没有抑制，
仅对胚芽和根芽的长度稍有影响。
关键词：漆酶；发酵优化；氧化胁迫；纯化；应用；血红密孔菌
本文通过选择性富集培养，从长期被卤代脂肪烃污染的废水和活性污泥中分离纯化二氯甲烷高效降解菌，并对所分离菌株进行生化鉴定以及16srdna系统发育研究，进一步开展了降解特性、关键酶基因克隆与表达方面的研究，以期为探索微生物对异型生物质（xenobiotics）的转化与降解机理、典型有机污染物的生物处理、污染环境的生物修复提供创新的技术支持与方法论指导。
本研究获得的主要结论如下：
1.从废水和活性污泥中分离筛选得到2株二氯甲烷降解菌株，分别命名为wz-12和wh22菌株。通过细菌形态学观察、生理生化测试、抗生素抗性试验、碳源利用试验（biolog）、全细胞脂肪酸分析、g+cmol％含量分析以及16srdna序列同源性分析，证明wz-12和wh22菌株应分别属于芽孢杆菌属及梭杆菌属。其中wz-12菌株被鉴定为环状芽孢杆菌（bacilluscirculans）的又一菌株；推测菌株wh22应当是梭形杆菌（lysinibacillussphaericus）的又一菌株，首次发现了环状芽孢杆菌菌株和梭形杆菌菌株具有二氯甲烷降解活性。
2.wz-12和wh22两株菌都有较宽的温度、ph及二氯甲烷底物浓度适应范围。在菌体生长最适的ph环境中，菌株对二氯甲烷的降解效率也最高；在30℃、初始ph6.0的mm培养基中，wz-12菌株72h对二氯甲烷的降解效率达85.23％。而wh22菌株在37℃、初始ph6.0的mm培养基中48h的降解效率约80.09％。有机物的加入可使降解菌wz-12对二氯甲烷的降解加速，其中酵母膏及葡萄糖效果优于蛋白胨。有机物的加入对wh22菌株的降解能力影响不大；wz-12和wh22菌株会因二氯甲烷浓度增加而产生抑制，降解率下降，符合非线性的高姆比兹模型。菌株wz-12能适应高盐浓度生长，nacl浓度在10～60gl-1范围生长良好，对ch2cl2、ch2brcl、c2h2cl2和c2h4cl2均有降解能力，72h降解效率分别为78.28％、58.19％、60.32％和45.08％。
3.菌株wh22含有1个降解性质粒，分子量为48.8kb，命名为prc11。初步建立了质粒prc11的物理图谱。该质粒还是一个汞盐抗性质粒，可在不同种属菌株之间转移，以e.colidh5（dcm-）作为受体菌做质粒的接合转移试验，阳性转化子的转化频率为1.65×105／μgofplasmiddna。
4.通过设计基于二次多项式数学模型，对试验结果进行多元回归分析，得到了如下适用于dcm降解率预测的经验关联式回归模型：
y=75.13+0.51x1+23.47x2+1.51x3-0.38x1x2+0.29x1x3-11.42x2x3-0.088x12-0.063x22-21.25x32采用响应面分析法，在摇瓶水平上，得到了菌株wz-12生物降解工艺的最优条件为：dcm初始浓度380mg／l（x1）、葡萄糖添加浓度13.72mg／l（x2）、h2o2添加浓度115mg／l（x3）。在此条件下，预测得到的最大降解率为93.18％。对以上获得的最佳工艺参数进行摇床水平上的降解率试验验证，得到好氧降解率平均值为92.88±0.27％，与模型预测值（93.18％）吻合较好，该降解率回归模型为菌株wz-12在生物法处理含dcm废气的应用有一定的指导意义。
5.对来自菌株wz-12的脱卤素酶进行了分离纯化和酶学性质研究，获得二氯甲烷脱卤素酶，纯酶分子量为31kda，比酶活提高了8.27倍，得率为34.83％，纯化倍数为8.27。该酶为诱导酶，最佳产酶温度为30℃，粗酶液在50℃以下具备一定的耐热性能和稳定性，最佳产酶ph为6.5；该酶在ph5～7之间稳定较好，但当ph大于7或小于5时，稳定性急剧下降。ca2+、mg2+对酶活有增强作用，而cu2+、zn2+和ba2+则抑制酶活性，hg2+对酶活性抑制影响最大。
该脱卤素酶表观km值在30℃（ph7.0）为5.25×10-3mol／l，vmax为3.67×10-4mol／l·min，kcat为6.97×104s-1。该酶的底物特异性不高，可以催化ch2cl2、ch2br2、ch2i2和ch2brcl脱卤。
6.从菌株wz-12中克隆得到二氯甲烷脱卤素酶基因dcmr，并对克隆产物进行了southern杂交鉴定。dcmr编码基因序列为864bp，编码脱卤素酶蛋白大小为288个氨基酸残基，预测分子量32±1kda。blast比对结果显示，克隆的基因片段与methylobacteriumsp.dm4的二氯甲烷脱卤酶基因序列同源性达98.6％。蛋白的氨基末端约20-80aa与gst有类似的结构域，中间约第50位-80位aa间具有多个跟gsh的结合位点有关的超二级结构模体结构域。将所得到的菌株相关基因序列用sequin软件上传至genbank，得到序列登录号fj405230。
7.通过构建具t7强启动子的pet高效表达载体（pet21a和pet15b），转化e.coli（de3）rp，构建了二氯甲烷脱卤酶的原核表达系统。构建了3种表达载体，pet-21a-dcmr（no-tag）不含任何标签，其转化子的二氯甲烷脱卤素酶酶活（21.95u·ml-1）高于原始菌株wz-12（14.26u·ml-1），可直接用于二氯甲烷生物降解的工程应用研究；pet-21a-dcmrwithhis-tag引入了6个组氨酸残基“标签”（his-tag），为后续酶蛋白分离纯化获得纯化酶的研究非常有意义；pet-15b-dcmrwithhis-tagandlvprgsthrombin在引入6个组氨酸残基“标签”（his-tag）的同时，增加了凝血酶酶切位点，方便了his-tag的切除。将3种原核表达载体转化e.coli（de3）rp并诱导表达，得到了具有酶活性的融合蛋白。
8.探讨重组酶的表达特点和部分酶学性质。重组菌经iptg诱导后，细菌总蛋白表达量为0.76g／l，其中融合蛋白占总蛋白的32.00％，酶活最高达25.78u/ml，酶的比活为88.86u/mg蛋白。重组菌周质中酶活2.92u／ml，胞内酶活22.86u／ml。重组菌产生的酶活力与比活较原降解菌株高1～2倍。利用融合蛋白n末端的his-tag，经金属螯合亲和层析纯化后，得到了纯度较高的融合酶蛋白，酶蛋白的得率为72％，比活为144.73u／mg。凝血酶切除his-tag后，经sds-page测定，重组蛋白的分子量为33±1kda，与理论计算值34kda相符。重组的二氯甲烷脱卤素酶在ph6.5，温度30℃有最大相对酶活。但重组的二氯甲烷脱卤素酶对温度和ph要敏感。最后，对重组菌的生长特性和降解特性的研究表明，重组菌在lb培养基中的生长特性与原始菌株没有差别，生长至对数期a600nm值都可达到2.4左右。重组菌株dcmr-1在25h的降解率达90％以上，降解效率比原降解菌株有明显提高。
抗霉素(antimycin)是一族多组分混合物，具有相同的九元环双内酯母核，但侧链结构不同，a3是最主要的组分。自20世纪40年代作为抗真菌活性物质被发现以来，抗霉素越来越引起人们的重视。由于其还具有抗癌、心脏保护、抑制线粒体呼吸等作用，抗霉素已成为生命科学研究的重要工具。为了提高抗霉素发酵水平，采用紫外线和氯化锂复合诱变处理，筛选到1株高产稳定的突变株no.1-095，并对该菌株进行发酵工艺优化，使抗霉素效价达到356mg/l，较原始菌株fim-041 14提高163.7％，同时进行了50升和1.5吨中试放大试验(效价分别为206mg/l和1 94mg/l)。建立高速逆流色谱分离纯化方法对抗霉素的混合组分进行分离纯化并采用电喷雾多级串联质谱分析抗霉素同系物的结构，确定15个组分为抗霉素类抗生素，并分离到antimycin a1、antimycin a2、antimycin a3、antimycin a4、antimycin a10单组份。在对抗霉素同系物进行研究的同时，发现一个非抗霉素同系物组分l1，其与抗霉素同系物在理化性质方面有所差异，需应用核磁共振碳谱和氢谱、x-单晶衍射等其他结构鉴定方法进行进一步结构解析，以确定该组分的化学结构。关键词：抗霉素 诱变育种
发酵 优化 高速逆流色谱
电喷雾电离质谱
hcb是12种典型持久性有机污染物(pops)之一，对人类健康和环境都有严重危害。
目的：通过厌氧细菌分离方法，对已从污染环境中筛选出的对hcb具有降解效果的厌氧菌群进行活化和分离，并研究探讨菌群的生长特性以及单菌株和混合菌株的降解特性。
方法：1) hcb厌氧降解菌的活化及分离。采用厌氧菌分离方法，对已有的混合菌群进行了活化和分离；2) 混和菌群培养条件的优化。运用三因素三水平正交试验设计的方法，研究该菌群的最佳生长条件；3) 单菌株、混和菌株降解hcb能力的比较。通过等体积比混合的方法对混和菌株进行了降解hcb能力的研究。
结果：经反复分离和纯化，得到了4株能以hcb为唯一碳源和能源生长的优势菌。菌群最佳生长条件为：温度30℃，ph值为7.0，hcb浓度为3mg·l-1，接种量0.2％。菌群不能适应以1,2,4,5-四氯苯和五氯酚钠为唯一碳源生长。单菌株在7天后的hcb降解率分别为分别为y1：65.9％，y2：49.6 ％，y3：75.3 ％， y4：73.8％。在11组菌株混和试验中，有10组降解率都在60％以上。
结论：本研究分离得到的4株单菌对hcb都有较好的降解能力，单株hcb平均降解率为66.2％，最高达到了75.3％。混合菌株的hcb平均降解率为：两株组合(63.9％)< 三株组合(67.3％)< 四株组合(71.7％)，菌株种类越多降解效果越好，而且降解效果比单一菌株的降解效果好。本研究成果将为进一步开发hcb治理的微生物资源和从污染源头进行预防治理hcb的工程应用研究奠定基础。
本实验通过生理生化性质和1 6S RDNA同源性鉴定了实验室保存的两株甲基对硫磷降解菌X-13、X-20，参与甲基对硫磷降解的酶属于磷酸酯酶，两株菌的酯酶活性都随菌液浓度的增加递增，且与菌株的生长曲线正相关。
初步预测降解菌可以将MP降解为对硝基苯酚。
气相色谱法测定X-20对甲基对硫磷的降解表明，实验中尝试多种质粒提取方法，在两株菌中都没有提取到质粒，初步 确定试验菌株可能不含有降解质粒，其降解基因可能存在于染色体上。
用PCR和鸟枪法筛选X-20降解基因，都没有得到目的片段；推测该菌编码甲基对硫磷降解的基因属于一种新型基因。
由于微囊藻毒素（microcystin，mc）具有强烈的肝毒性，因此mc在饮用水中的迁移转化规律已引起日益重视。微生物降解过程被认为是水体中mc归趋的主要途径之一，尽管国内外学者对mc的微生物降解方面进行了大量研究，但主要集中于mc的好氧微生物降解方面。由于自然水体中普遍存在着厌氧环境，那么厌氧降解过程很可能对mc的迁移转化产生重要影响，但是目前对于mc在厌氧条件下的降解过程却未见报道，也没有分离出mc兼性厌氧降解菌。因此本文首先考察了mclr在厌氧条件下的降解过程，然后从滇池沉积物中分离出2株mclr兼性厌氧降解菌，并对其中的1株进行了降解能力研究以及初步鉴定。具体内容及结果如下：
1.滇池沉积物菌群对微囊藻毒素的厌氧生物降解。
通过室内模拟实验，研究了滇池沉积物中混合菌群在厌氧条件下对mclr的降解能力，并考察了环境因素和外加营养源对该过程的影响。结果表明，厌氧条件下mclr2d内从5mg/l迅速降解到检测限以下，说明该菌群在厌氧条件下对mclr具有较强的降解能力，并且可以利用mclr作为唯一氮源。在实验温度范围内，mclr的降解速率随着温度的升高而增大。酸性条件下mclr的厌氧降解缓慢（ph=5.0）甚至停止（ph=3.0），而中性（ph=7.0）和碱性（ph为9.0、11.0）条件下降解速率没有显著差异。单独添加葡萄糖可以产生酸性物质而使体系的ph下降，从而抑制mclr的降解，但是同时添加硝酸盐可以消除这一影响。单独添加硝酸盐对mclr的厌氧降解也有显著的抑制作用，说明硝酸根在这一过程中未被mclr厌氧降解菌用作最终电子受体。这些结果表明，厌氧降解可能是沉积物中mclr转化的另一重要途径，该过程在mclr污染治理方面具有潜在的应用价值。
2.mclr兼性厌氧降解菌的分离纯化及降解能力研究。
通过三层平板分离法，从长期遭受蓝藻水华污染的滇池沉积物中分离得到2株能够以mclr作为氮源生长的兼性厌氧降解菌，其中菌株4w20在缺氧条件下6d内对mclr的降解率能达到80％以上，另外1株对mclr的降解率不到60％，因此选取降解能力较强的菌株4w20进行后续实验。
与缺氧条件相比，好氧条件下菌株4w20在6d内对mclr的降解率达100％，而厌氧条件下6d内对mclr的降解率为66.7％。说明该菌株在不同溶解氧条件下仍具有很强的降解能力，且溶解氧含量升高，菌株对mclr的降解能力增强。
3.mclr兼性厌氧降解菌的初步鉴定和保存。
通过考察mclr兼性厌氧降解菌的形态特征和生理生化特性对菌株进行初步鉴定。在好氧条件下菌株4w20的菌落形态为圆形，乳白色（偏淡黄色），直径约1～1.5mm，边缘紧缩，表面光滑、湿润，半透明。在缺氧条件下生长的过程中伴随着菌落形态的变化，生长初期均为圆形，乳白色，直径0.5～0.8mm，边缘紧缩。生长末期为近似圆形，乳白色，直径1.5mm，边缘出现小锯齿状。该降解菌为不运动的革兰氏阴性杆菌，属于兼性厌氧菌，大小为0.5μm×2μm，无荚膜，无芽孢。通过生理生化鉴定试验可知，该降解菌均能利用葡萄糖和甘露糖产酸，mr、vp反应和尿素酶检测呈阳性，能利用丙二酸盐，具有过氧化氢酶和半乳糖苷酶，不水解淀粉和纤维素，明胶液化和苯丙氨酸脱氢酶呈阴性，不产生硫化氢，不能在氰化钾培养基上生长。通过以上形态学和生理生化特性，初步鉴定mclr兼性厌氧降解菌4w20属于水拉恩氏菌属（rahnellaaquatilis）。
通过对比液体石蜡保存法、甘油—生理盐水保存法、低温甘油保存法、甘油菌液对半保存法和蒸馏水保存法这5种方法的优劣发现，甘油菌液对半保存法既能使菌株保持原始性状，又能保证菌株具有很强的降解活性。所以最终选择甘油菌液对半保存法作为mclr兼性厌氧降解菌的保存方法。
对羟基苯甲酸是土壤中的主要化感物质之一。本研究以对羟基苯甲酸为唯一碳源的培养液，从含对羟基苯甲酸较高的竹林土壤中筛选、分离和纯化了一株高效降解对羟基苯甲酸菌；测定了它在不同环境条件下的生长情况，分析了其对羟基苯甲酸的降解能力以及对其它几种酚类化感物质的降解特性，为进一步研究微生物修复对羟基苯甲酸污染的土壤提供了参考依据。
从竹林土壤中分离和纯化的菌株，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养24h，其菌落为乳白色，圆形，隆起，不透明，表面光滑，湿润，边缘整齐；液体培养菌液浑浊且有少量沉淀。菌体形态为圆形或椭圆形，革兰氏染色阴性，无运动性，无鞭毛。
生理生化特性检测结果表明，菌株的硝酸盐还原试验阳性，尿素分解试验阳性，淀粉水解试验阴性，在37℃条件下能生长，不能发酵半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、蜜二糖、乳糖、纤维二糖、松三糖、棉籽糖和甘露糖，可以利用葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、甘露醇和乙醇作为碳源，不能分解棉籽糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖、山梨糖、肌醇和麦芽糖。结合18s rdna序列分析的结果，初步鉴定该菌株为粘红酵母菌(rhodotorula glutinis)。
菌株在20～40℃生长良好，最适生长温度为30℃；ph4.0～6.0范围不能生长，ph7.0范围生长情况良好，最适生长ph为7.0；连续光照和连续黑暗培养条件下对菌的生长无显著差异；采用深层琼脂法观察氧气对菌的生长影响，结果表明，菌只能在琼脂深层培养基表面生长，属于需氧型菌，适宜摇床培养。
用hplc方法检测了菌株对不同浓度的对羟基苯甲酸的降解能力，结果表明，菌株在72h能将0.5g/l对羟基苯甲酸彻底降解，对1g/l对羟基苯甲酸有较强的降解能力。菌株还能有效地降解阿魏酸、对香豆酸和对羟基苯甲醛酚类化感物质。在处理1g/l对香豆酸48h可以降解65％，对0.5g/l阿魏酸和对羟基苯甲醛48h降解达90％以上。
共11条数据
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